劉云海, 李 鈺, 孫芳嬌, 高炳淼

1.海南醫(yī)學(xué)院理學(xué)院, 海口 571199;2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 海口 571199

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重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB發(fā)酵條件優(yōu)化

劉云海1, 李 鈺1, 孫芳嬌1, 高炳淼2*

1.海南醫(yī)學(xué)院理學(xué)院, ?？?571199;2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 海口 571199

基因工程法能夠簡便易行的合成重組芋螺毒素，發(fā)酵條件會影響其表達(dá)產(chǎn)量。為獲得高效表達(dá)，采用單因素試驗(yàn)法優(yōu)化基因工程大腸桿菌的發(fā)酵條件如發(fā)酵時間、IPTG濃度、初始pH和發(fā)酵溫度等。利用蛋白定量試劑盒測定表達(dá)上清總蛋白量，并用Tricine-SDS-PAGE電泳分離后灰度掃描分析重組芋螺毒素的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵時間為4 h，IPTG濃度為0.4 mmol/L，培養(yǎng)基初始pH為6.0，發(fā)酵溫度為26℃，優(yōu)化后表達(dá)量為19.4 mg/L，研究結(jié)果為大規(guī)模生產(chǎn)芋螺毒素MrVIB奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

芋螺毒素；大腸桿菌；發(fā)酵條件；優(yōu)化

MrVIB屬于μO-家族芋螺毒素，于1995年從大理石芋螺(C.marmoreus)中分離純化獲得了MrVIA和MrVIB。其中MrVIB由31個氨基酸組成且含6個半胱氨酸，作用機(jī)理為阻斷鈉離子通道，具有多種藥理活性[1～3]。由于6個半胱氨酸和多個疏水氨基酸的存在，人工化學(xué)合成MrVIB線性肽后存在氧化折疊形成異構(gòu)體多、分離難度大、產(chǎn)率低和成本高等問題[4]。近年來，基因工程法能夠簡便易行的合成大量的芋螺毒素，尤其是對富含半胱氨酸、易成二硫鍵的多肽具有顯著優(yōu)勢[5]。通過融合不同標(biāo)簽的方式將芋螺毒素基因在大腸桿菌中成功表達(dá)的研究已有較多文獻(xiàn)報道，但通過融合信號肽來引導(dǎo)芋螺毒素在大腸桿菌中分泌表達(dá)的報道較少[6～8]。

本研究的前期工作已將分泌表達(dá)載體pET22b(+)/His-Xa-MrVIB構(gòu)建和鑒定好，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中獲得分泌表達(dá)，但分泌量較低且易形成包涵體[9]。因此，本研究從發(fā)酵時間、IPTG濃度、培養(yǎng)基pH和發(fā)酵溫度等影響因子對重組基因工程菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，獲得最佳分泌發(fā)酵條件，為芋螺毒素MrVIB的藥理活性、新藥研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

恒溫?fù)u床(美國NBS公司)；手持式超聲波細(xì)胞破碎儀(中國Biosafer)；臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma)；垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon 4100)；紫外風(fēng)光光度計(jì)(UV-1800PC)。

IPTG、氨芐抗生素、低分子量蛋白質(zhì)Marker和蛋白定量試劑盒均購自天根生化科技有限公司；SDS-PAGE電泳相關(guān)試劑購自海南合輝實(shí)業(yè)有限公司；其他相關(guān)試劑為國產(chǎn)分析純。

菌株：含有pET22b(+)/His-Xa-MrVIB的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS, 由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存。

LB培養(yǎng)基：其成分為蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生長曲線測定 將基因工程菌BL21(DE3)pLysS(pET22b(+)/His-Xa-MrVIB)在含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置37℃和250 r/min搖床培養(yǎng)過夜后作為種子液。取種子液1 mL接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，按上述條件培養(yǎng)，每隔1 h取1 mL檢測OD值。

1.2.2 基因工程菌發(fā)酵件優(yōu)化方法 基本培養(yǎng)條件：取種子液按1∶100比例接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為37℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG終濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)發(fā)酵4 h。在基本培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上，分別設(shè)置不同的發(fā)酵時間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h)、IPTG濃度(0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0mmol/L)、發(fā)酵溫度(16℃、21℃、26℃、31℃、36℃)和初始pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)來進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 重組芋螺毒素的含量測定 上述不同條件下獲得的樣品進(jìn)行超聲破碎，12 000 r/min離心10 min后留上清，采用蛋白定量試劑盒測定表達(dá)上清中總蛋白濃度，再采用Tricine-SDS-PAGE對上清電泳后進(jìn)行灰度掃描獲得重組芋螺毒素所占上清總蛋白的百分率，計(jì)算重組芋螺毒素濃度。

