劉 佩，鄭國華，吳 勇，譚永霞，張寶徽（湖北中醫(yī)藥大學中藥資源與中藥復方教育部重點實驗室/老年病中藥新產(chǎn)品湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430065）

霉茶總黃酮對自發(fā)性高血壓大鼠心臟的保護作用及機制研究Δ

劉 佩＊，鄭國華，吳 勇，譚永霞，張寶徽#（湖北中醫(yī)藥大學中藥資源與中藥復方教育部重點實驗室/老年病中藥新產(chǎn)品湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430065）

目的：觀察霉茶總黃酮對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心臟的保護作用，并探討其作用機制。方法：將50只SHR按體質(zhì)量隨機分為模型組、復方羅布麻片組（陽性藥物，50 mg/kg）和霉茶總黃酮低、中、高劑量組（90、180、360 mg/kg），每組10只。各給藥組大鼠ig相應藥物，模型組大鼠ig等體積蒸餾水，每天2次，連續(xù)7周。測定大鼠血壓并計算大鼠心臟指數(shù)；采用蘇木精-伊紅染色法觀察心臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測心臟組織中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和醛固酮合成酶（CYP11B2）mRNA的表達。結(jié)果：霉茶總黃酮可明顯降低SHR血壓（P＜0.01），改善SHR心臟組織細胞形態(tài)不規(guī)則、固縮和組織纖維增生等炎性病變，降低SHR心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA的表達水平（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：霉茶總黃酮對SHR心臟有一定的保護作用，其機制可能與下調(diào)心臟組織中ACE、AngⅡ和CYP11B2 mRNA表達有關。

霉茶總黃酮；自發(fā)性高血壓大鼠；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；血管緊張素Ⅱ；醛固酮合成酶

霉茶系葡萄科蛇葡萄屬植物大葉蛇葡萄（Ampelopsis megalophylla Diels et.Gilg）的枝葉加工而成的一種傳統(tǒng)中草藥，被收載于《湖北中草藥志》，是一種民間藥用植物。在湖北恩施地區(qū)，其是一種藥食兩用的植物資源，民間將其葉放置在沸水中稍燙，然后即時撈起瀝干，攤放在通風處直到表面上出現(xiàn)白霉，開水泡服，用于治療高血壓、暈眩目脹等癥[1-2]。湖北中醫(yī)藥大學鄭國華教授等對霉茶抗高血壓的有效部位進行了化學成分分離、鑒定以及藥理篩選等研究，認為霉茶抗高血壓的主要有效成分是總黃酮。大量的實驗研究結(jié)果也表明，黃酮類化合物具有抗氧化、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等藥理作用[3-4]。鑒于此，本研究擬觀察霉茶總黃酮對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心臟的保護作用，并測定心臟組織中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、血管緊張素（Ang）Ⅱ和醛固酮合成酶（CYP11B2）mRNA的表達水平，初步探討其作用機制，以期為霉茶治療高血壓和合理開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BP-98A全自動無創(chuàng)血壓測量儀（北京軟隆科技有限公司）；CR21GⅡ低溫高速離心機（日本Hitachi公司）；FA210N精密電子天平（上海菁海儀器有公司）；MyIQ2實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

霉茶總黃酮（湖北中醫(yī)藥大學藥學院藥劑實驗室提供，批號：20140310，規(guī)格：總黃酮含量為86.74%）；復方羅布麻片（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號：130525；規(guī)格：0.218 5 g/片）；4%多聚甲醛（武漢谷歌生物工程有限公司，批號：20140317）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；AZfreshTM總RNA小量提取試劑盒、AZpolarisTMcDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（瑞典Azanno公司，批號：B1104118、C0122104）。

1.3 動物

SHR 50只，SPF級，♂，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK（京）2012-0001]。大鼠分籠飼養(yǎng)在22～24℃環(huán)境下，期間喂以普通飼料和清水。

2 方法

2.1 分組與給藥

50只SHR適應性飼養(yǎng)及血壓測量訓練3周后隨機分為5組，分別為模型組（蒸餾水）、復方羅布麻片組（陽性藥物，50 mg/kg）和霉茶總黃酮低、中、高劑量組（90、180、360 mg/kg，根據(jù)預實驗結(jié)果及文獻[5]設定），每組10只。各組大鼠每天上午9：00和下午4：00各ig給藥1次，給藥體積均為10 ml/kg，連續(xù)7周。

