周 皓, 車 鑫, 彭 麗, 王 娜, 柏 旭

(吉林大學(xué)組合化學(xué)與創(chuàng)新藥物研究中心, 吉林大學(xué)藥學(xué)院, 長(zhǎng)春 130021)

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嘧啶并嘧啶酮類化合物作為L(zhǎng)3MBTL1選擇性絡(luò)合劑的設(shè)計(jì)與合成

周 皓, 車 鑫, 彭 麗, 王 娜, 柏 旭

(吉林大學(xué)組合化學(xué)與創(chuàng)新藥物研究中心, 吉林大學(xué)藥學(xué)院, 長(zhǎng)春 130021)

用嘧啶并嘧啶酮替換Lethal 3 malignant brain tumor 1(L3MBTL1)小分子絡(luò)合劑UNC669分子中的芳香部分, 合成了一系列嘧啶并嘧啶酮類化合物. 采用同質(zhì)鄰近發(fā)光放大法(AlphaScreen?)測(cè)試了其活性, 得到IC50值為1.21 μmol/L的化合物8a; 通過(guò)對(duì)其5位基團(tuán)進(jìn)行改造, 最終獲得了3個(gè)選擇性L3MBTL1絡(luò)合劑8g, 8o與8p, 它們僅對(duì)L3MBTL1有活性, 對(duì)其同源蛋白L3MBTL3在內(nèi)的其它甲基化識(shí)別蛋白則無(wú)活性.

嘧啶并嘧啶酮; L3MBTL1; 選擇性絡(luò)合劑

Fig.1 Structure of UNC669 and UNC926

近十多年來(lái), 表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域中的調(diào)節(jié)蛋白逐漸成為新藥研究的熱門靶點(diǎn)[1～3]. 信號(hào)識(shí)別蛋白是調(diào)節(jié)蛋白中的一大類, 它能夠識(shí)別染色體中組蛋白上被共價(jià)修飾的氨基酸殘基, 從而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)蛋白之間相互作用的功能[4]. 組蛋白上可被修飾的氨基酸殘基主要包括賴氨酸和精氨酸2大類, 而共價(jià)修飾這2大類殘基的方式主要有甲基化、 乙?；?、 磷酸化和泛素化等[5]. 大約有超過(guò)200種蛋白能夠識(shí)別甲基化修飾的組蛋白賴氨酸殘基, 這個(gè)龐大的家族主要被分為3大類: 植物同源域(PHD)蛋白, WD40(Tryptophan-aspartic acid 40)重復(fù)域蛋白和“國(guó)王家族”蛋白. “國(guó)王家族”主要由Tudor結(jié)構(gòu)域、 克羅莫結(jié)構(gòu)域(Chromodomain)、 PWWP(Pro-Trp-Trp-Pro)結(jié)構(gòu)域和惡性腦瘤結(jié)構(gòu)域(MBT)蛋白家族組成[6].

Lethal 3 malignant brain tumor 1(L3MBTL1)[7]是MBT家族中研究相對(duì)成熟的蛋白之一, 其生物學(xué)功能越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn). Trojer等[8]證明L3MBTL1的缺失能夠促進(jìn)造血祖細(xì)胞分化為紅細(xì)胞. 通過(guò)與染色體結(jié)合, L3MBTL1能夠抑制E2F-調(diào)控基因, 例如與致癌和成長(zhǎng)有關(guān)的c-myc基因. 非組蛋白p53可由賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶Set8/PR-Set7共價(jià)修飾得到單甲基化的p53(p53K382me1), 而L3MBTL1能夠與p53K382me1結(jié)合, 從而抑制p53反式激活其靶基因[9]. 雖然L3MBTL1的生物學(xué)作用被逐漸認(rèn)識(shí), 但是其許多生物學(xué)功能還有待探索, 而開發(fā)能與其絡(luò)合的小分子探針不僅可以幫助認(rèn)識(shí)其生物學(xué)功能, 還能夠證明其靶點(diǎn)成藥性.

