趙同心， 趙洪新， 王升厚

(1.沈陽(yáng)師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018；3.沈陽(yáng)師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,遼寧 沈陽(yáng) 110034)

?

3種不同來(lái)源側(cè)耳品種親緣關(guān)系差異化分析

趙同心1， 趙洪新2， 王升厚3*

(1.沈陽(yáng)師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018；3.沈陽(yáng)師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,遼寧 沈陽(yáng) 110034)

采取拮抗實(shí)驗(yàn)、酯酶同工酶、基因組進(jìn)行多態(tài)性分析(RAPD)、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)對(duì)來(lái)源不同的特大鳳尾菇(Pleurotussajor-caju)、夏秀990(Pleurotusgeesteranus)和黑平A3三個(gè)側(cè)耳品種的親緣關(guān)系進(jìn)行了對(duì)比分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：供試的3個(gè)側(cè)耳品種從形態(tài)學(xué)水平、蛋白質(zhì)水平和分子水平上看，其品種間親緣關(guān)系界定具有一致性。表現(xiàn)為特大鳳尾菇與夏秀990的親緣關(guān)系較近，與黑平A3的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，夏秀990與黑平A3親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究從不同的水平，為食用菌菌種屬間親緣關(guān)系的鑒定提供了綜合分析方法，對(duì)區(qū)分同種異名、雜交親本選擇以及判定雜交結(jié)果具有指導(dǎo)意義。

側(cè)耳；親緣關(guān)系；酯酶同工酶；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)；轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)

側(cè)耳屬真菌常見(jiàn)的品種有糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus，俗稱(chēng)平菇)，金頂側(cè)耳(PleurotuscitrinopileatusSing，俗稱(chēng)榆黃蘑)，漏斗狀側(cè)耳(Pleurotussajor-caju，俗稱(chēng)鳳尾菇)，刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngi，俗稱(chēng)杏鮑菇)，阿魏側(cè)耳(PleurotusferulaeLanzi，俗稱(chēng)白靈菇)等,全世界約有50多種，我國(guó)現(xiàn)有36種[1]，是目前人工栽培數(shù)量較大、范圍較廣的食用大型真菌。隨著人工栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大，特別是選育新品種的種植與推廣，新的商品名稱(chēng)或代號(hào)的菌種不斷出現(xiàn)，出現(xiàn)了來(lái)源各異、同種異名或異種同名的混亂現(xiàn)象。由于不同種源對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的差異，給引種菇農(nóng)造成損失現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。為了對(duì)菌種做到科學(xué)管理、保護(hù)品種產(chǎn)權(quán)、杜絕生產(chǎn)領(lǐng)域的菌種亂引亂種現(xiàn)象，許多研究人員采取不同方法對(duì)側(cè)耳屬進(jìn)行鑒別。黃奕存[2]提出了不同個(gè)體間的拮抗反應(yīng)，從菌絲的形態(tài)學(xué)方面進(jìn)行不同鑒定。李榮春等[3]采用酯酶同工酶方法對(duì)不同菌株間的相似程度進(jìn)行鑒定分析。鄭素月等[4]、張慶華等[5]、湯衛(wèi)真等[6]分別分析了菌株之間酯酶同工酶的差異。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RAPD技術(shù)和ITS技術(shù)用于平菇分類(lèi)。詹才新等[7]、陳明杰等[8]驗(yàn)證了RAPD可用于金針菇和香菇親緣關(guān)系的鑒定，隨后譚琦等[9]用RAPD技術(shù)分析并建立了遺傳相關(guān)聚類(lèi)圖，分析出香菇雜交非對(duì)稱(chēng)雜交后代相似關(guān)系。White等[10]為真菌rRNA基因的ITS設(shè)計(jì)3對(duì)特異引物，即ITS1、ITS4、ITS5，可用于大多數(shù)擔(dān)子菌和子囊菌。譚琦等[11]分析了中國(guó)6個(gè)白靈菇商業(yè)菌株的DNA圖譜，證明6個(gè)菌株為同一個(gè)種。為提高品種間親緣關(guān)系鑒定方法的有效性、可靠性和實(shí)用性，本研究選擇不同來(lái)源側(cè)耳屬的3個(gè)品種為供試菌株，采取拮抗鑒定、酯酶同工酶分析、RAPD多態(tài)性分析和ITS間隔區(qū)序列比對(duì)，從表型、蛋白和分子3個(gè)水平進(jìn)行綜合運(yùn)用，為菌種間親緣關(guān)系鑒定提供一種更為科學(xué)有效的綜合方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 夏秀990(秀珍菇，Pleurotusgeesteranus)、黑平A3(Pleurotusostreatus)、特大鳳尾菇(Pleurotussajor-caju)，由沈陽(yáng)師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀 2 g，硫酸鎂1 g，水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 ①拮抗實(shí)驗(yàn)：取活化好的菌種，在改良PDA培養(yǎng)基上打孔，進(jìn)行兩兩拮抗實(shí)驗(yàn)， 25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。②菌種培養(yǎng)：在液體PDA培養(yǎng)基中，200 r/min、25 ℃培養(yǎng)1周，取菌絲體提取蛋白質(zhì)和DNA。酯酶同工酶的方法參考文獻(xiàn)[12]。DNA提取用CTAB法。

