李建鳳， 鐘夢莉， 廖立敏*

(1.內江師范學院 化學化工學院， 四川 內江 641100；2.“果類廢棄物資源化”四川省高等學校重點實驗室， 四川 內江 641100)

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響應面滿意度函數(shù)用于金銀花多糖提取研究

李建鳳1，2， 鐘夢莉1， 廖立敏1，2*

(1.內江師范學院 化學化工學院， 四川 內江 641100；2.“果類廢棄物資源化”四川省高等學校重點實驗室， 四川 內江 641100)

以金銀花為試驗原料，通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化了酶法提取金銀花多糖工藝，考察了酶用量、提取溫度、液料比、提取時間對提取率的影響.結果表明，當酶用量為0.3%、提取溫度為55℃、液料比為40 mL/g、提取時間為40 min時，金銀花多糖提取率可達6.67%，且試驗的重現(xiàn)性好，對于金銀花等植物多糖的提取研究具有一定的參考價值.

金銀花； 多糖； 響應面法； 提取

在中國古代人們把金銀花稱為“忍冬”[1]，金銀花生長在中國、朝鮮、日本及北美洲地區(qū).中國的金銀花主要產(chǎn)于廣東、湖南、河北、陜西、山東、湖北、河南等地區(qū).金銀花在中國歷史的長河中流淌了上千年歲月，金銀花在醫(yī)藥方面主要用于解熱消炎、保肝利膽、抑菌、抗病毒、降血脂、止血、抗氧化[2]等.通過在近現(xiàn)代人們對金銀花的研究使得金銀花不僅在醫(yī)藥上應用廣泛，而且在保健食品和化妝品上也有廣闊的應用空間[3].金銀花中含有機酸[4]、黃酮[5]、多糖[6-8]等諸多活性成分.葉琳[6]、何俊婷[7]等采用水浸提法，趙鵬等[8]采用超聲波法提取了金銀花多糖.水浸提法通常耗時長，提取率不高；超聲波提取法較水浸提法節(jié)省提取時間，提取率也有所提高，但提取過程中產(chǎn)生刺耳的噪聲對實驗操作者帶來一定的影響.而酶法[9-12]提取條件溫和、耗時短、提取率高，易于實現(xiàn)工業(yè)化.本文采用纖維素酶解法提取金銀花多糖，采用苯酚-硫酸法[13]測定提取液中金銀花多糖含量.響應面法[4，6]是常用的試驗設計方法，本文采用響應面法優(yōu)化金銀花多糖的提取，以期得到優(yōu)良的提取工藝，為開發(fā)利用金銀花多糖提供參考.

1試驗

1.1試劑、原料及儀器

濃硫酸、苯酚，成都金山化學試劑有限公司；D-Glucose 500 g葡萄糖(分析純A.R.)、纖維素酶(5萬u/g)，成都市科龍化工試劑廠；金銀花(生產(chǎn)批號：20140703)，湖南省博世康中醫(yī)藥股份有限公司.HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，科學儀器儀表(鎮(zhèn)江)有限公司；CP2202S 電子分析天枰，賽特利斯(北京)有限公司；UV-mini-1240紫外可見分光廣度計，島津制作所.

1.2試驗方法

1.2.1多糖的提取 先將金銀花樣品粉碎，接著稱1.000 g金銀花粉末于100 mL錐形瓶中.加一定體積蒸餾水完全浸沒，使用玻璃棒攪拌，再加適量的纖維素酶，在一定溫度下，提取一定時間后，離心10 min，過濾抽干得提取液，最后用蒸餾水定容至50 mL得待測溶液.

1.2.2粗多糖的測定 使用苯酚-硫酸法測量離心后上清液中粗多糖的含量，根據(jù)文獻[13]配制葡萄糖標準溶液、5%苯酚溶液并制作標準曲線.得到標準曲線方程為：Y=1.005X-0.1208，R2=0.99791，如圖 1所示.

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

移液管精密移取1 mL待測液，按上述方法顯色后測定吸光度，根據(jù)標準曲線換算出多糖含量，計算提取率.

