魏紅巖， 孟曉卿， 黃志偉

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海 201620)

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釀酒酵母總蛋白的提取及其耐核苷類藥物表達(dá)特性分析

魏紅巖， 孟曉卿， 黃志偉

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海 201620)

建立了一種簡便適用于從真核細(xì)胞釀酒酵母菌中提取總蛋白的方法，應(yīng)用該方法探索了兩株對核苷類藥物5-FC高耐受菌株的蛋白表達(dá)特性。實驗中以細(xì)胞破碎率和總蛋白濃度為主要檢測指標(biāo)，對比分析了6種酵母細(xì)胞破碎方法，即液氮研磨、超聲波破碎、酸洗玻璃珠法、酶法、反復(fù)凍融法、TNBIO高壓細(xì)胞破碎，通過比色法測定了總蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)改進(jìn)后的酸洗玻璃珠法的細(xì)胞破碎率為81.25%，總蛋白含量152.67 mg/mL，效果明顯優(yōu)于其他幾種方法. 實驗表明,在裂解液中添加適量的PMSF等蛋白酶抑制劑，可以有效防止蛋白的降解。經(jīng)過SDS-PAGE對核苷類藥物高耐藥性菌株酵母總蛋白表達(dá)特性分析，酸洗玻璃珠法提取的蛋白含量高，所含雜質(zhì)少，條帶比較多且清晰，其中相對分子質(zhì)量約為21 kDa和43 kDa的蛋白有明顯的表達(dá)差異，可能與菌株細(xì)胞的耐藥性相關(guān)。

釀酒酵母； 細(xì)胞破碎； 蛋白質(zhì)提??； 耐藥性

0 引 言

酵母廣泛應(yīng)用于遺傳和細(xì)胞生物學(xué)的研究，也是基因工程技術(shù)應(yīng)用中十分重要的宿主菌[1]。由于酵母細(xì)胞具有堅硬的細(xì)胞壁，其厚度約為0.1～0.3 μm，當(dāng)細(xì)胞老化時，厚度還會增加，難以破碎[2]，導(dǎo)致酵母細(xì)胞中的總蛋白的釋放率不高。對酵母細(xì)胞進(jìn)行破碎，是對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)提取和研究中的關(guān)鍵步驟，也是綜合利用酵母的一種有效途徑，在一定程度上決定著實驗的成功與否及效率高低[3]。目前，雖已有多種方法應(yīng)用于酵母細(xì)胞的破碎，但仍存在不少弊端。例如：傳統(tǒng)的機(jī)械操作方法易產(chǎn)生高溫，損耗大[4]；酶裂解法成本高，易造成產(chǎn)物抑制，且酶解后分離繁瑣；化學(xué)法作用時間長、效率低，并且所用試劑毒性較大，特別是化學(xué)法對蛋白質(zhì)的損傷較大，容易引起蛋白質(zhì)變性，且引入的化學(xué)試劑為實驗的后續(xù)處理帶來了困難；超聲波法產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活，且散熱困難[5]；高壓破碎過程中，團(tuán)狀或絲狀真菌易造成堵塞以及有些亞細(xì)胞器質(zhì)地堅硬易損傷機(jī)器等[6]。以往研究人員一直致力于如何提高細(xì)胞破碎率，增加所需蛋白的提取率，卻缺乏在提高細(xì)胞破碎率的同時，對總蛋白損壞和降解的研究。本文對適用于酵母的破碎方法進(jìn)行了一些優(yōu)化探索。

核酸藥物是以核酸為作用靶點(diǎn)的藥物，干擾或阻斷細(xì)菌、病毒和腫瘤細(xì)胞的核酸合成，有效地殺滅或抑制細(xì)菌、病毒和腫瘤細(xì)胞[7]。5-氟胞嘧啶(5-FC)、5-氟尿嘧啶(5-FU)是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的核酸類抗真菌藥物，但由于其相關(guān)藥物細(xì)胞毒副作用大且易于產(chǎn)生耐藥性，是臨床使用的重要障礙。酵母是研究藥物或化合物作用機(jī)制的極好單細(xì)胞模型[8]。本文利用本實驗室擁有的5-FC高耐受菌株BY4741R1-5FC和 BY4741R2-5FC，結(jié)合改進(jìn)的釀酒酵母總蛋白的提取方法，對酵母耐核苷類藥物表達(dá)特性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步開展臨床真菌核苷類藥物耐藥性的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 材 料

釀酒酵母S.cerevisiaeBY4741(MATα; his3△1; leu2△0; met15△0; ura3△0 )；抗性菌株BY4741R1-5FC(BYR1-5FC); BY4741R2-5FC(BYR2-5FC)，由本實驗室提供。