2011年, Herold等[10,11]發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)L3MBTL1小分子絡(luò)合劑UNC669(1a), 隨后通過(guò)構(gòu)效關(guān)系研究得到了化合物UNC926(1b), 結(jié)構(gòu)如圖1所示. 化合物1a和1b都含有1個(gè)4-吡咯烷基哌啶基團(tuán), 該基團(tuán)能夠模仿組蛋白甲基化賴氨酸殘基與L3MBTL1的芳香口袋結(jié)合, 這種結(jié)合力主要是質(zhì)子化后的吡咯烷與口袋中的天冬氨酸355形成的氫鍵和鹽橋, 此外該基團(tuán)與芳香殘基之間的疏水作用和陽(yáng)離子π作用也是導(dǎo)致二者結(jié)合的因素.

含氮芳雜環(huán)是許多活性分子都含有的結(jié)構(gòu)片段[12～14], 本課題組[15～19]一直致力于構(gòu)建新穎的芳香雜環(huán)化合物分子庫(kù), 并已報(bào)道了多種快速構(gòu)建嘧啶并環(huán)的方法. 本文采用嘧啶并環(huán)替換化合物1a和1b中芳香環(huán)部分的策略, 開發(fā)了L3MBTL1小分子探針, 發(fā)現(xiàn)了一系列可作為選擇性的L3MBTL1小分子絡(luò)合劑的以嘧啶并[4,5-d]嘧啶-4(3H)-酮為骨架的化合物.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

二乙苯胺(PhNEt2)、 三氯氧磷(POCl3)、 二(異丙基)氨基鋰(LDA)、 四氫呋喃(THF)、 二氯亞砜(SOCl3)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、 醋酸(HOAc)、 乙腈、 三乙胺(TEA)、 正丁醇(n-BuOH)、 甲醇鈉(MeONa)、 苯酚、 碳酸鉀、 二氧六環(huán)、 雙(三環(huán)己基膦)二氯化鈀[Pd(PCy3)2Cl2]、 鋅粉、 間氯過(guò)氧苯甲酸(mCPBA)和二氯甲烷(DCM)均為分析純或化學(xué)純, 除特殊注明外未經(jīng)進(jìn)一步處理.

Agilent 1100型液質(zhì)聯(lián)機(jī)(LC/MS)和Alltech ELSD 2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司); Varian 300 MHz核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo), 美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司); XT5型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(微電腦控溫型, 未校準(zhǔn), 北京科儀電光儀器廠); 薄層色譜用硅膠G(臺(tái)州市路橋四甲生化塑料品廠); 柱色譜用硅膠(200～300目, 青島海洋化工有限公司); Agilent 1290-micrOTOF QⅡ型高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)布魯克·道爾頓公司); Bruker IFS 66V/S 型紅外光譜儀(德國(guó)布魯克公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

嘧啶并嘧啶酮衍生化合物的合成路線如Scheme 1所示.

Scheme 1 General syntheses of target compounds

1.2.1 化合物3的合成 參照文獻(xiàn)[20]方法合成化合物3, 產(chǎn)率43%, m. p. 164～166 ℃(文獻(xiàn)值[21]: 160～163 ℃).

1.2.2 化合物4的合成 參照文獻(xiàn)[21]方法合成化合物4.

1.2.3 化合物5的合成 將化合物4(1.87 g, 5.96 mmol)溶于30 mL四氫呋喃中, 加熱至回流, 向反應(yīng)體系中持續(xù)通入氨氣1 h. 反應(yīng)完全后, 停止通入氨氣并將反應(yīng)液冷卻至室溫, 過(guò)濾并用乙酸乙酯洗滌濾餅, 即得化合物5.

1.2.4 化合物6的合成 將化合物5(1.0 g, 3.4 mmol)和乙酸(0.39 mL, 6.8 mmol)溶于30 mL乙腈中, 加入三氯氧磷(1.3 mL, 13.6 mmol), 加熱至回流反應(yīng)8 h. 反應(yīng)完全后, 冷卻至室溫, 并將反應(yīng)液緩慢加入碎冰中, 用Na2CO3調(diào)節(jié)pH值至9, 用乙酸乙酯(60 mL×3)萃取, 合并有機(jī)相, 用無(wú)水硫酸鈉干燥, 過(guò)濾蒸干溶劑得到粗品, 經(jīng)快速柱層析 [V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1]分離, 即得化合物6.

