李曉玲，程歲寒，楊 進(jìn)

(1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心(三峽大學(xué))，湖北 宜昌 443002)

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續(xù)斷屬植物SRAP標(biāo)記的遺傳親緣關(guān)系分析

李曉玲1,2，程歲寒1,2，楊 進(jìn)1*

(1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心(三峽大學(xué))，湖北 宜昌 443002)

本文采用10 對(duì)SRAP引物，對(duì)10 份續(xù)斷屬植物樣本進(jìn)行遺傳親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明，10 對(duì)引物共擴(kuò)出566條譜帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出 56.6 條帶，片段大小為150～2000 bp，其中多態(tài)性條帶為362條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為 36.2 條，平均多態(tài)性條帶百分率為 64 %，結(jié)果表明續(xù)斷屬植物具有豐富的遺傳變異。UPGMA聚類分析表明10 份續(xù)斷屬植物分為2個(gè)大類和4個(gè)亞類，大頭續(xù)斷和深紫續(xù)斷有一定的親緣關(guān)系，與其它續(xù)斷屬植物間遺傳差異較大；日本續(xù)斷、恩施續(xù)斷、大理續(xù)斷和川續(xù)斷遺傳親緣關(guān)系較近，其中大理續(xù)斷和川續(xù)斷聚為一個(gè)小類群，支持大理續(xù)斷并入川續(xù)斷。

續(xù)斷屬植物；SRAP；遺傳親緣關(guān)系

續(xù)斷屬(DipsacusL.)植物種類較多、資源較豐富，是川續(xù)斷科(Dipsacaceae) 的一個(gè)屬，常見于長(zhǎng)江以南各省區(qū)，湖北西部和四川東部分布較多，甘肅和陜西南部也有少量分布，為傳統(tǒng)中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]。中藥續(xù)斷的原植物主要是川續(xù)斷(DipsacusasperoidesC.Y.Cheng et T.M.Ai)，深紫續(xù)斷也少量進(jìn)入中藥續(xù)斷中；本屬主要以根或果實(shí)入藥，含有三萜皂甙、黃酮甙、環(huán)烯醚萜甙、甾醇及糖類等化學(xué)成分；用于治療肝腎不足，風(fēng)濕痹痛，腰膝酸軟，筋傷骨折，跌撲損傷，崩漏，胎漏[2-3]。我國(guó)川續(xù)斷科共6屬40余種，藥用的有5屬18種4變種，其中續(xù)斷屬共18種(包括2變種)，9種2變種可作藥用[3-4]。長(zhǎng)期以來，在續(xù)斷進(jìn)入藥典的分類及種間遺傳親緣關(guān)系分析中，存在著較多的爭(zhēng)議[5-6]。我國(guó)續(xù)斷屬17種2變種植物花粉的光學(xué)顯微鏡和電鏡掃描的結(jié)果表明該屬花粉為近球形，種間差異較小，該屬植物為一自然分類群[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行分類和遺傳親緣關(guān)系分析成為一種重要的方法。但目前國(guó)內(nèi)續(xù)斷屬植物分子水平的研究比較少。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Suquence-related amplified polymorphism，SRAP)是最早用于蕓苔屬植物中的一種基于PCR反應(yīng)的分子標(biāo)記技術(shù)[8]。原理是針對(duì)基因啟動(dòng)子、內(nèi)含子中GC少AT多，而外顯子中GC含量多的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)引物對(duì)開放讀碼框(ORFs)進(jìn)行擴(kuò)增，因內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度在不同個(gè)體中的差異從而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、高效、產(chǎn)率高、穩(wěn)定、成本低、高共顯性、在基因組中分布均勻的特點(diǎn)，目前主要用于遺傳多樣性分析[9]、比較基因組學(xué)[10]、遺傳作圖[11]等方面的研究。本研究將采用10 對(duì)SRAP引物對(duì)10份續(xù)斷屬植物進(jìn)行分子鑒定和親緣關(guān)系分析，為研究續(xù)斷屬植物從分子水平上進(jìn)行分類提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)材料主要采自云南、重慶、湖北和四川。將新鮮葉片自生長(zhǎng)地采集后，放入裝有硅膠的自封袋中，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室置于-70 ℃ 超低溫冰箱中保存，其材料名稱及來源見表1。反應(yīng)中Taq酶、MgCl2、10×PCR Buffer、dNTPs等均購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。SRAP優(yōu)化體系材料采自湖北恩施土家族自治州大山頂牛角坪，引物為Me8-Em3。SRAP引物信息見表2，引物購(gòu)自北京三博志遠(yuǎn)生物工程有限公司。