2.2 一般情況觀察及血壓測定

實驗過程中每天觀察并記錄各組大鼠的排泄物、攝食量及飲水量等日?；厩闆r，并每周測定各組大鼠體質(zhì)量1次。分別于給藥前和給藥后1、3、5、7周采用全自動無創(chuàng)血壓測量儀測定各組大鼠血壓（mm Hg，1 mm Hg＝0.133 kPa）。

2.3 心臟指數(shù)的測定及心臟組織病理學的檢查

末次給藥前12 h禁食不禁水，末次給藥后1 h處死大鼠，迅速鈍性剝離心臟組織，用生理鹽水清洗后用濾紙吸干水分，精密稱質(zhì)量，計算心臟指數(shù)[心臟指數(shù)＝心臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）]。取部分心臟組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色作病理組織學檢查；剩余部分心臟組織于－80℃條件下保存，備用。

2.4 心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達水平的檢測

每組隨機選取5個組織樣本，每個樣本取量約100 mg，迅速用液氮研磨成粉末后轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，按AZfreshTM總RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA。引物序列由上海Invitrogen公司檢驗及合成，經(jīng)Blast進行同源比較以確保其特異性。按照AZpolarisTMcDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒中說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后進行擴增反應，PCR反應混合液總體系為20 μl。循環(huán)條件：95℃、2 min；95℃、10 s，62℃、15 s，72℃、15 s，共進行40個循環(huán)；最后55℃、10 s考察融解曲線，共進行81個循環(huán)。以收集的較強的熒光信號和融解曲線單一峰為評判標準，將內(nèi)參基因β-actin與目的基因同時擴增，以2－ΔΔct法計算目的基因的相對表達量。PCR引物序列與擴增片段長度見表1。

表1 PCR引物序列與擴增片段長度Tab 1 PCR primer sequence and amplified fragment length

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察結(jié)果

實驗期間，各組大鼠攝食量、飲水量均正常，每日的飲水、飲食量變化不大。大便成形，毛色光滑且有光澤，腰背平直，精神狀態(tài)良好。灌胃時反抗力不大，性情一直較溫和，體質(zhì)量均正常增長。各組大鼠在體征上并無明顯的差異。

3.2 各組大鼠血壓測定結(jié)果

給藥前，各組大鼠血壓之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥3、5、7周后，各給藥組大鼠血壓較模型組明顯降低（P＜0.01），這說明霉茶總黃酮具有降低SHR血壓的作用。各組大鼠血壓測定結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血壓測定結(jié)果（±s，n＝10，mm Hg）Tab 2 Blood pressure of rats in each group（±s，n＝10，mm Hg）

表2 各組大鼠血壓測定結(jié)果（±s，n＝10，mm Hg）Tab 2 Blood pressure of rats in each group（±s，n＝10，mm Hg）

注：與模型組比較，＊＊P＜0.01Note：vs.model group，＊＊P＜0.01

組別模型組霉茶總黃酮低劑量組霉茶總黃酮中劑量組霉茶總黃酮高劑量組復方羅布麻片組劑量，mg/kg 90 180 360 50給藥前181.7±8.5 184.4±9.5 186.6±7.8 188.0±10.6 182.1±5.2給藥后第1周191.1±7.8 188.3±11.9 188.9±9.0 186.8±8.6 189.5±7.4第3周205.5±4.6 187.1±8.5＊＊188.1±8.2＊＊184.9±7.4＊＊184.5±8.2＊＊第5周206.8±8.0 185.8±3.5＊＊185.3±6.2＊＊182.1±5.0＊＊182.4±5.8＊＊第7周207.5±6.5 184.1±4.0＊＊183.9±5.5＊＊181.4±4.6＊＊181.2±3.9＊＊

