王 蕾，劉思洋，孫寧陽，李佳川，顧 健

(西南民族大學藥學院，四川 成都 610041)

藏藥波棱瓜子有效成分波棱素對ConA誘導的免疫性肝損傷的保護作用

王 蕾，劉思洋，孫寧陽，李佳川，顧 健

(西南民族大學藥學院，四川 成都 610041)

目的通過建立ConA誘導的免疫性肝損傷動物模型，研究波棱瓜子有效成分波棱素對免疫性肝損傷的保護作用.方法一次性動物尾靜脈注射刀豆球蛋白(20mg/kg)建立小鼠免疫性肝損傷模型，考察不同劑量的波棱素對小鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)，以及肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量(或活性)的影響.結果小鼠尾靜脈注射ConA后，模型組小鼠血清AST、ALT等活性明顯升高，說明ConA誘導的損傷模型造模成功.給予波棱素藥物后，與模型組相比較，波棱素能明顯降低小鼠ALT、AST和LDH活性，降低小鼠肝組織MDA的含量；升高肝組織SOD和GSH-Px的活性.結論波棱素能明顯減輕ConA誘導的小鼠肝組織損傷，改善其炎癥反應，保護肝臟組織.

波棱瓜子；波棱素；免疫性肝損傷

藏藥波棱瓜子是葫蘆科攀援草本植物波棱瓜(Herpetosperalga pedunculosum Wall.)的種子，主要用于對肝病肝炎的防護和輔助醫(yī)治肝組織疾病[1].已有前期實驗表明藏藥波棱瓜子總木脂素是波棱瓜子的有效部位[6-8]，而波棱素是其重要的有效單體成分之一[9-13].本研究擬通過ConA誘導建立小鼠免疫性肝損傷模型，探討波棱瓜子有效成分波棱素對免疫性肝損傷的保護作用.

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

波棱素:波棱瓜種子以80%乙醇回流，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯部位依次經過硅膠色譜梯度和等度洗脫進行分離，高效液相進行物質純化得波棱素，經HPLC含量測定其純度＞95%.刀豆蛋白A(ConA)購自Sigma公司；清開靈注射液(批號: 14223163)購自神威藥業(yè)；ALT(批號:2015020)、AST (批號:2015009)購自長春匯力生物技術有限公司；LDH(批號:YZB/京0798-2010)自中生北控生物科技有限公司；MDA(批號:20151011)、SOD(批號: 20151010)和GSH-Px(批號:20151011)購自南京建成生物工程有限公司.

1.2 儀器

722 N型可見分光光度計，上海萊帕德科學儀器有限公司生產；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀，常州市中威醫(yī)療儀器有限公司生產.

1.3 動物

ICR雄性小鼠(體質量20±2g)，動物合格證號: 0014485，動物許可證號:SCXK[川]2013-24，購于成都達碩實驗動物研究中心.

1.4 方法

ICR雄性小鼠，按體量分層隨機分成5組，即空白組、模型組、清開靈注射液組(20mg/kg)和波棱素組(10、20mg/kg)，每組8只.每天按設計劑量給予相應藥物，連續(xù)7d.于末次給藥后1h，除空白組以外，其余各組動物經尾靜脈注射ConA(20mg/kg)建立小鼠免疫性肝損傷模型.檢測指標如下:

(1)肝臟系數(shù)

稱取小鼠體質量，記錄數(shù)據(jù).待小鼠取血后立即脫頸處死，稱取小鼠肝臟質量，計算肝臟系數(shù).肝臟系數(shù)(%)＝(肝臟質量/小鼠體質量)×100%

(2)血清ALT、AST和LDH的測定

小鼠尾靜脈注射ConA后(期間禁食不禁水10h)，眼眶取血，3000rpm/min離心10min，分離血清，凍存?zhèn)溆?按試劑盒說明書分別檢測小鼠血清AST、ALT(賴氏法)以及LDH(速率法)的含量.

(3)肝組織MDA、SOD和GSH-Px的測定

待小鼠處死后，每只小鼠取肝臟同一部位組織制備10%肝臟勻漿.按試劑盒說明書分別檢測小鼠肝組織MDA、SOD和GSH-Px的活性.

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 實驗結果

2.1 對肝臟系數(shù)的影響

由表1可知，與空白組比較，模型組小鼠的肝臟系數(shù)明顯增大；與模型組比較，波棱素高、低劑量組和清開靈注射液組能明顯降低小鼠的肝臟系數(shù)，減少肝臟水腫.

表1 波棱素對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響(，n＝8)Table 1 Effects of Herpetin on the liver coefficients of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

表1 波棱素對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響(，n＝8)Table 1 Effects of Herpetin on the liver coefficients of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

與模型組比較，?p＜0.05，??p＜0.01.

組別劑量/mg·kgˉ1動物數(shù)/只肝臟系數(shù)%空白-83.97±5.37??模型-85.54±4.84清開靈注射液2084.35±5.62??波棱素1084.57±5.37??2084.36±5.38??

2.2 對血清相關生化酶活性的影響

由表2可知，與空白組比較，模型組小鼠血清中LDH、AST和ALT的含量明顯升高，表明小鼠肝功能受到損傷，造模成功；與模型組比較，波棱素高、低劑量組和清開靈注射液組均能明顯降低肝損傷小鼠LDH、AST和ALT的含量，減少炎癥的發(fā)生.

