楊娟艷, 王 芳, 郭 婷, 吳琳琳, 黃紅梅, 許乾麗, 茅向軍*

1.貴陽中醫(yī)學院, 貴陽 550002;2.貴州省食品藥品檢驗所, 貴陽 550004;3.遵義醫(yī)學院, 貴州 遵義 563003;4.貴州醫(yī)科大學, 貴陽 550004

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黔產(chǎn)小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的鑒別及不同部位含量測定

楊娟艷1,2, 王 芳3, 郭 婷4, 吳琳琳4, 黃紅梅1, 許乾麗2, 茅向軍2*

1.貴陽中醫(yī)學院, 貴陽 550002;2.貴州省食品藥品檢驗所, 貴陽 550004;3.遵義醫(yī)學院, 貴州 遵義 563003;4.貴州醫(yī)科大學, 貴陽 550004

對黔產(chǎn)小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D進行薄層色譜研究，并比較了小葉黃楊不同部位環(huán)維黃楊星D的含量，為合理開發(fā)小葉黃楊的藥用資源提供科學依據(jù)。采用薄層色譜法對小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D進行薄層色譜研究，采用高效液相色譜電噴霧檢測器法對小葉黃楊不同部位環(huán)維黃楊星D進行含量測定。結(jié)果顯示：薄層色譜中環(huán)維黃楊星D斑點清晰；高效液相色譜中小葉黃楊不同部位環(huán)維黃楊星D的含量差異很大，粗莖含量最高，葉子含量最低。該方法可用于小葉黃楊的薄層鑒別和含量測定，為了合理開發(fā)和利用黔產(chǎn)小葉黃楊，其藥用部位以粗莖最好。

小葉黃楊；薄層色譜；不同部位；環(huán)維黃楊星D

小葉黃楊 (Buxussinica) 屬黃楊科(Buxaceae)黃楊屬(Buxus)植物，主要用于風濕痹痛、胸腹氣脹、牙痛、胸痹心痛等治療。小葉黃楊中主要含有生物堿類、黃酮類、苷類、羽扇豆烷醇、β-谷甾醇、木脂素、有機酸類等成分[1～5]，其中環(huán)維黃楊星D是小葉黃楊及同屬植物提取精制所得的甾體生物堿[6]，對心衰及心肌細胞受損都具有保護作用[7,8]，可用于心絞痛、心律失常、冠心病等治療[9]。目前，以環(huán)維黃楊星D和小葉黃楊為主要原料的制劑分別有黃楊寧片、寧心滴丸和心腦寧膠囊，該類制劑對心腦血管疾病具有很好的治療效果[10～12]?！吨袊幍洹?2015年版)中對環(huán)維黃楊星D提取物采用非水滴定法測定[13]，該方法測總生物堿靈敏度較低。由于環(huán)維黃楊星D紫外吸收弱，普通的檢測器很難檢測，相關(guān)文獻報道[14,15]對樣品先衍生化，再用HPLC/UV或者HPLC/MS測定，但操作較為繁瑣。

為了合理開發(fā)利用小葉黃楊資源，以及為相關(guān)藥品生產(chǎn)企業(yè)有效藥用的使用提供參考，本文對小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D建立了薄層鑒別方法，同時建立了高效液相色譜電噴霧檢測器 (HPLC-CAD) 法測定黔產(chǎn)小葉黃楊不同部位環(huán)維黃楊星D的含量。該法操作簡單、結(jié)果準確，可用于小葉黃楊的定性研究，為弱紫外吸收的環(huán)維黃楊星D提供了新的檢測方法，同時為小葉黃楊藥用部位的選擇和質(zhì)量控制提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國戴安公司)；Corona電子噴霧檢測器(美國戴安公司)；FE20 pH計和XS205電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(南昌市恒順化驗設(shè)備制備有限公司)；高效硅膠G(青島海洋化工廠)；0.45 μm的微孔濾膜。

