慕春歌

(魯東大學(xué)資產(chǎn)處，山東煙臺 264025)

?

珊瑚菜葉綠體基因TrnV-M序列的PCR擴(kuò)增與分析

慕春歌

(魯東大學(xué)資產(chǎn)處，山東煙臺 264025)

[目的]對珊瑚菜TrnV-M基因片段PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化和測序分析，為瀕危物種珊瑚菜的種質(zhì)資源保護(hù)和遺傳多樣性研究提供理論依據(jù)。[方法]探索并優(yōu)化珊瑚菜葉綠體基因片段TrnV-M的PCR擴(kuò)增條件，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。[結(jié)果]珊瑚菜TrnV-M基因片段的PCR最佳反應(yīng)體系：dNTPs 0.50 μL，Buffer 2.50 μL，TrnM1.25 μL，TrnV1.25 μL，DNA 1.00 μL，rTaqE 0.15 μL，ddH2O 18.35 μL，總體積25.00 μL。最佳擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3.0 min；94 ℃變性50 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 25 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。[結(jié)論]在最優(yōu)體系下獲得了清晰、穩(wěn)定的目的條帶，校正后條帶長度約為757 bp，通過 GenBank 的 BLAST 比對，確定為TrnV-M基因片段。

珊瑚菜；TrnV-M；PCR擴(kuò)增；最佳反應(yīng)體系

單種屬植物珊瑚菜(GlehnialittoralisF.Schmidt ex Miq.)為傘形科(Umbelliferae)珊瑚菜屬(Glehnia)多年生草本植物，主要分布在東亞地區(qū)的中國、韓國、日本3個國家海岸線區(qū)域的沙灘以及北美地區(qū)的美國近海沙灘，在我國主要分布在遼寧、山東、江蘇、浙江、臺灣、福建、廣東和海南島沿海海岸[1]。珊瑚菜耐鹽堿，生活環(huán)境以海濱沙灘為主，松軟的砂質(zhì)土壤為其膨大的根部發(fā)育提供了保證，其根用作鎮(zhèn)咳祛痰藥，為我國應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥材[2-5]。另外，珊瑚菜扎入深層土壤的根系對于海岸固沙和鹽堿土的改良具有重要意義。近年來，隨著海濱開發(fā)力度的增加，珊瑚菜原始生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，野生資源急劇減少，分布面積越來越窄；同時，人為采挖也加大了珊瑚菜野生居群的急劇減少，造成了珊瑚菜很多原產(chǎn)地的消失。目前該物種已被列為國家Ⅱ級重點保護(hù)野生植物[6]，被稱為植物界的“大熊貓”。

植物遺傳多樣性評估是研究瀕危物種保護(hù)機(jī)制的重要手段。近幾年，利用分子手段研究珊瑚菜遺傳多樣性的報道很多，大多采用等位酶、SRAP、ISSR等分子標(biāo)記法[7-9]，采用葉綠體基因序列進(jìn)行標(biāo)記的研究較少。葉綠體基因組DNA由于其屬于單系遺傳，不受網(wǎng)狀進(jìn)化、雜交等因素的影響，且具有進(jìn)化速率較快、相對保守等特點，一直作為良好的分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于物種進(jìn)化和遺傳多樣性的研究[10-11]。葉綠體基因片段TrnV-M作為其中的一員近年來也被用于物種進(jìn)化的研究，如利用基因片段對肉蓯蓉屬系統(tǒng)位置的研究[12-13]和高山植物偏花報春居群遺傳多樣性方面的研究[14-15]。筆者對珊瑚菜TrnV-M基因片段PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化和測序分析，旨在為珊瑚菜物種遺傳多樣性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗所用珊瑚菜葉片均為野外采集并用硅膠干燥保存。