1.2.5 化合物7a～7p的合成 參照文獻(xiàn)[15]方法合成化合物7a～7k, 參照文獻(xiàn)[22]方法合成化合物7l, 參照文獻(xiàn)[23]方法合成化合物7m. 將化合物6(300 mg, 0.94 mmol)溶于4 mL二氧六環(huán)中, 冰浴下分3批加入2-甲氧基乙醇鈉(111 mg, 1.13 mmol), 將反應(yīng)體系升至室溫并攪拌2 h. 反應(yīng)完畢, 用20 mL水稀釋, 二氯甲烷(20 mL×3)萃取, 合并有機(jī)相并用無(wú)水硫酸鈉干燥. 將有機(jī)相中的溶劑蒸除, 經(jīng)快速柱層析[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1]分離, 得到化合物7n. 將苯酚(177 mg, 1.89 mmol)溶于4 mL二氧六環(huán)中, 加入無(wú)水碳酸鉀(217 mg, 1.58 mmol), 將反應(yīng)體系升溫至80 ℃并攪拌0.5 h; 加入化合物6(200 mg, 0.63 mmol). 反應(yīng)15 h后, 將反應(yīng)體系用15 mL水稀釋, 二氯甲烷(20 mL×3)萃取. 合并有機(jī)相, 用無(wú)水硫酸鈉干燥, 將有機(jī)相中的溶劑蒸除, 經(jīng)快速柱層析 [V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1] 分離, 得到化合物7o. 將化合物6(200 mg, 0.64 mmol)和苯硼酸頻哪醇酯(252 mg, 1.28 mmol)溶于4 mL二氧六環(huán)中, 加入碳酸鉀(353 mg, 2.56 mmol), 抽出空氣并用氮?dú)庵脫Q, 反復(fù)操作3次后加入雙(三環(huán)己基膦)二氯化鈀(24 g, 0.032 mmol), 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)30 h. 反應(yīng)結(jié)束后, 用硅藻土過(guò)濾, 濾液用10 mL水稀釋, 分出水相后, 用二氯甲烷(20 mL×3)萃取. 合并有機(jī)相, 用無(wú)水硫酸鈉干燥, 將有機(jī)相中的溶劑蒸除, 經(jīng)快速柱層析[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1]分離得到化合物7p.

1.2.6 化合物8a～8p的合成 將間氯過(guò)氧苯甲酸(114 mg, 0.56 mmol)在超聲下溶于4 mL二氯甲烷中, 于0 ℃下滴加溶有化合物7a～7p(0.28 mmol)的2 mL二氯甲烷溶液中, 升溫至室溫, 攪拌3 h后, 用亞硫酸氫鈉猝滅反應(yīng). 將猝滅后的混合物用15 mL飽和碳酸氫鈉洗滌, 水相用二氯甲烷(15 mL×3)萃取, 合并有機(jī)相并用無(wú)水硫酸鈉干燥, 蒸干溶劑得到氧化中間體粗品. 將反應(yīng)粗品溶于6 mL四氫呋喃中, 加入4-(吡咯烷-1-基)哌啶(65 mg, 0.42 mmol), 室溫下攪拌8 h. 反應(yīng)完全后, 加入10 mL水稀釋, 用二氯甲烷(15 mL×3)萃取， 合并有機(jī)相并用飽和碳酸氫鈉洗滌, 無(wú)水硫酸鈉干燥, 過(guò)濾蒸干溶劑得到粗品, 粗品經(jīng)快速柱層析[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(氨水)=200∶1∶10]分離得到目標(biāo)化合物8a～8p.

所有化合物的理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)見表1和表2.