表1 材料名稱及來源

表2 用于SRAP分析的引物信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取續(xù)斷屬植物幼嫩葉片，采用略作改動(dòng)的Doyle and Doyle[12]的常規(guī) CTAB法提取基因組DNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA的濃度和純度(260 nm/280 nm)，并稀釋至20 ng·μl-1儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選及SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng) 按照Li和 Quiros[13]提出的原則設(shè)計(jì)了100對(duì)SRAP引物，由北京三博志遠(yuǎn)生物工程有限公司合成，表2為10對(duì)篩選的多態(tài)性較高的引物組合。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf-PTC100 TM型 PCR 儀上進(jìn)行，20 μl體系中含有dNTPs濃度為 0.25 mmol·L-1、引物濃度 0.3 μmol·L-1、Mg2+濃度 1.0 mmol·L-1、1 UTaq酶、1×PCR buffer、40 ng 模板DNA。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 預(yù)變性 1 min，94 ℃ 變性 1 min，33 ℃ 復(fù)性 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性 1 min，52 ℃ 復(fù)性 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min；最后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在6 %聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染法檢測(cè)[14]。

1.2.3 SRAP標(biāo)記數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，在相同遷移率位置上進(jìn)行 “ 1、0” 標(biāo)注，有DNA條帶的記為1，沒有DNA條帶的記為0。在NTSYS-PC 2.10軟件中，根據(jù)SM相似系數(shù)法求得各樣品間的遺傳相似性矩陣，再用非加權(quán)算術(shù)平均聚類(UPGMA)方法進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP標(biāo)記的多態(tài)性

對(duì)100對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行多態(tài)性篩選，采用得到的多態(tài)性較高的10對(duì)SRAP引物組合對(duì)10份續(xù)斷樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)出566條譜帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出 56.6 條帶，片段大小為150～2000 bp，其中多態(tài)性條帶為362條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為 36.2條，平均多態(tài)性條帶百分率為 64 %。結(jié)果表明續(xù)斷屬植物具有豐富的遺傳變異。

2.2 UPGMA 聚類分析

采用NTSYS-PC 2.10軟件對(duì)0/1矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行續(xù)斷屬植物各樣品間的遺傳距離和相似系數(shù)分析，結(jié)果見表3。10份續(xù)斷材料兩兩之間的遺傳相似度相對(duì)較高，變化范圍為0.6460[DL(W)與SZ]～0.8956[DL(H)與DL(WS)]，平均遺傳相似度為0.764944；遺傳距離在0.1044[DL(H)與DL(WS)]～0.3540[DL(W)與SZ]之間，平均遺傳距離為0.235056。其中相似性最大的為2種大理續(xù)斷DL(H)與DL(WS)，相似系數(shù)為0.8956，說明這兩份續(xù)斷親緣關(guān)系很近，大理海東中藥材種植基地續(xù)斷種植成功。DL(W)-大理續(xù)斷(云南麗江文筆山)與SZ-深紫續(xù)斷(重慶南山金佛山古佛洞藥池壩)相似性最小為0.6460，遺傳距離則相反。4個(gè)不同產(chǎn)地的大理續(xù)斷遺傳距離在0.1044[DL(H)與DL(WS)]～0.1788[DL(W)與DL(H)]之間，平均遺傳距離為0.1540。2個(gè)不同產(chǎn)地的川續(xù)斷間的遺傳距離為0.1487。根據(jù)NTSYS計(jì)算得出的遺傳距離，用該軟件進(jìn)行聚類得到樹狀聚類圖(圖1)。