表2 波棱素對ConA致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST和LDH活力的影響(，n＝8)Table 2 Effects of Herpetin on the levels of serum ALT，AST and LDH of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

表2 波棱素對ConA致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST和LDH活力的影響(，n＝8)Table 2 Effects of Herpetin on the levels of serum ALT，AST and LDH of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

與模型組比較，?p＜0.05，??p＜0.01.

2.3 對肝組織中相關生化酶活性的影響

由表3可知，與空白組比較，模型組小鼠肝組織勻漿中MDA活性明顯上升，SOD、GSH-Px活性明顯減少；與模型組比較，波棱素高、低劑量組和清開靈注射液組均能明顯降低小鼠肝組織中MDA的活性，升高SOD和GSH-Px的活性.提示波棱素具有一定的清除自由基，保護肝細胞膜，提高抗氧化的能力.

表3 波棱素對小鼠ConA致免疫性損傷肝勻漿中MDA、SOD和GSH-Px水平的影響(，n＝8)Table 3 Effects of Herpetin on the levels of MDA，SOD and GSH-Px levels in liver homogenate of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

表3 波棱素對小鼠ConA致免疫性損傷肝勻漿中MDA、SOD和GSH-Px水平的影響(，n＝8)Table 3 Effects of Herpetin on the levels of MDA，SOD and GSH-Px levels in liver homogenate of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

與模型組比較，?p＜0.05，??p＜0.01.

3 討論

肝損傷是各種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理過程，肝損傷的發(fā)生機制一般分為化學性和免疫性兩種方式.免疫性肝損傷主要為免疫變態(tài)反應，是抗原或半抗原刺激后機體產生的體液性或細胞性異常的一種免疫反應，能使組織損害或產生機能障礙[14].1992年Tiegs[2]等以ConA誘導的特異性肝損傷是目前運用較廣的免疫性肝損傷模型之一.ConA是一種能誘導特異性肝損傷的T細胞絲裂原，給予ConA后，巨噬細胞和T淋巴細胞被激活，并分泌TNF-α和INF-γ等相關細胞因子損傷肝細胞或激活一系列損傷肝細胞的反應.ConA誘導的免疫性肝損傷與人類免疫性肝炎的發(fā)病原因與致病機理具有相似性[3-5].

大量實驗表明，當肝組織受到損害時，胞漿中AST、ALT和LDH等相關酶將進入血液中，通過檢測血清中相關酶的活性能反映肝功能的恢復情況.本實驗通過連續(xù)7d給予波棱素后，波棱素能使肝損傷小鼠體內的LDH、AST和ALT的含量明顯下降，減輕小鼠肝臟系數(shù)，顯示出波棱素具有一定的保護肝組織作用；同時，MDA是組織或器官膜脂質發(fā)生過氧化反應而產生的，它的含量與機體遭受自由基損害的程度有密切的關系；而SOD和GSH-Px的含量的高低則可以評定機體抗氧化水平.SOD在需氧生物體中幾乎普遍存在，它能清除炎癥中產生的自由基，顯示出抗氧化作用.機體內廣泛存的GSH-Px是重要的催化過氧化物分解的酶，它特異地催化谷胱甘肽對氫過氧化物的還原反應，抑制脂質過氧化，保護細胞膜的完整性[5-7].本實驗研究表明，波棱素能能明顯降低小鼠肝組織MDA的活性，升高SOD和GSH-Px的活性，顯示出波棱素抗肝組織損傷可能與藥物清除自由基，保護肝細胞膜，提高抗氧化能力和減少炎癥等機制相關.綜上所述，波棱素具有確切的降低ConA引起的肝損傷酶活力增加，有效改善肝組織炎癥和病變，保護肝臟組織免受侵害.

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(責任編輯:李建忠，付強，張陽，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Protection of Herpetin from Tibetan medicine Herpetospermum seeds on ConA-induced immunologic liver injury in mice

WANG Lei，LIU Si-yang，SUN Ning-yang，LI Jia-chuan，GU jian
(School of Pharmacy，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

Objective To study the protection effect of the bioactive Herpetin from Herpetospermum seeds on immunologic liver injury induced by ConA.Methods Mice were injected intravenously with ConA(20mg/kg)in order to establish the mice immunological liver injury model.Activities of ALT，AST，LDH in serum and MDA，SOD and GSH-Px levels in liver tissues were evaluated in different dose groups.Results After mice tail vein injection with ConA，the increased activities of ALT and AST in serum indicated that the mice immunological liver injury model induced by ConA was successful.Compared with the control group it was shown that Herpetin can significantly reduce the activities of hepatic ALT，AST and LDH，and also decrease the MDA content.Furthermore，elevated activities of SOD and GSH-Px were observed.Conclusion Herpetin can significantly decrease immunological liver injury induced by ConA，and reduce inflammatory response to protect liver tissues from damage.

Herpetospermum seeds；Herpetin；immunological liver injury

R285；R29

A

2095-4271(2016)05-0492-04

10.11920/xnmdzk.2016.05.004

2016-07-13

顧健(1967-)，男，漢族，教授，博士生生導師，研究方向:中藥及民族藥物基礎研究與開發(fā).E-mail:gujiancd＠163.com

國家自然科學基金項目(81274168、81573563)；四川省中醫(yī)藥管理局科研項目(2016C062)