1.2 試劑 50 mol/L Tris-HCl(pH 8)、10 mmol/L EDTA(pH 8)、0.7 mol/L NaCl、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、40 mmol/L β-巰基乙醇、氯仿∶異戊醇(24∶1)、無水乙醇、75%(V/V)乙醇、異丙醇、溴化乙錠(EB)、瓊脂糖、0.5×TBE等。TaqDNA聚合酶(TaKaRa 公司)、10×PCR緩沖液、MgCl2、DMSO、dNTP混合物、PCR擴(kuò)增引物、DL 2000 DNA Marker、Loading buffer、膠回收試劑盒(上海生物工程有限公司)，雙蒸水。

1.3 器材 恒溫水浴鍋、PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD)、電泳儀、電泳槽、電子天平、制冰機(jī)、恒溫?fù)u床、高壓滅菌鍋、臺式離心機(jī)、凝膠成像儀、微量移液器、研缽、解剖刀、一次性手套、0.5、1.5、2.0 mL 離心管、Tip頭、PCR小管、電冰箱、吸水紙、微波爐、錐形瓶等。

1.4 方法

1.4.1 總DNA的提取與檢測。采用改進(jìn)的CTAB法[16-17]提取珊瑚菜基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(EB濃度為0.5 mg/mL)，用凝膠成像儀進(jìn)行條帶觀測，根據(jù)條帶亮度和有無拖尾情況，粗略估計該樣品DNA的質(zhì)量和濃度。將檢測合格的DNA(濃度較大的DNA用超純水稀釋至約20 ng/μL)，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.4.2TrnV-M基因片段的擴(kuò)增及檢測。以TrnV-M-F(CCTGTAGGYTGNGCNCCYTT)、TrnV-M-R(AAACGATGTGGNAGNAARCA)為引物，在25.00 μL 反應(yīng)體系中(dNTPs 0.50 μL，Buffer 2.50 μL，TrnM1.25 μL，TrnV1.25 μL，DNA 1.00 μL，rTaqE 0.15 μL，ddH2O 18.35 μL)，通過不同退火溫度(48、50、52、54、56、58、60 ℃)的擴(kuò)增程序，確定最適擴(kuò)增程序。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在全自動數(shù)碼凝膠成像儀上進(jìn)行觀察并拍照，其余產(chǎn)物置于4 ℃冰箱保存。

1.4.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化與測序。 將成功擴(kuò)增的條帶進(jìn)行割膠純化，純化試劑盒購自上海生物工程有限公司，純化步驟參考試劑說明書。將 PCR 純化產(chǎn)物送青島華大基因公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交GenBank(GenBank號正在申請中)，然后采用 BLAST功能在 GenBank 中進(jìn)行同源性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果 采用CTAB法提取的基因組DNA純化后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，且純度較高，可作為PCR反應(yīng)的模板(圖1)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，58 ℃下可見清晰條帶，其他條件不能獲得目的基因片段，因此，確定最適擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性30 min；94 ℃變性50 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 25 s,38次循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

圖2 58 ℃退火溫度下PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2 PCR electrophoretogram under 58 ℃annealing temperature

2.3 PCR產(chǎn)物純化和測序結(jié)果 取純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可知，電泳條帶清晰，無雜帶，純化效果良好，純化產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行測序，獲得基因序列長度校正后約為757 bp，通過 GenBank 的 BLAST 比對，確定為TrnV-M基因片段。