聚類圖表明，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.68時(shí)，10個(gè)續(xù)斷樣品分成了2個(gè)類群：DL-大理續(xù)斷、ES-恩施續(xù)斷、C(J)-川續(xù)斷和RB-日本續(xù)斷聚為一大類(Group)；DT-大頭續(xù)斷和SZ-深紫續(xù)斷聚為另一大類。當(dāng)相似系數(shù)為0.79時(shí)，又分成了4個(gè)亞類群(Subgroup)：第1亞類包括DL(L)、DL(W)、DL(H)、DL(WS)、C(D)和RB，4個(gè)品系的大理續(xù)斷聚在一起，表明它們之間遺傳親緣關(guān)系比較近，基因交流比較頻繁，但它們與RB(日本續(xù)斷)和C(D)(川續(xù)斷)也聚在一起，表明大理續(xù)斷和日本續(xù)斷以及川續(xù)斷遺傳親緣關(guān)系比較近，有一定的基因交流；第2亞類包括ES(恩施續(xù)斷)與C(J)(川續(xù)斷)，表明恩施續(xù)斷與川續(xù)斷親緣關(guān)系較近；DT(大頭續(xù)斷)和SZ(深紫續(xù)斷)各聚成第3和4大亞類，這表明大頭續(xù)斷和深紫續(xù)斷兩者親緣關(guān)系也比較遠(yuǎn)，與大理續(xù)斷、恩施續(xù)斷以及日本續(xù)斷親緣關(guān)系也比較遠(yuǎn)，基因交流比較少。

表3 10份續(xù)斷屬植物間的遺傳距離(D)(右上角)和相似系數(shù)(I)(左下角)

圖1 10份續(xù)斷屬植物的UPGMA聚類圖Fig.1 Dendrogram for ten accessions of Dipsacus by ISSR data using UPGMA method

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)多用形態(tài)學(xué)研究的方法對(duì)續(xù)斷屬植物進(jìn)行了分類。但同一種植物在不同的環(huán)境條件下可能會(huì)發(fā)育出不同的形態(tài)或生理特征；形態(tài)接近，也可能是不同的基因型。分子標(biāo)記則不受環(huán)境的影響，從植物的基因組出發(fā)，探討其遺傳多樣性及遺傳親緣關(guān)系。艾鐵民等對(duì)報(bào)道我國(guó)續(xù)斷屬植物共有18種(2栽培種)，其中可供藥用的有9種(包括2個(gè)栽培種)[4]。艾強(qiáng)等對(duì)四川貴州產(chǎn)地的川續(xù)斷進(jìn)行SRAP遺傳分析，表明川續(xù)斷居群的遺傳多樣性水平豐富，遺傳變異主要存在居群內(nèi)，居群遺傳多樣性主要受地理位置(海拔)和氣候因素影響[15]。