Table 1 Melting points, MS, HRMS and IR data of compounds 4—6, 7a—7p and 8a—8p

Continued

Table 2 1H NMR and 13C NMR data of compounds 4—6, 7a—7p and 8a—8p*

Continued

Continued

2 結(jié)果與討論

2.1 合 成

以2-甲硫基-4,6-二氯嘧啶為起始原料, 通過(guò)上羧基、 酰胺化、 氨基親核取代和關(guān)環(huán)等4步反應(yīng)合成了嘧啶并嘧啶酮母核, 開發(fā)了一種合成該類化合物的新型有效方法. 然后, 對(duì)母核5位氯原子進(jìn)行取代, 再將7位甲硫基氧化成砜(亞砜)后直接進(jìn)行親核取代即可得到化合物8a～8p, 這些新化合物的結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H NMR,13C NMR和MS確證.

2.2 活性結(jié)果與討論

嘧啶并[4,5-d]嘧啶-4(3H)-酮系列化合物的活性測(cè)試由合作方美國(guó)北卡羅來(lái)納大學(xué)教堂山分校(University of North Carolina at Chapel Hill)的Stephen V. Frye課題組完成. 除L3MBTL1蛋白外, 另外選擇了7種不同家族的甲基化賴氨酸識(shí)別蛋白進(jìn)行測(cè)試: L3MBTL1的同源蛋白L3MBTL3[24]、 MBT家族成員MBTD1[25]、 Chromodomain家族成員CBX7[26]、 PHD家族成員JARID1A[27]、 PHF1[28]、 串聯(lián)Tudor 域蛋白UHRF1-TTD[29]和53BP1[30].

活性測(cè)試采用同質(zhì)鄰近發(fā)光放大法(AlphaScreen?)[31]對(duì)L3MBTL1, 53BP1, MBTD1, CBX7, JARID1A, PHF1和UHRF1-TTD這7種蛋白進(jìn)行活性初篩, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3. 由于AlphaScreen?測(cè)試方法針對(duì)L3MBTL3測(cè)試的重復(fù)性較差, 故對(duì)其采用LANCE?TR-FRET測(cè)試方法, 其與AlphaScreen測(cè)試方法線性相關(guān)(R2=0.8)[32]. 對(duì)初篩實(shí)驗(yàn)中IC50(半數(shù)抑制濃度)<1 μmol/L的化合物, 用等溫滴定量熱法(ITC)[33]進(jìn)一步確認(rèn)其活性.

Table 3 IC50 values determined by AlphaScreen? Assay and LANCE TR-FRET assaya

通過(guò)篩選得到活性化合物8a對(duì)L3MBTL1的IC50值達(dá)到了1.21 μmol/L, 再經(jīng)過(guò)ITC活性測(cè)試確認(rèn)其解離常數(shù)Kd=2.4 μmol/L, 對(duì)L3MBTL1表現(xiàn)出良好的抑制活性. 在此基礎(chǔ)上, 嘗試改變其5位基團(tuán)來(lái)提高其活性或者選擇性. 首先, 嘗試在5位引入不同的氨基取代基團(tuán)(化合物8b～8k), 其中5位引入甲氨基(化合物8b)、 二甲氨基(化合物8c)、 異丙胺基(化合物8d)和二乙胺基(化合物8e)分別導(dǎo)致3, 15, 14和10倍的活性降低(相比于化合物8a, 下同); 另外, 還嘗試引入環(huán)狀胺基, 當(dāng)5位上是吡咯烷基(化合物8f)和1-甲基哌啶基-4-氨基(化合物8h)時(shí), 活性分別降低約11倍和6倍; 但當(dāng)引入嗎啡啉環(huán)(化合物8g)時(shí), 化合物保持了活性, 且對(duì)L3MBTL1表現(xiàn)出良好的選擇性[IC50(L3MBTL3)/IC50(L3MBTL1)>37]. 嘗試在5位引入鏈狀胺得到化合物8i和8j, 但活性分別降低7和9倍; 5位引入苯胺基(化合物8k)使活性降低了4倍. 然后, 引入非堿性基團(tuán)(化合物8l～8p), 其中用氫原子代替5位的氨基(化合物8l)導(dǎo)致對(duì)L3MBTL1活性降低7倍; 5位引入甲氧基(化合物8m)和2-甲氧基乙氧基(化合物8n)使活性分別降低3倍和4倍. 最后, 母核的5位引入苯酚(化合物8o)和苯基(化合物8p)使活性分別降低了2倍和3倍, 雖然對(duì)L3MBTL1活性略有降低, 但對(duì)其它甲基化識(shí)別蛋白無(wú)活性, 即表現(xiàn)出良好的選擇性[化合物8o, IC50(L3MBTL3)/IC50(L3MBTL1)>45, 化合物8p, IC50(L3MBTL3)/IC50(L3MBTL1)>29]. 綜上所述, 通過(guò)對(duì)化合物8a的5位進(jìn)行改造, 得到了3個(gè)選擇性L3MBTL1絡(luò)合劑8g, 8o和8p.