重組芋螺毒素濃度(mg/L)=上清總蛋白濃度(mg/L)×灰度掃描百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組芋螺毒素表達(dá)的電泳分析

重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB的理論分子量為4.936 kDa，電泳圖顯示在誘導(dǎo)的總蛋白和裂解上清中在4.1～6.5 kDa間具有符合大小的特異條帶，而未誘導(dǎo)菌中對應(yīng)位置無相應(yīng)條帶。說明重組芋螺毒素MrVIB獲得了分泌表達(dá)，但表達(dá)量較低(圖1)。

圖1 Tricine-SDS-PAGE分析重組芋螺毒素的表達(dá)Fig.1 Tricine-SDS-PAGE analysis of recombinant conotoxin expression. M：蛋白分子量Marker; 1：未誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白; 2～6：誘導(dǎo)大腸桿菌的總蛋白; 7：誘導(dǎo)的大腸桿菌上清; 8：誘導(dǎo)大腸桿菌的顆粒蛋白。

2.2 生長曲線

根據(jù)菌液吸光度值繪制重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB基因工程菌的生長曲線如圖2所示。在1%接種量下，重組大腸桿菌生長比較旺盛，接種后2 h進(jìn)入對數(shù)生長期，8 h后大腸桿菌開始進(jìn)入穩(wěn)定期，14 h開始有衰退跡象?？梢姡砑诱T導(dǎo)劑的時機(jī)應(yīng)該選擇在對數(shù)生長旺盛期約4 h，持續(xù)發(fā)酵時間應(yīng)該不超過8 h為宜。

圖2 基因工程大腸桿菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of gene engineering E. coli.

2.3 發(fā)酵時間

重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB表達(dá)量隨發(fā)酵時間延長而逐步增加，在發(fā)酵時間達(dá)4 h時表達(dá)量最高，繼續(xù)延長發(fā)酵時間則重組芋螺毒素表達(dá)量沒有繼續(xù)增加，反而出現(xiàn)了下降趨勢，可能由于發(fā)酵時間過長導(dǎo)致菌體開始衰退死亡，隨之重組芋螺毒素發(fā)生降解現(xiàn)象(圖3)。

圖3 發(fā)酵時間對重組芋螺毒素表達(dá)的影響Fig.3 Effects of fermentation time on the expression of recombinant conotoxin.

2.4 IPTG濃度

重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB表達(dá)量隨著IPTG 濃度的升高而逐漸增加，當(dāng)濃度為0.4 mmol/L時，再增加IPTG 濃度并未出現(xiàn)表達(dá)量的增加的情況，為了節(jié)約IPTG的用量選擇低濃度0.4 mmol/L為最適IPTG濃度(圖4)。

2.5 初始pH

重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB表達(dá)量在不同培養(yǎng)基初始pH條件下，結(jié)果在初始pH為6.0時表達(dá)量最高。從圖5可以看出，pH偏堿時產(chǎn)物表達(dá)相對較少，pH偏酸時有利于產(chǎn)物表達(dá)。

圖4 IPTG濃度對重組芋螺毒素表達(dá)的影響Fig.4 Effects of IPTG concentrations on the expression of recombinant conotoxin.

圖5 初始pH對重組芋螺毒素表達(dá)的影響Fig.5 Effects of the initial pH on the expression of recombinant conotoxin.

2.6 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度對重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB表達(dá)量有較大影響。在26℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)4 h后，可獲得較高的表達(dá)量，溫度過低或過高都不利于重組芋螺毒素的分泌表達(dá)(圖6)。

圖6 發(fā)酵溫度對重組芋螺毒素表達(dá)的影響Fig.6 Effects of fermentation temperatures on the expression of recombinant conotoxin.

2.7 最佳條件下誘導(dǎo)表達(dá)

通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間為4 h，IPTG濃度為0.4 mmol/L，培養(yǎng)基初始pH為6.0，發(fā)酵溫度為26℃，優(yōu)化后表達(dá)量為19.4 mg/L，是優(yōu)化前表達(dá)量的2倍(圖7)。

圖7 發(fā)酵條件優(yōu)化前后重組芋螺毒素表達(dá)量的比較Fig.7 Comparison of expression levels of recombinant conotoxin before and after the optimization of fermentation conditions.