1.2.3試驗設計 主要考察酶用量、提取溫度、液料比、提取時間對提取的影響，首先固定其中三個因素、改變其中一個因素進行單因素試驗；在單因素試驗初步確定的最佳結果附近進一步細化選點，采用響應面法設計試驗方案進一步優(yōu)化提取工藝.

2結果與討論

2.1單因素試驗分析

酶用量對金銀花多糖提取率的影響：固定提取時間為40 min、溫度為50℃、液料比為20 mL/g，酶用量分別為：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，試驗結果見圖2.由圖2可得，酶用量在0.1%到0.3%呈快速增長趨勢；當酶用量超過了0.3%后金銀花多糖提取率有所下降.當酶用量在0.3%時多糖提取率達到最高.纖維素酶用量增加使得金銀花與纖維素酶充分接觸并反應，當酶用量超過0.3%后，反應中過量的纖維素酶降解已提取的多糖，因此纖維素酶的最佳用量為0.3%左右.

圖2 酶用量對金銀花多糖提取的影響Fig.2 Effect of dosage of enzyme on extraction

溫度對金銀花多糖提取率的影響：固定酶用量為0.2%、液料比為20 mL/g、提取時間為 40 min，溫度分別為：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，試驗結果見圖3.由圖3可得，在提取溫度升高的過程中，金銀花多糖提取率呈上升趨勢，60℃時提取率達到最高，當溫度過60℃后金銀花多糖提取率出現(xiàn)驟然下降.溫度升高使得酶活性增高從而多糖的提取率逐漸增大，當溫度超過60℃酶失活降低了纖維素酶對多糖的作用，另外高溫也可能導致多糖的降解，因而最佳提取溫度應該在60℃左右.

圖3 提取溫度對金銀花多糖提取的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction

液料比對金銀花多糖提取率的影響：固定酶用量為0.2%，溫度為50℃，提取時間為40 min，液料比分別取10 mL/g、20 mL/g、30 mL/g、40 mL/g、50 mL/g，試驗結果見圖4.由圖4可得，試驗中隨著液料比增加，多糖提取率快速上升，約40 mL/g時提取率達到最高，液料比一旦超過40 mL/g后再增加反而會使提取率下降.可能是隨著液料比的提高，多糖擴散達到平衡時殘留在植物組織內部的多糖濃度低，因而提取率升高.但液料比過大，金銀花溶脹厲害，提取的多糖又會被植物組織吸附，因而實際提取率反而下降.

圖4 液料比對金銀花多糖提取的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on extraction

提取時間對金銀花多糖提取率的影響：固定酶用量為0.2%，溫度為50℃，液料比為20 mL/g，提取時間分別取20 min、40 min、60 min、80 min、100 min時，試驗結果見圖5.由圖5可得，金銀花中多糖提取時間設置為40 min左右時多糖提取率可以達到最高，但是提取時間設置超過40 min以后多糖提取率會大幅度降低，產(chǎn)生這樣的試驗結果的原因可能是提取時間過長，使得纖維素酶可以降解已經(jīng)提取出的金銀花多糖，從而影響多糖最終提取率.

圖5 提取時間對金銀花多糖提取的影響Fig.5 Effect of time on extraction

2.2響應面試驗分析

響應面法設計試驗方案(Design Expert 8.0.6 軟件)，將液料比固定為40 mL/g，以纖維素酶用量/%(A)、提取溫度/℃(B) 、提取時間/min(C) 3個因素為自變量，將多糖提取率y(%)設置為因變量，優(yōu)化試驗一共設立了17個試驗處理組，試驗用到因子編碼及水平圖見表1.

表1 試驗因素與水平

響應面法設計的試驗方案及試驗結果見表2.