1.2.2 RAPD 和ITS引物篩選與擴(kuò)增 引物如表1所示。引物采取設(shè)計(jì)隨機(jī)引物的方法，從引物庫(kù)中進(jìn)行篩選。引物合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序，由上海生工生物公司完成。 RAPD PCR反應(yīng)體系：10 ×TaqPCR Buffer 2.5 μL，隨機(jī)引物2 μL(2 μmol/L)，TaqDNA聚合酶 0.5 μL，DNA 0.5 μL，dNTP 0.5 μL(10 mmol/L)，去離子無(wú)菌水 14 μL。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性1 min，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸80 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃保持10 min，4 ℃保存。樣品取出置于冰箱-20 ℃中保藏。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠分離PCR產(chǎn)物，回收，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1 RAPD 引物

ITS聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR 擴(kuò)增參考文獻(xiàn)[7]，用2個(gè)真菌引物ITS4和ITS5進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系 10 ×TaqPCR Buffer 2 μL，引物ITS4 0.5 μL，引物ITS5 0.5 μL，TaqDNA聚合酶 0.5 μL，DNA 2 μL，dNTP 0.5 μL(10 mmol/L)，去離子無(wú)菌水 14 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃保持10 min，4 ℃保存，取出樣品冰箱-20 ℃保藏。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。切膠回收PCR產(chǎn)物，將回收的產(chǎn)物連接到T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌E.coli5α的感受態(tài)細(xì)胞中，Amp100抗性篩選，用菌落PCR篩選陽(yáng)性的單菌落。用鼎國(guó)質(zhì)粒提取試劑盒(NEP011-1)提取純化質(zhì)粒后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 用SPASS進(jìn)行數(shù)值分析，MAGE 6.0進(jìn)行ITS序列分析親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗實(shí)驗(yàn)

不同菌種之間均出現(xiàn)拮抗線(圖1)，說(shuō)明3種平菇屬于不同的種。

圖1 3個(gè)平菇品種的拮抗反應(yīng)

2.2 酯酶同工酶譜帶分析

2.2.1 酶譜的類(lèi)型 3個(gè)平菇品種共有18條酯酶同工酶條帶(圖2)，分子量大約在70～170 kDa。 遷移率不同的為13條，其中黑平A3有4條，與其他兩個(gè)品種相比，沒(méi)有相同分子量的條帶，說(shuō)明與其他兩個(gè)品種之間差異較大。夏秀990有5條酶帶，與特大鳳尾菇相同，說(shuō)明二者親緣關(guān)系較近；另外，特大鳳尾菇有自己特異的4條帶，與夏秀990不同?？赡苡捎谔卮篪P尾菇與夏秀990存在進(jìn)化程度上的差異，或者特大鳳尾菇進(jìn)化的快些，導(dǎo)致了較多的特異性條帶。