1.2 主要試劑

YPD液體培養(yǎng)基(2% Tryptone，2% Glucose，1% Yeast extract)；酵母完全合成(SC)固體培養(yǎng)基(0.17% Yeast Nitrogen Base，0.12% Glutamic Acid，0.2% Drop-outMix，1.5% Agar，2% Glucose)；裂解緩沖液: 8 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，1% (w/v) 二硫蘇糖醇(DTT)，1 mmol/L 苯甲酰磺酰氟(PMSF)，1 mmol/L NaF,35 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，DTT、PMSF、NaF臨用前再加；牛血清蛋白(BSA)；蝸牛酶；濃HCl；牛血清白蛋白(Bovine Albumin，BSA)均為分析純；10% SDS；四甲基乙二胺原液(TEMED)； 30% 丙稀酰胺；5×電泳液緩沖液；10% 過硫酸胺(AP)；1.0 mol/L Tris·HCl(pH6.8)；磷酸鹽緩沖液；1.5 mol/L Tris·HCl(pH 8.8)；PageRulerTMPrestained Protein Ladder。

1.3 主要儀器

高速離心機(jī)，UV-2100 紫外分光光度計，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，TNBIO高壓細(xì)胞破碎機(jī)，Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng)，玻璃珠(Sigma，0.3 mm)，渦旋振蕩儀,OLYMPUS BX53F相差顯微鏡,佳能 EOS600D，垂直蛋白電泳儀。

2 試驗方法

2.1 酵母細(xì)胞的培養(yǎng)

酵母細(xì)胞接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，160 r/min，30 ℃培養(yǎng)48 h，在600 nm處測定菌液的光密度(Optical Density，OD)，使OD值達(dá)到OD600≈3。分別取4 mL菌液低溫離心收集菌體。

2.2 物理方法

(1) 酸洗玻璃珠法。參照文獻(xiàn)[9-10]方法并適當(dāng)修改。向離心管中加入1 mL含有蛋白酶抑制劑[PMSF]和[NaF]的裂解緩沖液和一定量的過夜酸洗玻璃珠(2/3處)，混勻后于旋渦振蕩儀上振蕩30 s，冰浴30 s，重復(fù)60 次，在離心管底部扎孔，放入新的離心管中，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。

(2) 液氮研磨法。參考文獻(xiàn)[11]方法。向離心管中加入4 mL裂解緩沖液，振蕩混勻后，冰浴20 min。將研缽、杵、藥匙事先液氮預(yù)冷，研磨時注入液氮，期間需常補(bǔ)充液氮以保證研磨過程始終在液氮中進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后, 12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。

(3) 超聲波破碎法。參考李聰?shù)萚12]超聲破碎的參數(shù)并做適當(dāng)調(diào)整。收集菌體，將超聲破碎儀探頭置于離心管液面下約1 cm處，在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。超聲條件為500 W，時間間隔(工作時間∶間歇時間)3∶3(s/s)，工作30 min，超聲完后12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。

(4) 反復(fù)凍融法。按照岳洪霞等[13]報道的方法。向離心管中加入4 mL裂解液緩沖液，振蕩混勻，于-20 ℃冷凍處理20 min, 然后置于沸水浴20 min, 依次循環(huán)3次,12 000 r/min離心10 min，收集上清液。

(5) TNBIO高壓細(xì)胞破碎法。參考文獻(xiàn)[14]的方法。向離心管中加入4 mL裂解液緩沖液，振蕩混勻后，在功率0.75 kW, 壓力150～180 MPa的條件下, 經(jīng)25 s一次性破碎，12 000 r/min離心10 min，收集上清液。

2.3 化學(xué)方法

參考賈艷萍等[15]操作條件并做適當(dāng)調(diào)整。向離心管中加入4 mL裂解液緩沖液和20 mg/mL的蝸牛酶,振蕩混勻后,處理30 min，反應(yīng)結(jié)束后, 12 000 r/min離心10 min，收集上清液。

2.4 破碎率檢測的計算[19]

采用活菌顯微鏡直接計數(shù)法：

式中：α為酵母細(xì)胞的破碎率;A1為破碎前的酵母菌細(xì)胞計數(shù)結(jié)果；A2為破碎后的酵母菌細(xì)胞計數(shù)結(jié)果。將破碎前后的細(xì)胞懸液分別稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后，在顯微鏡下觀察計數(shù)完整細(xì)胞數(shù)，通過計算得到細(xì)胞破碎率，每組統(tǒng)計3 次，取平均值。