表2 Box-Behnken 設計方案及響應值

表3 回歸模型顯著性檢驗

響應面圖形是響應值對各試驗因素所構成的三維空間的曲面圖，圖6、圖7和圖8分別為試驗中將酶用量(A)、溫度(B)、提取時間(C) 3個試驗因素中的其中一個因素固定，其它兩個試驗因素對金銀花多糖提取率的交互影響曲面圖.從圖中可以看出AB、AC、BC交互作用都不顯著，表現(xiàn)為等高線稀疏、形狀接近圓形并且都有共圓心的趨勢.對比圖6、圖7和圖8可知，AB中等高線形狀最接近圓形并且共圓心的趨勢最強，BC中等高線共圓心的趨勢相對最弱，因而交互作用強弱順序為BC、AC、AB，跟表3中結果一致.

圖9為模型預測值與試驗值之間的相關圖，大部分樣本點均勻分布于45°對角線附近，說明大部分試驗數(shù)據(jù)比較準確，響應面法可以用于金銀花多糖提取的研究.圖10為模型預測的誤差分布圖，圖中存在少數(shù)大誤差的樣本點，少部分樣本點離中間直線稍遠，可能是實驗條件未控制好導致個別試驗數(shù)據(jù)不夠準確，有待進一步研究.

通過對所建模型在各影響因素取值范圍內求最大值，得出提取金銀花多糖最佳工藝條件為：纖維素酶用量為0.29%、提取溫度為55.45℃、提取時間為41.03 min，粗多糖提取率模型預測值為6.71%.為處理方便，將最佳條件修正為：纖維素酶用量為0.30%、提取溫度為55℃、提取時間為40 min，在此條件下平行試驗3次，3次重復試驗提取率分別為6.61%、6.63%、6.77%，平均值為6.67%，與模型預測值6.71%相差不大，即響應面法得出的纖維素酶法提取金銀花多糖的最佳工藝是正確的.

圖6 酶用量(A)、溫度(B)及交互作用Fig.6 Effects of enzyme dosage， temperature and their interactions

圖7 酶用量(A)、時間(C)及交互作用Fig.7 Effects of enzyme dosage， extraction time and their interactions

圖8 溫度(B)、提取時間(C)及交互作用Fig.8 Effects of temperature， extraction time and their interactions

圖9 預測值與試驗值相關圖Fig.9 Predicted vs. actual values

圖10 預測值與試驗值之間殘差分布Fig.10 Distribution of residual between the predicted and actual values

3結論

采用單因素試驗和響應面法優(yōu)化了纖維素酶法提取金銀花多糖的工藝，通過對所建模型求最大值得出最佳工藝條件，在最佳工藝條件下金銀花多糖的提取率可達6.67%.與文獻[6-8]相比，酶法提取金銀花多糖耗時短、提取率高、操作簡便、無需特殊的儀器設備及試劑藥品，易于實現(xiàn)規(guī)?；崛?，本文所得金銀花多糖提取工藝對于開發(fā)利用金銀花等植物多糖具有一定的參考價值.

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Study on extraction of honeysuckle polysaccharide by using response surface satisfaction function

LI Jianfeng1，2， ZHONG Mengli1， LIAO Limin1，2

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering， Neijiang Normal University， Neijiang， Sichuan 641100；2.Key Laboratory of Fruit Waste Treatment and Resource Recycling of Sichuan Provincial College， Neijiang， Sichuan 641100)

Honeysuckle was used as the materials of experiments. The best craft of extracting polysaccharide from honeysuckle with cellulose was found through the single factor experiments and the response surface method. The effects of dosage of enzyme， extraction temperature， liquid-solid ratio and extraction time on the extraction rate were investigated. When dosage of enzyme， temperature， liquid-solid ratio and extraction time was 0.3%， 55℃， 40 mL/g and 40 min， respectively， the average extraction yield of polysaccharide reached 6.67% and the experiments had good reproducibility. This work provided reference for the extraction of honeysuckle and other plant polysaccharides．

honeysuckle; polysaccharide; response surface method; extraction

2016-06-09.

四川省教育廳青年基金項目(14ZB0259) .

1000-1190(2016)06-0886-06

O629.1

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: liaolimin523@126.com.