3 討論

目前芋螺毒素表達(dá)的文獻(xiàn)報道逐年增多，從原核表達(dá)系統(tǒng)到真核表達(dá)系統(tǒng)，以及從表達(dá)形成包涵體到分泌表達(dá)的轉(zhuǎn)變等[10]。諸多文獻(xiàn)報道利用基因工程法能夠合成芋螺毒素，能夠防止過度采集天然芋螺導(dǎo)致其資源匱乏、解決天然芋螺毒素分離純化困難和化學(xué)合成成本高且難氧化折疊等問題[4]。但也存在一定的問題：如芋螺毒素分子量較小、二硫鍵豐富、疏水氨基酸含量大等特點(diǎn)導(dǎo)致了其較難在外源表達(dá)系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)。因此，芋螺毒素基因在利用外源宿主合成芋螺毒素時，會受到多種因素影響，其中除了宿主菌本身因素和表達(dá)載體的選擇外，發(fā)酵條件的優(yōu)化也是基因工程法合成芋螺毒素的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。高炳淼等[12]通過改變發(fā)酵條件等影響因子對重組芋螺毒素K41的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，表達(dá)產(chǎn)量大大提高。

本實(shí)驗(yàn)在通過單因素考察各因素對重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB表達(dá)量的影響。其中誘導(dǎo)劑IPTG濃度對于表達(dá)量有較大影響，在IPTG濃度增加到0. 4 mmol/L時，重組芋螺毒素表達(dá)量達(dá)到最大值，為了降低實(shí)驗(yàn)成本沒有必要再增加IPTG的濃度。溫度過高菌體生長較快，合成的過量的外源重組芋螺毒素?zé)o法進(jìn)行正確的剪切和折疊而形成包涵體。溫度過低，菌體生長受到抑制，無法獲得足夠的菌體量，外源重組芋螺毒素表達(dá)量太少。因此，發(fā)酵溫度是影響重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB在大腸桿菌中獲得高效分泌表達(dá)的最重要因素之一[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明26℃時重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB表達(dá)量最高，可確定最佳溫度在26℃左右。該結(jié)果與Pi等[8]采用21℃都是低溫誘導(dǎo)獲得可溶性的重組芋螺毒素。培養(yǎng)基的最佳pH在6.8～7.6之間時，大腸桿菌生長較好，外源蛋白的表達(dá)最佳pH為7.0左右。但本實(shí)驗(yàn)獲得最佳初始pH為6，原因在于酸性培養(yǎng)基中中性蛋白酶的活性受到抑制，有利于重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB的穩(wěn)定性。重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB優(yōu)化后的表達(dá)量為19.4 mg/L，是優(yōu)化前的2倍，也明顯高于前期研究重組芋螺毒素MrVIB-His-tag表達(dá)量5.9 mg/L，但低于可溶性融合芋螺毒素Trx-His-MrVIB的表達(dá)量73.6 mg/L[6,14]。

本研究結(jié)果表明重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間4 h，IPTG濃度0.4 mmol/L, 發(fā)酵溫度26℃，培養(yǎng)基初始pH為6.0。通過對重組芋螺毒素工程菌在搖瓶水平上優(yōu)化了發(fā)酵條件，可以有效提高重組芋螺毒素His-Xa-MrVIB的表達(dá)量，為規(guī)?；凸I(yè)化發(fā)酵奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Optimization of Fermentation Conditions for Recombinant Conotoxin His-Xa-MrVIB

LIU Yun-hai1, LI Yu1, SUN Fang-jiao1, GAO Bing-miao2*

1.CollegeofScience,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China;2.CollegeofPharmacy,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China

Recombinant conotoxins could be simply synthesized by genetic engineering, and fermentation conditions affect its expression yield. To obtain high expression, the fermentation conditions for engineeredE.coliwere optimized by using single factor test methods, such as fermentation time, IPTG concentration, initial pH and fermentation temperature. Expression of total protein in the supernatant was measured using a Protein Assay Kit, which was separated in Tricine-SDS-PAGE and the amount of recombinant conotoxins was analyzed by scanning grayscale analysis. The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows: fermentation time was 4 h, IPTG concentration was 0.4 mmol/L, initial pH was 6.0, and the fermentation temperature was 26℃, the expression yield was 18 mg/L after optimization. The results laied a solid foundation for large-scale production of conotoxin MrVIB.

conotoxin;Escherichiacoli; fermentation condition; optimization

2016-05-03; 接受日期：2016-05-27

海南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(20140089);海南醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(HYCX201327);海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金項(xiàng)目(HY2013-11)資助。

劉云海，本科生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锛夹g(shù)。E-mail:645771683@qq.com。*通信作者：高炳淼， 副教授，研究方向?yàn)槟纤幣c海洋藥物資源開發(fā)。E-mail:gaobingmiao@qq.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.05.08