1.2 試劑與標準品

環(huán)維黃楊星D (100%，批號：110888-200503，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈為色譜純；試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 小葉黃楊藥材

小葉黃楊藥材于2012-2015年在貴州扎佐、貴定、六屯等地采集，經(jīng)貴州省食品藥品檢驗所中藥標本館李楊館長鑒定為黃楊科黃楊屬植物小葉黃楊[Buxussinica(Rehd. etWils)Cheng]。采集的藥材陰干打粉后，置干燥器中儲存。

1.4 試驗方法

1.4.1 薄層色譜 取小葉黃楊粗粉約4.0 g，置100 mL錐形瓶中，加濃氨水5 mL，拌勻，靜置10 min。加入氯仿25 mL，超聲1 h，放冷，濾過，濾液揮發(fā)至約2 mL。稱取干燥至恒重的環(huán)維黃楊星D對照品適量，用氯仿制成濃度為0.02 mg/mL的對照品溶液。

分別吸取薄層色譜對照品溶液和薄層色譜供試品溶液各5 μL，點于同一高效硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-氨水(10∶1∶0.05∶0.5)作為展開劑，飽和20 min，上行展開1～2 cm后，晾干，再用石油醚(60～90℃)-氯仿-丙酮-甲醇-二乙胺(5.5∶4∶1.4∶0.2∶0.2)二次展開至約7.5 cm，取出，晾干，先后噴以稀碘化鉍鉀溶液和亞硝酸鈉乙醇溶液，揮干薄層板上的殘留溶劑后，置日光燈下檢視。

1.4.2 高效液相色譜 取小葉黃楊粗粉(細枝)約2.0 g，精密稱定，置150 mL錐形瓶中，加氨水5 mL，搖勻，浸潤30 min。加入氯仿40 mL，水浴回流3 h，放冷，過濾，用5 mL三氯甲烷將錐形瓶和濾紙上的殘渣少量多次一并洗入濾紙內(nèi)過濾，濾液水浴蒸干。殘渣用10 mL 0.5%醋酸超聲使其溶解，稀氨水調(diào)節(jié)pH至7.0，分別用氯仿10 mL、醋酸乙酯10 mL萃取，分離并收集水相，水浴蒸干[16]，殘渣用0.05%TFA 溶液溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過。

精密稱取環(huán)維黃楊星D對照品0.012 74 g，置50 mL量瓶中，加適量甲醇溶解后，用0.05% TFA 稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備溶液(0.254 6 mg/mL)。分別精密量取對照品儲備溶液0.1 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL置5 mL量瓶中，用0.05% TFA稀釋至刻度，搖勻，作為線性對照品溶液。再取對照品儲備溶液適量，加0.05%三氟乙酸(0.05% TFA) 溶液制成0.020 mg/mL的對照品溶液，按以下條件測定。

測定條件：色譜柱為 Waters Xbridge? C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)和0.05%TFA(B)；梯度洗脫，0～3 min，12% ～15% A；3～8 min，15%～19% A；8～12 min，19%～24% A；15～18 min，12% A；電噴霧霧化溫度30℃，氣壓35.0 psi；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；柱溫35℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜鑒別

薄層色譜結(jié)果見圖1(彩圖見封三圖版)，供試品色譜圖中，在與對照品色譜(條帶3)相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的橘黃色斑點，分離度良好且斑點清晰，說明薄層色譜適于鑒別環(huán)維黃楊星D。

圖1 小葉黃楊薄層色譜圖Fig.1 The TLC results of Buxus sinica.注：1，2，4，5為小葉黃楊供試品；3為環(huán)維黃楊星D對照品。 (彩圖見封三圖版)

2.2 不同部位含量測定

2.2.1 高效液相色譜測定不同部位的環(huán)維黃楊星D含量 用高效液相色譜法測定小葉黃楊不同部位的環(huán)維黃楊星D含量結(jié)果見圖2，環(huán)維黃楊星D峰形對稱，與相鄰的色譜峰分離度良好。