圖2 酯酶同工酶電泳圖

2.2.2 聯(lián)合系數(shù) 根據(jù)sneath和sokal(1973年)提出的聯(lián)合系數(shù)，可以清楚地反映品種間的親緣關(guān)系。聯(lián)合系數(shù)在0～1之間變化，其值越大兩品種親緣關(guān)系越近，越小親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。特大鳳尾與夏秀990聯(lián)合系數(shù)為0.556，說(shuō)明二者親緣關(guān)系較近，黑平菇的親緣關(guān)系較其他兩個(gè)關(guān)系較遠(yuǎn)，見(jiàn)表2。

表2 3個(gè)平菇品種之間的聯(lián)合系數(shù)

2.3 RAPD 條帶分析

2.3.1 RAPD電泳條帶分析 10個(gè)RAPD 引物對(duì)3種側(cè)耳進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出S23、S88引物進(jìn)行電泳分析。S23引物擴(kuò)增結(jié)果，3個(gè)品種中有2條相同的條帶，特大鳳尾菇與夏秀990帶型一致，其中夏秀990的3條帶和特大鳳尾菇相同，特大鳳尾菇2條特異性條帶，黑平A3特異性條帶2條與另外兩種明顯不同。S88引物結(jié)果顯示，特大鳳尾菇5條帶其中2條與夏秀990相同，特異性條帶2條，夏秀990特異性條帶1條。黑平A3有1條與夏秀990相同，2條特異性條帶。結(jié)果見(jiàn)圖3。總之，根據(jù)RAPD結(jié)果分析可知夏秀990和特大鳳尾菇的條帶較為一致，親緣關(guān)系較近，在分子水平上可以看出它們有共同的特征條帶，不同品種間存在著差異。

圖3 3個(gè)平菇品種之間的RAPD條帶

2.3.2 聚類(lèi)分析 用SPASS進(jìn)行數(shù)值分析，有條帶的為1，無(wú)條帶的為0，得到的聚類(lèi)分析圖見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，特大鳳尾菇和夏秀990親緣關(guān)系較近，與黑平A3進(jìn)化距離遠(yuǎn)。

圖4 3個(gè)平菇品種之間的聚類(lèi)分析Fig.4 Cluster analysis among three kinds Pleurotus spp.

2.4 ITS序列分析

2.4.1 目的片段的擴(kuò)增 用引物ITS4和ITS5擴(kuò)增3個(gè)品種的ITS區(qū),電泳圖譜如圖5所示，可以看出，PCR條帶基本一致，分子量約為680 bp。

圖5 3個(gè)平菇品種ITS PCR產(chǎn)物Fig.5 ITS PCR product among three kinds Pleurotus spp.1：特大鳳尾菇；2：夏秀990；3：黑平A31：Phoenix mushroom;2:Xiaxiu 990;3:Black oyster mushroom A3

2.4.2 ITS分析 對(duì)3種平菇的ITS序列分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)，夏秀990和特大鳳尾菇的序列完全相同，無(wú)堿基差別，而黑平A3與夏秀990、特大鳳尾菇堿基序列差別較大。1～54 bp為18S RNA,55～286 bp為轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1即ITS1，287～444 bp為5.8S RNA，445～642 bp為轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2即ITS2，643～703 bp為28S RNA。

由序列比對(duì)可以看出，在ITS1發(fā)生了堿基替換，第161 bp的C→T，第71 bp的T→C。在ITS2區(qū)序列出現(xiàn)堿基的替換和插入，在第466 bp的A→T,第 469 bp和第496 bp的T→C，第481 bp的T→A，第514 ～515 bp的TG→CT, 第517 bp和第521 bp A→G，在469 bp和470 bp之間插入了序列GGTTTTTTTCC。