2.5 蛋白質(zhì)含量的測定

采用紫外分光光度計通過比色來測定蛋白質(zhì)的含量[5]。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，磷酸鹽緩沖液為空白，在A280 nm處測定OD，根據(jù)OD值與蛋白含量之間的線性關(guān)系測定蛋白質(zhì)含量。所有操作步驟均在室溫狀態(tài)完成。

2.6 SDS-PAGE電泳

采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，5.0% 濃縮膠(pH6.8)和10% 分離膠(pH8.8),上樣量為每孔300 μg蛋白。取一定體積實驗樣品和Marker上樣，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V。電泳結(jié)束后,進(jìn)行G-250染色。

3 結(jié)果與分析

3.1 酵母細(xì)胞破碎前后數(shù)量的觀察和計數(shù)

采用相差顯微鏡(OLYMPUS BX53F) 對破碎前后的酵母菌混懸液進(jìn)行細(xì)胞完整性觀察，如圖1所示。用細(xì)胞計數(shù)板對單位體積完整細(xì)胞計數(shù)。采用活菌顯微鏡直接計數(shù)法算出不同處理細(xì)胞破碎率，評價不同方法處理酵母細(xì)胞裂解效率。不同破碎方法處理樣品細(xì)胞破碎率分別為：反復(fù)凍融法(44.59±4.49)%，超聲波破碎法(67.21±1.43)%，酸洗玻璃珠法(81.25±0.91)%，高壓破碎法(57.69±6.96)%，液氮研磨法(50.3±4.06)%，酶法(53±3.37)%?？芍?，酸洗玻璃珠法對酵母的細(xì)胞破碎率(81.25±0.91)%，比其他5種方法效率都高，反復(fù)凍融法細(xì)胞破碎率(44.59±4.49)%，其效率最低，其他依次為超聲波破碎法>高壓破碎法>酶法>液氮研磨法。酸洗玻璃珠法操作簡便，樣品間不會交叉污染，不需要高壓設(shè)備，期間低溫提取過程有利于蛋白充分溶解。采用高壓細(xì)胞破碎儀破碎酵母，實驗過程中樣品損失較多。

(a)破碎前(b)破碎后

圖1 細(xì)胞破碎效果檢查和計數(shù)(×100)

3.2 不同細(xì)胞破碎法對提取樣品中總蛋白含量影響

建立蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定待測樣品溶液的A280 nm值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算待測樣品蛋白的含量。

由圖2可知，在酵母細(xì)胞中，6種細(xì)胞破碎方法提取的總蛋白含量分別是液氮研磨法為68 mg/mL，超聲波破碎法125.67 mg/mL，酸洗玻璃珠法152.67 mg/mL，酶法132.67 mg/mL，TNBIO高壓破碎法111.67 mg/mL，反復(fù)凍融法40.67 mg/mL，其中酸洗玻璃珠法提取的蛋白含量最高，酶法相比于超聲波破碎法和高壓破碎法蛋白含量較高，可能是前者處理過程中有大量的酶蛋白的參入，而酶法破碎需要更長的時間才對細(xì)胞破碎有效果。通過測定280處吸光值, 可間接反映細(xì)胞中總蛋白的釋放情況以及酵母細(xì)胞的破碎程度，結(jié)合各種方法細(xì)胞破碎率結(jié)果，確定酸洗玻璃珠法作為在后續(xù)實驗中提取酵母細(xì)胞蛋白的的方法。

1-液氮研磨法, 2-超聲波破碎法, 3-酸洗玻璃珠法,4-酶法, 5-TNBIO高壓細(xì)胞破碎法, 6-反復(fù)凍融法

圖2 不同破碎方法對樣品提取液總蛋白含量的影響

3.3 酵母耐5-FC菌株蛋白表達(dá)特性的分析

釀酒酵母野生型菌株BY4741、抗性菌株BY4741R1-5FC和 BY4741R2-5FC經(jīng)過一系列的稀釋(10倍)滴到含有不同濃度5-FC的SC培養(yǎng)基上，對照為不加藥的SC培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)48～72 h。如圖3所示，100 μg/mL的5-FC處理已經(jīng)是野生型菌株BY4741的致死濃度，而對抗性菌株BY4741R1-5FC和BY4741R2-5FC處理濃度達(dá)到200 μg/mL時其仍生長良好，表現(xiàn)極高的耐藥性。