本研究采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來自湖北西部、重慶及云南大理和麗江等地的10份續(xù)斷屬植物的親緣關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明，采用篩選得到的多態(tài)性較高的10對(duì)SRAP引物組合對(duì)10份續(xù)斷樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)出566條譜帶，其中多態(tài)性條帶為362條，平均多態(tài)性條 帶百分率為64 %，結(jié)果表明該物種具有豐富的遺傳變異。UPGMA聚類分析表明10個(gè)續(xù)斷屬植物分為2個(gè)大類和4個(gè)亞類，大頭續(xù)斷和深紫續(xù)斷有一定的基因交流，有一定的親緣關(guān)系，聚為一大類，與其它續(xù)斷屬植物間遺傳差異較大；日本續(xù)斷、恩施續(xù)斷、大理續(xù)斷和川續(xù)斷的基因交流比較頻繁，遺傳親緣關(guān)系較近，聚為另一大類，這與形態(tài)學(xué)分類基本一致[7]。供試的4個(gè)大理續(xù)斷品系遺傳親緣關(guān)系較近，栽培種[DL(H)]與其他3個(gè)野生種遺傳距離很近(0.1044～0.1788)，表明大理續(xù)斷的人工栽培比較成功，未對(duì)其遺傳特性造成改變。筆者之前曾利用ISSR標(biāo)記對(duì)同樣的材料進(jìn)行了遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析[16]，與本研究結(jié)果基本一致，ISSR和SRAP標(biāo)記對(duì)續(xù)斷材料遺傳多樣性的分析結(jié)果呈極顯著相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)r=0.909(P<0.01)，說明采用這2種分子標(biāo)記對(duì)續(xù)斷種質(zhì)材料的遺傳多樣性分析具有較高的一致性和可信度。但SRAP標(biāo)記的多態(tài)性小，遺傳距離也有一定差異，表現(xiàn)在日本續(xù)斷、恩施續(xù)斷、川續(xù)斷及大理續(xù)斷遺傳進(jìn)化上，出現(xiàn)這種差異的原因可能是由于2種標(biāo)記選取不同的引物及不同的擴(kuò)增原理引起。ISSR標(biāo)記是對(duì)兩側(cè)具有反向排列的SSR的一段DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，而SRAP標(biāo)記則對(duì)內(nèi)含子外顯子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增造成的，而且引物數(shù)量越多，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)也會(huì)隨之增加，最終會(huì)使遺傳距離發(fā)生變化[17-20]。馮學(xué)峰等[7]在對(duì)17種續(xù)斷屬植物的花粉的研究中發(fā)現(xiàn)大理續(xù)斷和川續(xù)斷的花粉形態(tài)相似，表明兩者遺傳親緣關(guān)系比較近。目前也有人認(rèn)為在續(xù)斷屬中沒有大理續(xù)斷和川續(xù)斷的區(qū)別，它們都應(yīng)該統(tǒng)稱為川續(xù)斷[21-22]。在本研究中結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，川續(xù)斷和大理續(xù)斷同分為一個(gè)小類群，這從一定程度上支持了該觀點(diǎn)，支持大理續(xù)斷并入川續(xù)斷，但仍需進(jìn)行進(jìn)一步研究如基因序列的測(cè)定來確定此觀點(diǎn)的正確性。

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(責(zé)任編輯 李山云)

Genetic Relations Analysis inDipsacusPlant Based on SRAP

LI Xiao-ling1,2, CHENG Sui-han1,2, YANG Jin1*

(1.College of Life Science and Pharmacy, Three Gorges University, Hubei Yichang 443002, China; 2.Engineering Research Center of Eco-environment in Three Gorges Reservoir, Ministry of Education, China Three Gorges University, Hubei Yichang 443002, China)

10 SRAP primer pairs were used to analyze the genetic relationship of 10Dipsacusmaterials. The results showed that 10 primer pairs produced 566 bands with average 56.6 bands by each primer, of which 362 bands were polymorphisms with average 36.2 bands, accounting for 64 %, and the length were 150-2000 bp, which indicated thatDipsacusplant had abundant genetic variation. According to the UPGMA cluster analysis, the ten pieces ofDipsacuscould be gathered into 2 big groups or 4 subgroups, DT and SZ were distance from any other accessions, and the genetic relationship between them was very close; DL, ES, RB, C(J) and C(D) had close relationships between them, and C(J) and C(D) belonged to the same subgroup, which supported thatD.daliensisT.M.Ai. Belonged toD.asperoidesC.Y.Cheng et T.M.Ai .

Dipsacusplant; SRAP; Genetic relation

1001-4829(2016)07-1554-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.010

2015-04-28

湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金“天然產(chǎn)物研究與利用”(2008NP09)

李曉玲(1973-)，女，博士，副教授，主要從事三峽庫(kù)區(qū)珍稀瀕危植物保護(hù)的研究與利用，E-mail:lixiaolinggz@126.com，*為通訊作者。

S567.23

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