圖3 PCR產(chǎn)物純化電泳圖譜Fig.3 Electrophoretogram of PCR purified product

3 討論

TrnV-M基因片段擴(kuò)增成功的第一步是高質(zhì)量基因組DNA的獲得，適宜的 PCR 條件也是成功擴(kuò)增必不可少的。該研究采用改進(jìn)的 CTAB 法提取珊瑚菜基因組DNA，以TrnV-M-F、TrnV-M-R為引物，利用珊瑚菜基因組 DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過單因素試驗研究2對引物的 PCR 擴(kuò)增條件，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，最后送至基因公司測序，通過核酸序列比對確定擴(kuò)增結(jié)果的可靠性。影響 PCR 擴(kuò)增效果的因素較多，主要有模板 DNA質(zhì)量、引物的種類與用量、 DNA 聚合酶、 Mg2+、 dNTPs、退火溫度等。模板 DNA質(zhì)量直接影響擴(kuò)增條帶的純度；引物和DNA 聚合酶濃度影響擴(kuò)增體系的特異性；Mg2+影響PCR的多個方面，Mg2+濃度過高會引起非特異性擴(kuò)增，而濃度過低會降低Taq酶活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少；dNTPs是 PCR 反應(yīng)的原料，濃度過低會降低PCR產(chǎn)物產(chǎn)量，導(dǎo)致擴(kuò)增條帶模糊不清；濃度過高錯配率大大增加，且能與Taq酶競爭Mg2+，使體系中游離的Mg2+濃度降低，進(jìn)而影響擴(kuò)增效果；退火溫度則是PCR反應(yīng)體系的最后關(guān)口，溫度過高使得引物不容易退火，降低PCR產(chǎn)物產(chǎn)量；溫度過低會導(dǎo)致錯配概率加大。以上各因素并非單獨作用而是共同影響PCR體系擴(kuò)增效果，合理搭配可獲得良好擴(kuò)增效果。

在最優(yōu)體系的構(gòu)建過程中，傳統(tǒng)上是通過設(shè)定單因素試驗進(jìn)行梯度篩選，近年來又發(fā)展了正交設(shè)計試驗和均勻設(shè)計試驗。由于影響因素很多，逐級篩選需要多次試驗才能完成，往往需要大量人力物力。因此，如何盡快地找到最佳擴(kuò)增條件也是提高試驗效率的一個重要步驟?？紤]到PCR 擴(kuò)增體系中各成分的含量允許在一定范圍內(nèi)浮動，且試劑公司提供各試劑適用濃度范圍，構(gòu)建適合于大部分?jǐn)U增條件的基本體系相對容易，在此基礎(chǔ)上，僅需要通過改變退火溫度這一個因素進(jìn)行優(yōu)化即可得到成功擴(kuò)增的條件，該研究根據(jù)以上優(yōu)化原則，高效快速地建立了珊瑚菜TrnV-M基因片段的擴(kuò)增條件。最佳擴(kuò)增體系：dNTPs 0.50 μL，Buffer 2.50 μL，TrnM1.25 μL，TrnV1.25 μL，DNA 1.00 μL，rTaqE 0.15 μL，ddH2O 18.35 μL，總體積25.00 μL；最適退火溫度為58 ℃。

4 結(jié)論

該研究通過經(jīng)驗估計和退火溫度梯度設(shè)計，簡便快速地建立了珊瑚菜TrnV-M基因片段的最佳擴(kuò)增條件，為珊瑚菜的系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)，還可為今后珊瑚菜親緣物種甚至其他物種該基因的獲得提供參考。該方法的優(yōu)點是高效、簡便、快捷，具有較強(qiáng)的實用價值；其缺點是需要豐富的經(jīng)驗來預(yù)估相關(guān)影響因素的最適濃度，具有一定的主觀性和不確定性，在對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物要求較高的研究中，有必要對相關(guān)因素進(jìn)行一定濃度梯度篩選。參考文獻(xiàn)

[1] 單人驊，佘孟蘭.中國植物志：第55卷第3分冊[M].北京：科學(xué)出版社，1992：77-79.

[2] 裴鑒，周太炎．中國藥用植物志(第八卷)[J].北京：科學(xué)出版社，1965．

[3] 中華人民共和國藥典委員會，中華人民共和國藥典：1990年版(1部)[M].廣州：廣東科技出版社，1993.

[4] 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所．中藥志(第一卷)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1979.

[5] 方新德，孔忠 鳴，應(yīng)文斌，等.北沙參多糖成分的研究[J].中成藥，1987(8)：25-27.