圖3 酵母耐5-FC菌株對藥物脅迫敏感性表型

(a)蛋白酶抑制劑添加組(b)蛋白酶抑制劑未添加組

(c) 蛋白質(zhì)電泳掃描圖譜

圖4 釀酒酵母耐5-FC菌株蛋白表達(dá)特性的SDS-PAGE電泳分析

酵母野生型菌株BY4741、5-FC抗性菌株BY4741R1-5FC和 BY4741R2-5FC經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，取OD600=8的細(xì)胞，用添加酶抑制劑和不添加酶抑制劑的裂解緩沖液分別進(jìn)行酸洗玻璃珠法提取細(xì)胞總蛋白，測定樣品蛋白的含量，添加蛋白酶抑制劑組的總蛋白含量平均值為120 μg/mL，明顯比未添加組(蛋白含量平均值為50 μg/mL)高。樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析,如圖4(a)與4(b)所示，改進(jìn)后提取樣品蛋白條白更多且清晰，說明添加酶抑制劑可以有效減少總蛋白的降解。應(yīng)用凝膠成像圖像分析系統(tǒng)對野生型菌株和抗性菌株總蛋白的三維泳道圖分析，如圖4(c)，可以更明顯地看出，抗性菌株21 kDa相對分子質(zhì)量的蛋白相比于野生型被上調(diào)，而43 kDa的蛋白被下調(diào)，并且在圖4(a)中43 kDa處的蛋白條帶比野生型菌株的條帶弱，也說明此處其對應(yīng)蛋白基因的表達(dá)被下調(diào)。

4 結(jié) 語

實驗室制備少量的細(xì)胞抽提物(<5 mL) 時，機(jī)械破碎是最適宜的方法，能夠得到活性較高的產(chǎn)物[20]。對比分析了液氮研磨、超聲波破碎、酸洗玻璃珠法、反復(fù)凍融法、TNBIO高壓細(xì)胞破碎和破壁酶裂解法。結(jié)果顯示，酸洗玻璃珠震蕩提取法效果最好，特別是破碎處理過程中加入適量的蛋白酶抑制劑，如PMSF、NaF可有效保護(hù)提取蛋白質(zhì)，提高提取物的蛋白含量，所含雜質(zhì)少。用改進(jìn)后的方法研究了酵母耐5-FC菌株蛋白表達(dá)特性，與對照相比，21 kDa和43 kDa的蛋白有明顯的表達(dá)差異，可能與菌株細(xì)胞的耐藥性相關(guān)。結(jié)果將為真菌生物全蛋白提取、表達(dá)特性、耐藥性研究提供借鑒。

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Extraction of Total Protein fromSaccharomycesCerevisiaeand Analysis of Expression Characteristics for Resistant Nucleoside Drug

WEIHong-yan,MENGXiao-qing,HUANGZhi-wei

(College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China)

The purpose of this study was to obtain a simple method of total protein extraction from eukaryotic cells ofSaccharomycescerevisiae. By using this method, the protein expression characteristics of two strains highly resistant to nucleoside drug 5-FC were investigated. In this study, the cell breaking rate and total protein concentration were used as the main indexes to compare and analyze the six yeast cellular breaking methods, including liquid nitrogen grounding, ultrasonic lysis, acid glass beads, enzymatic disruption, freeze-thaw, TNBIO high pressure cell cracker. We found that the breaking rate of the modified acid glass beads reached 81.25%, and the total protein content was 152.67mg/mL. It indicated that this method was the best among the six ones. In addition, the experiment showed that the protease inhibitors like PMSF were properly added to the solution, can better prevent the degradation of the total protein. By using SDS-PAGE, the total protein expression of two yeast strains highly resistant to nucleoside drug 5-FC was analyzed. The result showed that the protein content was high and impurities were less, and the protein bands were more and clearer with the method of acid glass beads. Compared to the untreated control, the expressions of proteins about 21 kDa and 43 kDa were significantly different in the resistant cells. It is suggested that these proteins may be related to the high drug resistance. The results will provide reference for the studies of the total protein extraction, expression characteristics and drug resistance of fungi.

Saccharomy cescerevisiae; cell disruption; protein extraction; drug resistance

2015-11-02

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目(2232014A3-03)；上海市自然科學(xué)基金項目(15ZR1400200)

魏紅巖(1989-)，女，甘肅蘭州人，碩士生，主要研究方向為抗真菌藥物對釀酒酵母的作用機(jī)制及相關(guān)技術(shù)的研發(fā)工作。

Tel.: 18909445124; E-mail.: qq985472678@163.com

黃志偉(1972-)，男，山東臨沂人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為以動物細(xì)胞和酵母作為模式材料，從事藥物遺傳、遺傳網(wǎng)絡(luò)機(jī)制及化合物毒理機(jī)制。

Tel.:021-67792911; E-mail.: zhiweih@ dhu.edu.cn

Q 816

A

1006-7167(2016)08-0040-04