3.3 各組大鼠心臟組織病理學觀察結(jié)果

模型組大鼠的心臟結(jié)構(gòu)有明顯的炎癥病變癥狀，細胞形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)胞核變形、固縮；組織纖維增生，發(fā)生變性。與模型組比較，霉茶總黃酮低劑量組大鼠對心臟的改善作用較小，仍可見較多的細胞核變形、固縮；霉茶總黃酮高、中劑量組和復方羅布麻片組大鼠的心臟組織炎癥病變有一定的改善，細胞形態(tài)較規(guī)則，組織纖維化有所好轉(zhuǎn)。這提示霉茶總黃酮高、中劑量對SHR的心臟具有一定的保護作用。各組大鼠心臟組織的HE染色圖見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織的HE染色圖（×200）Fig 1 HE staining of cardiac tissue of rats in each group（× 200）

3.4 各組大鼠心臟指數(shù)測定結(jié)果

與模型組[（3.65±0.15）mg/g]比較，霉茶總黃酮低、中、高劑量組和復方羅布麻片組大鼠心臟指數(shù)[依次為（3.69±0.20）、（3.68±0.28）、（3.56±0.11）、（3.58±0.18）mg/g]差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.5 各組大鼠心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達水平測定結(jié)果

與模型組比較，霉茶總黃酮各劑量組大鼠心臟組織中ACE mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），霉茶總黃酮中、高劑量組和復方羅布麻片組大鼠心臟組織中AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達水平測定結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 mRNA expression levels of ACE，AngⅡand CYP11B2 in cardiac tissue of rats in each grou（p±s，n＝10）

表3 各組大鼠心臟組織中ACE、AngⅡ、CYP11B2 mRNA表達水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 mRNA expression levels of ACE，AngⅡand CYP11B2 in cardiac tissue of rats in each grou（p±s，n＝10）

注：與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.model group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型組霉茶總黃酮低劑量組霉茶總黃酮中劑量組霉茶總黃酮高劑量組復方羅布麻片組90 180 360 50 1.012±0.183 0.831±0.104＊0.614±0.061＊＊0.487±0.101＊＊1.196±0.241 1.007±0.068 0.948±0.075 0.837±0.099＊0.674±0.136＊＊0.776±0.069＊＊1.029±0.049 0.926±0.042 0.602±0.032＊＊0.439±0.058＊＊0.527±0.027＊＊劑量，mg/kg ACE AngⅡCYP11B2

4 討論

全世界有超過三分之一的成年人患有高血壓，高血壓可引起心臟病、中風等疾病和過早死亡[6]。高血壓主要危害是造成靶器官的損害，而心臟是靶器官之一，高血壓對心肌細胞的結(jié)構(gòu)、代謝和心肌間質(zhì)都有一定的影響[7]。降壓治療不僅要能有效控制血壓，也應對心臟這類靶器官起保護作用。故本研究以SHR為模型動物，經(jīng)ig給予霉茶總黃酮后，第3周開始大鼠血壓明顯降低，這表明霉茶總黃酮有明顯的降壓作用。組織病理學結(jié)果顯示，經(jīng)霉茶總黃酮高、中劑量治療后，大鼠心肌中組織纖維化程度降低，炎癥病變得到一定的改善。這一研究結(jié)果顯示，霉茶總黃酮具有一定的心臟保護作用。