2.4.3 平菇的進(jìn)化樹(shù) 用MAGE 6.0進(jìn)行親緣關(guān)系遠(yuǎn)近分析，結(jié)果顯示：1號(hào)的特大鳳尾菇和2號(hào)的夏秀990親緣關(guān)系較近，3號(hào)黑平A3親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究通過(guò)對(duì)ITS區(qū)域的擴(kuò)增測(cè)序, 分析平菇不同品種間的親緣關(guān)系并將平菇ITS區(qū)域序列登錄到核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)分別為KP877605、KP877606、KP877607，見(jiàn)圖6。

圖6 3個(gè)平菇品種ITS聚類(lèi)分析Fig.6 ITS Cluster Analysis among three kinds Pleurotus spp.

3 討 論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)的拮抗反應(yīng)，蛋白質(zhì)水平酯酶同工酶，分子水平的RAPD和ITS區(qū)序列分析得出了供試3種側(cè)耳屬品種間的親緣關(guān)系。拮抗反應(yīng)是真菌鑒定的常用手段，但往往不能有效區(qū)分出兩個(gè)在遺傳上有相似背景或親緣關(guān)系很近的菌株，可作為初級(jí)分類(lèi)的方法；同工酶是由不同等位基因或不同基因位點(diǎn)編碼的[13]，特別是在屬內(nèi)種間及品種之間的分類(lèi)鑒定是非常有效的。同工酶技術(shù)也具有易受培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)溫度的影響而表現(xiàn)出不一致性的缺點(diǎn)，并且不能直接反映 DNA 水平的情況[14]。因此做好分子水平的鑒定就成為完整實(shí)驗(yàn)方法的重要組成。本研究從ITS序列比對(duì)結(jié)果看，特大鳳尾菇和夏秀990序列完全相同，說(shuō)明它們的進(jìn)化程度一致，同時(shí)也說(shuō)明了ITS區(qū)序列長(zhǎng)度有限，相對(duì)全基因組而言，有限的序列信息要想真正反映物種的進(jìn)化規(guī)律，還需要其他的形態(tài)學(xué)等方面的數(shù)據(jù)。從序列比對(duì)可以看出的ITS區(qū)域的差異主要表現(xiàn)在ITS2區(qū)域，與司源等[15]的ITS1相對(duì)變化、ITS2相對(duì)保守的觀點(diǎn)不同，進(jìn)化的快慢可能是由于不同的生物ITS區(qū)，但是ITS2相對(duì)變化這一觀點(diǎn)與Yao等[16]將ITS2區(qū)域作為動(dòng)植物的DNA標(biāo)記觀點(diǎn)一致。

本研究從宏觀水平、蛋白質(zhì)水平和DNA水平等多個(gè)層面說(shuō)明了平菇之間的進(jìn)化程度與親緣關(guān)系，同時(shí)也證明進(jìn)行分類(lèi)時(shí)應(yīng)結(jié)合多種手段來(lái)說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系。

[1] 圖力古爾,李玉.我國(guó)側(cè)耳屬真菌的種類(lèi)資源及其生態(tài)地理分布[J].中國(guó)食用菌,2001,20(5):8-9.

[2] 黃亦存.高等擔(dān)子菌的性非親和性系統(tǒng)和體細(xì)胞非親和性系統(tǒng)在遺傳多樣性保存中的作用[J].生物多樣性,1996,4(1):41-44.

[3] 李榮春,陳嚴(yán)平.五種牛肝菌酯酶和過(guò)氧化物酶的同工酶研究[J].中國(guó)食用菌,1999,18(3)1:5-19.

[4] 鄭素月,張金霞,黃晨陽(yáng),等.中國(guó)栽培平菇的酯酶同工酶分析[J].食用菌學(xué)報(bào),2003,10(4):1-6.

[5] 張慶華,趙新海,鐘麗娟,等.酯酶同工酶分析鑒別生產(chǎn)用平菇菌種真實(shí)性研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2009，26(6):10-12.