2.2.2 線性關(guān)系考察 按照1.5.2的方法記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(Y)，對照品濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線(圖3)，得環(huán)維黃楊星D的回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：Y=44.39X+0.1009，r=0.999 5，結(jié)果表明，環(huán)維黃楊星D在0.005 092～0.203 7 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗 精密量取環(huán)維黃楊星D對照品溶液(0.020 mg/mL)適量，按1.5.2的條件連續(xù)進樣6次，計算環(huán)維黃楊星D峰面積的RSD為0.87%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 分別于供試品溶液制備后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按1.5.2的條件測定，計算環(huán)維黃楊星D平均含量為0.078 mg/g，RSD為1.40%，結(jié)果說明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 環(huán)維黃楊星D對照及小葉黃楊各部位供試品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of cyclovirobuxine D in different parts of Buxus sinica. A.對照品；B.小葉黃楊葉；C.小葉黃楊細枝；D.小葉黃楊粗莖

圖3 環(huán)維黃楊星D標準曲線圖Fig.3 The standard curve of cyclovirobuxine D.

2.2.5 重復性試驗 精密稱取同一樣品6份，按1.4.2項下的方法制備成供試品溶液并測定，計算環(huán)維黃楊星D平均含量為0.070 mg/g，RSD為0.99%，結(jié)果表明該方法重復性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的小葉黃楊粗粉共6份，每份1.0 g，分別加入環(huán)維黃楊星D對照品溶液(精密吸取對照品儲備液3.0 mL置于25 mL量瓶中，用0.05% TFA稀釋至刻度)2.3 mL，混勻，按1.4.2項下的方法制備成供試品溶液并測定，計算環(huán)維黃楊星D平均回收率為102.9%，RSD 為3.6%，結(jié)果表明，該方法準確性良好(表1)。

2.2.7 樣品含量測定 將采集到的11批小葉黃楊藥材分為粗莖、細枝和葉3個部位，按1.4.2項下的方法分別制備供試品溶液，每份平行3次，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測定結(jié)果見表2。由表2中數(shù)據(jù)可知，粗莖中環(huán)維黃楊星D含量明顯高于細枝和葉，因此，環(huán)維黃楊星D的提取以粗莖為最好。

表1 小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的加樣回收率試驗 (n=6)

Table 1 Result of sample recovery rate of cyclovirobuxine D inBuxussinica(n=6).

編號稱樣量(g)原含量(mg)加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)11.00370.07020.07030.1448106.121.00280.07020.07030.1442105.331.00590.07040.07030.1458107.341.00430.07030.07030.140099.151.00560.07040.07030.140399.461.00120.07010.07030.1405100.1102.93.6

表2 小葉黃楊不同部位環(huán)維黃楊星D含量測定結(jié)果 (n=3)

Table 2 The cyclovirobuxine D content in different parts ofBuxussinica(n=3).

編號產(chǎn)地及生長年限采集時間粗莖含量(mg/g)RSD(%)細枝含量(mg/g)RSD(%)葉含量(mg/g)RSD(%)1云南大理2012年4月0.1010.610.0631.20.0471.72貴州六屯2014年10月0.1300.260.0860.890.0381.73貴州扎佐2014年12月0.1411.90.0590.230.0231.14貴州六屯2015年8月0.1000.510.0641.10.0382.15云南2015年8月0.3100.890.1341.80.0700.496貴州六屯1年生2015年9月0.2390.500.0721.20.0063.57貴州六屯3年生2015年9月0.1920.830.0541.10.0211.38貴州六屯5年生2015年9月0.4291.50.1291.30.0450.439貴州貴定種植2015年12月0.1610.400.0701.10.0121.110貴州貴定野生2015年12月0.0780.440.0121.50.0143.111貴州六屯2015年12月0.0940.470.0881.30.0520.50