3 結(jié) 論

以L3MBTL1絡(luò)合劑1a和1b為基礎(chǔ), 用嘧啶并[4,5-d]嘧啶-4(3H)-酮替換這2個(gè)化合物的芳香片段, 得到IC50值為1.21 μmol/L的化合物8a, 通過(guò)改變化合物8a的5-位基團(tuán)合成了15個(gè)衍生物, 并在其中找到了選擇性絡(luò)合劑8g, 8o與8p. 通過(guò)測(cè)試這些化合物對(duì)包括L3MBTL1在內(nèi)的8個(gè)甲基化識(shí)別蛋白的活性發(fā)現(xiàn), 其活性不僅與化合物1a和1b相當(dāng), 而且對(duì)其它的甲基化識(shí)別蛋白包括與L3MBTL1同源蛋白L3MBTL3沒(méi)有活性, 這些選擇性絡(luò)合劑的發(fā)現(xiàn)有可能用于探索L3MBTL1和其同源蛋白的功能差異, 也為進(jìn)一步開發(fā)L3MBTL1小分子絡(luò)合劑提供了新的線索.

感謝北卡羅來(lái)納大學(xué)教堂山分校(University of North Carolina at Chapel Hill) Stephen V. Frye課題組的Lindsey Ingerman James, Brandi Baughman和Jacqueline Norris在生物活性測(cè)試上提供的幫助.

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Design and Synthesis of Pyrimido[4,5-d]pyrimidin-4(3H)-ones as Selective L3MBTL1 Binders?

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81072526) and the Science and Technology Development Plan of Jilin Province, China(No.20140309010YY).

ZHOU Hao, CHE Xin, PENG Li, WANG Na, BAI Xu*

(TheCenterforCombinatorialChemistryandDrugDiscovery,SchoolofPharmaceuticalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Histone methylation is a key epigenetic mark, and its deregulation is linked to many diseases. Malignant brain tumor(MBT) domain protein is one of the proteins that could read methylated lysine(Kme) of histones. Lethal 3 malignant brain tumor 1(L3MBTL1), a member of the MBT family, is related to transcriptional repression, erythroid differentiation and tumor formation. Developing a potent and selective inhibitor of L3MBTL1 can help explain the regulatory mechanisms and validate its drugability. UNC669 was reported as the first small molecule ligands for a methyl-lysine binding domain. A series of compounds was synthesized by replacing its aromatic component with pyrimido[4,5-d]pyrimidin-4(3H)-ones. Screening these compounds by AlphaScreen? led to a hit compound 8a(IC50=1.21 μmol/L). Exploring 5-position of compound 8a generated three selective and potent L3MBTL1 binders(compounds 8g, 8o and 8p), which showed no significant activity against the other Kme reader proteins in the panel, even its closely related MBT containing proteins, L3MBTL3.

Pyrimido[4,5-d]pyrimidin-4(3H)-ones; Lethal 3 malignant brain tumor 1; Selective binder

2016-04-01.

日期: 2016-06-17.

國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 81072526)和吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 20140309010YY)資助.

10.7503/cjcu20160203

O621

A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 柏 旭, 男, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事多樣性導(dǎo)向合成與創(chuàng)新藥物研究. E-mail: xbai@jlu.edu.cn