[6] 湯衛(wèi)真,鄭國(guó)揚(yáng),畢志樹(shù).利用同工酶酶譜法鑒別側(cè)耳屬的種和菌株[J].廣西植物,1987,7(2):143-145.

[7] 詹才新,朱蘭寶,楊新美.RAPD技術(shù)在金針菇雜交育種中的應(yīng)用[J].食用菌學(xué)報(bào),1995,2(1):1-7.

[8] 陳明杰,譚琪,汪昭月,等.應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)香菇融合菌株進(jìn)行遺傳鑒定[J].食用菌學(xué)報(bào),1997,4(4):17-20.

[9] 譚琦,潘迎捷,陳明杰,等.香菇遺傳研究和菌種選育的現(xiàn)狀及發(fā)展[J].食用菌學(xué)報(bào),1998,5(3):6-11.

[10]White T J,Bruns T D, Lee.S. ,et al.Analysis of phytogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes[C].INNISMA.PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications.New York Academic,1990:315-322.

[11]譚琦,楊建明,陳明杰,等.用RAPD技術(shù)對(duì)香菇非對(duì)稱(chēng)雜交后代遺傳性狀的分析[J].食用菌學(xué)報(bào),2001,8(2):10-14.

[12]胡能書(shū),萬(wàn)國(guó)賢.同工酶技術(shù)及應(yīng)用[M].長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1985:49-181.

[13]熊全沫.同工酶電泳數(shù)據(jù)的分析及其種群遺傳上的應(yīng)用[J].遺傳,1980,8(1):1-5.

[14]Gottlieb L D. Conservation and duplication of isozymes in plants[J].Science,1982,216(23):373-380.

[15]司源,郭亦琦,孔航輝.基于ORF Finder方法的植物ITS片段結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2005, 20(5):54.

[16]Yao H,Song J,Liu C,et al.Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animal[J].PLoS ONE,2010,5(10):13102.

Found projecd: National Natural Science Foundation of China (31160371, 30860165); National Key Technology Research and

Development Program of China (2012BAD19B02); National High Technology Research and Development Program of China (863

Program) ( 2011AA10A206)

Brief introduction to the writer: Cheng liang male, Ph D student. Research field: natural product.

Tel:0971-5313283, E-mail:liangcheng1979@163.com

Draft accepted date: 2015-04-03; Revision returned date: 2015-08-31

Alliance Variance Analysis of ThreePleurotusSpeciesfrom Different Sources

ZHAO Tong-xin1, ZHAO Hong-xin2, WANG Sheng-hou3

(1.Coll.ofChem. &LifeSci.ShenyangNormalUni.,Shenyang110034; 2.Coll.ofLifeSci.ZhejiangSci-Tech.Uni.,Hangzhou310018; 3.Exper’lTeach.Ctr.,ShenyangNormalUni.,Shenyang110034)

In this study the alliance among threePleurotusofphoenixtail mushroom,xiaxiu990 andblackoyster mushroom A3 from different sources with different morphology were carried out contrast analysis. The results showed that the tested threePleurotusspecies possessed the congruity among species alliance definition in morphology level, protein level and molecular level. The alliance betweenphoenixtail mushroom andxiaxiu990 displayed closer, but further fromblackoyster mushroom A3, and the alliance betweenxiaxiu990 andblackoyster mushroom A3 was further. This study provided comprehensive methods to analyze the characterization of the alliance of edible fungi of inter-genus in different levels, and had directive significance to separate different name of the same species, to select hybrid parents, and to judge the results of hybridization.

Pleurotusostreatus; alliance; esterase isozyme; random amplified polymorphic DNA (RAPD); transcribed spacer sequence (ITS)

遼寧省科學(xué)事業(yè)公益項(xiàng)目(2014003020)

趙同心 女，碩士研究生。研究方向?yàn)槲⑸镏扑?。E-mail:txzhao@sina.com

* 通訊作者。男，教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事藥用真菌資源的開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：wshhwq2009@163.comn

2015-06-01；

2015-08-03

Q93-331

A

1005-7021(2016)02-0062-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.011