復方羅布麻片中主要成分為羅布麻，其具有降壓平穩(wěn)、不良反應小等優(yōu)點。羅布麻化學成分包括黃酮類、鞣質(zhì)類、酸類、氨基酸類等，其中黃酮類成分是主要的化學成分，而且該類成分極有可能是發(fā)揮降壓作用的功效成分[8]。此藥和民間傳統(tǒng)中草藥同用而達到降壓功效，效果良好，常用作陽性對照藥物，故本研究選其作為陽性對照藥。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在維持生理狀態(tài)下體內(nèi)的電解質(zhì)穩(wěn)定、體液平衡、調(diào)節(jié)血壓以及調(diào)控心腎靶器官結(jié)構(gòu)功能等方面中扮演著非常重要的角色。RAS主要是由腎素、血管緊張素原、ACE、Ang和其相應的受體構(gòu)成的。RAS是參與高血壓形成、發(fā)展的重要體液調(diào)節(jié)因子，RAS的過度激活是高血壓及其他心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要決定因素，并且已經(jīng)成為高血壓治療的重要靶點[9]。從理論上講，阻斷RAS中的任一環(huán)節(jié)，對治療高血壓都是有益的，而其中AngⅡ與ACE在這一系統(tǒng)中起著更為重要的作用。ACE可使AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ，而AngⅡ是系統(tǒng)中的主要生物活性肽，可強烈促進血管收縮，直接參與高血壓的發(fā)生、發(fā)展，其在循環(huán)和局部RAS中均發(fā)揮著最重要的病理生理作用[10]。研究表明，AngⅡ受體可介導心肌細胞增生肥大[11]，而AngⅡ與心臟成纖維細胞表面受體結(jié)合，能促進成纖維細胞增殖[12]，兩者共同作用導致細胞外基質(zhì)增多，心肌細胞發(fā)生生理、病理性改變。而CYP11B2為腎素-Ang-CYP11B2中關鍵組成部分，長時間的血漿內(nèi)高CYP11B2水平會增加循環(huán)血量，導致血壓升高，刺激心肌纖維細胞，引起心臟肥厚、心肌纖維化及充血性心力衰竭[13]。因此，減少ACE、AngⅡ和CYP11B2的產(chǎn)生是對抗高血壓和保護心臟的有效措施。本研究結(jié)果顯示，各給藥組大鼠心臟組織中ACE、AngⅡ和CYP11B2 mRNA表達水平均有不同程度的降低，特別是高劑量的霉茶總黃酮下調(diào)ACE和AngⅡ表達的效果非常明顯。這提示霉茶總黃酮可能是通過抑制腎素-Ang系統(tǒng)，從而起到降壓和保護心臟的作用。

綜上所述，霉茶總黃酮對SHR心臟具有一定的保護作用，其機制與其下調(diào)心臟組織中ACE、AngⅡ和CYP11B2 mRNA的表達，抑制RAS系統(tǒng)活性有關。

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Study on the Protective Effect of Total Flavonoids from Ampelopsis megalophyllaon on Cardiac Tissue of Spontaneous Hypertensive Rat and Its Mechanism

LIU Pei，ZHENG Guohua，WU Yong，TAN Yongxia，ZHANG Baohui（Key Lab of TCM Resource and Compound Prescription Ministry of Education/Hubei Co-innovation Center for TCM New Products of Senile Diseases，Hubei University of TCM，Wuhan 430065，China）

OBJECTIVE：To observe the protective effect of total flavonoids from Ampelopsis megalophylla on cardiac tissue of spontaneously hypertensive rats（SHR），and to investigate its mechanism.METHODS：50 SHRs were randomly divided into model group，Compound apocynum tablets group（positive drug，50 mg/kg）and total flavonoids from A.megalophylla low-dose，medium-dose and high-dose groups（90，180，360 mg/kg），with 10 rats in each group.The rats were given relevant medicine intragastrically，and model group was given constant volume of distilled water intragastrically，twice a day，for consecutive 7 weeks.Blood pressure of rats were determined and cardiac index of rats were calculated；the morphology and structure of cardiac tissue were observed by HE staining.mRNA expression of ACE，AngⅡ and CYP11B2 in cardiac tissues were determined by RT-PCR.RESULTS：Total flavonoids from A.megalophylla can significantly decrease the blood pressure of SHR（P＜0.01），improve the flammatory lesions of hearte issue such as irregular cell morphology，cell shrinkage，proliferation of fibrous tissue and so on，and it also can significantly decrease the mRNA expression levels of ACE，AngⅡ，CYP11B2 in cardiac tissue of rats（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Total flavonoids from A.megalophylla can protect cardiac tissue of SHR，the mechanism of which may be associated with down-regulating mRNA expression of ACE，AngⅡand CYP11B2 in cardiac tissue.

Total flavonoids from Ampelopsis megalophylla；Spontaneous hypertensive rats；ACE；AngⅡ；CYP11B2

R285

A

1001-0408（2016）34-4767-04

2016-06-13

2016-08-25）

（編輯：林 靜）

國家自然科學基金資助項目（No.81173502）

＊碩士研究生。研究方向：中藥新制劑、新劑型的研究。E-mail：84358037@qq.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：中藥制劑。E-mail：24662873@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.05