3 討論

薄層色譜條件中，曾采用藥典中環(huán)維黃楊星D檢查項下的展開劑[三氯甲烷-丙酮-二乙胺(5∶4∶0.4)]以及相關(guān)文獻[17]的方法進行研究，色譜效果都不理想，當用極性較大的展開劑[乙酸乙酯-甲醇-氨水-水(10∶1∶0.5∶0.05)]進行一次展開后，再用極性較小的展開劑[石油醚(60～90℃)-氯仿-丙酮-甲醇-二乙胺(5.5∶4∶1.4∶0.2∶0.2)]進行二次展開時，樣品中環(huán)維黃楊星D與鄰近的斑點能較好的分離，且 Rf 值適宜。

本試驗對黔產(chǎn)小葉黃楊粗莖、細枝和葉中環(huán)維黃楊星D含量進行測定，不同部位含量差異較大：粗莖>細枝>葉。小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D含量最高的是粗莖，且粗莖比細枝中環(huán)維黃楊星D的含量高1～6倍左右，葉的含量最低。本研究得出的結(jié)論與報道的一致[18]，而《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》(2003年版)中記載小葉黃楊藥用部位為枝葉，與本文結(jié)果有偏差。在試驗過程中，采集了云南的2批藥材與貴州產(chǎn)小葉黃楊作了對比，結(jié)果表明，黔產(chǎn)小葉黃楊與云南產(chǎn)小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的含量無太大差異。

由表2可知，不同生長年限(1年生、3年生和5年生)的小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的含量有差異，生長年限越長，環(huán)維黃楊星D的含量越高，但1年生和3年生含量差異較小，可能是生長年限在較小的范圍內(nèi)，小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的含量變化不大。

由于環(huán)維黃楊星D在200 nm處有最大吸收，謝昀等[16]采用反相離子對色譜法測定了黃楊木中環(huán)維黃楊星D的含量，本文在試驗過程中也采用紫外檢測器進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用紫外檢測器測定、響應(yīng)小、基線漂移，在測定葉的含量時，由于含量較低，無法準確測定，而用高效液相色譜電噴霧檢測器測定時，響應(yīng)大、基線平穩(wěn)、定量準確。所以本實驗最終采用HPLC-CAD法測定小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的含量。

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The TLC Identification and the Cyclovirobuxine D Content Determination in Different Parts ofBuxussinicafrom Guizhou

YANG Juan-yan1,2, WANG Fang3, GUO Ting4, WU Lin-lin4, HUANG Hong-mei1, XU Qian-li2, MAO Xiang-jun2*

1.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China;2.GuizhouProvincialofFoodandDrugInspectionInstitute,Guiyang550004,China;3.GuizhouZunyiMedicalCollege,GuiZhouZunyi563003,China;4.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China

The paper studied the cyclovirobuxine D content of GuizhouBuxussinicawith thin-layer chromatography(TLC) profile, and compared the cyclovirobuxine D content in different parts of GuizhouBuxussinica, which was expected to provide scientific basis for the development ofBuxussinicaresources. The TLC was used to study cyclovirobuxine D profile inBuxussinica; a HPLC-CAD method was used to measure cyclovirobuxine D content in different parts ofBuxussinica. Results showed that cyclovirobuxine D spots were clear in the TLC; the main stem had the largest cyclovirobuxine D content but the lowest content in leaves. These methods could be used in thin-layer identification and content determination of theBuxussinica. In order to reasonable develop and utilize GuizhouBuxussinica, the best medicinal part is coarse stem.

Buxussinica; TLC; different parts; cyclovirobuxine D

2016-05-27; 接受日期：2016-07-06

貴州省科學技術(shù)基金(黔科合J字[2013]2032號)資助。

楊娟艷，碩士研究生，研究方向為中藥及民族藥質(zhì)量控制與新藥研究。E-mail:1274191418@qq.com。*通信作者：茅向軍，主任藥師，研究方向為藥品質(zhì)量研究。Tel:0851-86808857；E-mail:1074459931@qq.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.05.06