[6] 傅立國.中國植物紅皮書：稀有瀕危植物(一)[M].北京：科學(xué)出版社，1991，9.

[7] 王愛蘭，王貴琳，李維衛(wèi)，等.瀕危物種珊瑚菜遺傳多樣性的ISSR分析[J].西北植物學(xué)報，2015，35(8)：1541-1546.

[8] MAN K H，CHOI J S，HONG W H，et al.Genetic diversity and population structure ofGlehnialittoralis(umbelliferae)in Korea[J].Oriental physiology & pathology，2003，17(6)：1519-1523.

[9] 惠紅，劉啟新，劉夢華.中國沿海中部珊瑚菜居群等位酶變異及其遺傳多樣性[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報，2001，10(3)：1-6.

[10] 黃瑤，李朝鑾，馬誠，等．葉綠體DNA及其在植物系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]．植物學(xué)通報，1994，11(2)：11-25．

[11] 盧孟柱，謝紅麗，張輝，等．利用葉綠體DNA變異研究胡楊系統(tǒng)發(fā)育[J]．西北植物學(xué)報，2000，20(6)：1148-1154．

[12] 李汐，祝銘，孫延霞，等.基于葉綠體rps16基因和核基因ITS片段研究肉蓯蓉屬系統(tǒng)位置[J].植物科學(xué)學(xué)報，2012，30(5)：431-436.

[13] OXELMAN B，LIDéN M，BERGLUND D.Chloroplast rps-16 intron phylogeny of the tribe sileneae(Caryophyllaceae)[J].Plant systematics and evolution，1997，206(1)：393-410.

[14] 王鳳英，龔洵，胡啟明，等.基于葉綠體DNA變異研究高山植物偏花報春的種內(nèi)譜系地理結(jié)構(gòu)[J].植物分類學(xué)報，2008，46(1)：13-22.

[15] 陳仁芳，張澤，唐洲，等.桑屬IIS，Trnl-F，rps16序列與進(jìn)化分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(8)：1553-1561.

[16] DOYLE J J，DOYLE J L.A rapid DNA isolation procedure for small amounts of fresh leaf tissue[J].Phytochem bull，1987，19(1)：11-15.

[17] TABERLET P，GIELLY L，PAUTOU G，et al.Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA[J]．Plant molecular biology，1991，17：1105-1109．

PCR Amplication and Analysis ofGlehnialittoralisUsingTrnV-MGene Fragments

MU Chun-ge

(Asset Department of Ludong University,Yantai, Shandong 264025)

[Objective] The aim was study PCR amplication and analysis ofGlehnialittoralisusingTrnV-Mgene fragments, to provide a technical basis for germplasm resources protection and genetic diversity study ofGlehnialittoralis. [Methods] The PCR amplification conditions forTrnV-Mgene fragments ofGlehnialittoraliswere explored and optimized, and the PCR products were sequenced. [Result] The optimized PCR system was acquired as follows: dNTPs 0.50 μL, Buffer 2.5 μL,TrnM1.25 μL,TrnV1.25 μL, DNA 1.00 μL, rTaqE 0.15 μL, ddH2O 18.35 μL，the total volume was 25 μL. The optimized thermal cycling profile was as follows: initial template denaturation at 94 ℃ for 3 min, 94 ℃ for 50 s, 58 ℃ for 45 s, and 72 ℃ for 1 min 25 s, followed by 38 cycles, with a final extension of 72 ℃ for 8 min. [Conclusion] The total alignment ofTrnV-Msequences was 757 bp in length after sorting by hand.

Glehnialittoralis；TrnV-Mgene fragments; PCR amplification; Optimized PCR system

山東省自然科學(xué)基金面上項目(ZR2010CM056)。

慕春歌(1971- )，男，山東棲霞人，實驗師，從事植物學(xué)方面的研究。

2016-10-28

S 188+.1；Q 789

A

0517-6611(2016)33-0135-02