李婉明, 方 瑾

(中國醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,細(xì)胞生物學(xué)教研室, 沈陽 110122)

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核酸適配子探針對轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞的多靶點(diǎn)成像及其靶標(biāo)的定量分析

李婉明, 方 瑾

(中國醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,細(xì)胞生物學(xué)教研室, 沈陽 110122)

利用核酸適配子對腫瘤細(xì)胞的高親和力靶向識別功能以及量子點(diǎn)的高熒光發(fā)射強(qiáng)度和光穩(wěn)定性等特性, 制備了識別不同靶點(diǎn)的核酸適配子探針, 將其聯(lián)合使用實(shí)現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的多靶點(diǎn)成像及其靶標(biāo)的定量分析. 使用通過Cell-SELEX 技術(shù)篩選得到的可特異性識別轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞系LoVo的7個核酸適配子, 分別與量子點(diǎn)QD605偶聯(lián)制備分子探針. 基于流式細(xì)胞術(shù)的競爭實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 7個探針可特異性識別靶細(xì)胞的不同靶點(diǎn), 相互之間無識別干擾. 對靶細(xì)胞的熒光成像表明, 與單一探針相比, 多個探針聯(lián)合使用可明顯提高細(xì)胞表面的熒光信號強(qiáng)度, 且陽性細(xì)胞檢出率明顯增多, 顯示出更高的檢測靈敏度. 使用流式細(xì)胞術(shù)及熒光成像定量方法分析了7個探針對不同轉(zhuǎn)移特性大腸癌細(xì)胞系的識別能力, 結(jié)果表明, 多個探針聯(lián)合使用可有效評價(jià)大腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能. 本研究證實(shí)通過多個核酸適配子探針的聯(lián)合使用可有效提高對靶細(xì)胞識別的靈敏度和準(zhǔn)確性, 為核酸適配子的廣泛應(yīng)用及大腸癌的靶向診斷提供了新的思路和手段.

核酸適配子; 轉(zhuǎn)移性大腸癌; 多靶點(diǎn); 量子點(diǎn); 靶向成像

目前, 腫瘤已成為威脅人類健康的重大疾病, 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是病人的主要死亡原因. 大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤, 就診時50%以上的患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移, 預(yù)后較差[1]. 轉(zhuǎn)移性大腸癌臨床早期診斷面臨的主要瓶頸是分子探針的匱乏[2]. 核酸適配子(Aptamer)的發(fā)現(xiàn), 尤其是對癌細(xì)胞和腫瘤標(biāo)記物具有特異性結(jié)合作用的核酸適配子, 為設(shè)計(jì)更高效、 更靈敏的探針提供了有效的解決方法[3～5].

核酸適配子于1990年被首次報(bào)道[6～8], 是經(jīng)SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 技術(shù)篩選得到的短的寡核苷酸序列(DNA或RNA序列), 其自身能折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)并與靶標(biāo)特異性結(jié)合, 常被稱為“分子抗體”. 由于其具有靶分子廣泛、 特異性和親和力強(qiáng)、 穩(wěn)定性好、 易于合成和修飾標(biāo)記等一系列的優(yōu)良性能, 在實(shí)際應(yīng)用方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于蛋白類抗體[9～11]. Cell-SELEX[12]篩選方法是以活細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行體外篩選, 所獲得的核酸適配子能特異性識別細(xì)胞表面的某些標(biāo)記物, 進(jìn)而與細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合. 此外, 消減策略的引入顯著提高了獲得高特異性核酸適配子的可能, 使得基于核酸適配子的分子探針能夠更有效地區(qū)分正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間或腫瘤細(xì)胞之間的分子差異, 為準(zhǔn)確進(jìn)行臨床診斷提供高效的分子工具[13].

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多基因、 多步驟和多個信號通路調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程, 而且腫瘤組織/細(xì)胞通常具有異質(zhì)性[14]. 基于單個分子標(biāo)記物的檢測通常容易造成假陽性或假陰性的檢測結(jié)果, 導(dǎo)致無法準(zhǔn)確、 靈敏地診斷出早期的癌癥疾病. 多種腫瘤標(biāo)記物同時檢測將有效提高早期癌癥疾病檢測的準(zhǔn)確性. 采用Cell-SELEX篩選技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)一次性獲得一組與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸適配子[15], 利用這些核酸適配子對同一靶細(xì)胞進(jìn)行同時檢測可以實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)應(yīng)用, 而蛋白類抗體則難以實(shí)現(xiàn)同時針對同一靶細(xì)胞的檢測. Cao等[16]聯(lián)合使用5個識別細(xì)胞表面不同靶點(diǎn)的適配子對黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定, 獲得了比單個適配子鑒定時更高的檢出率.

前文[15]利用消減Cell-SELEX技術(shù)針對轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞系LoVo進(jìn)行篩選, 獲得一組7個可與轉(zhuǎn)移性大腸癌LoVo細(xì)胞高親和性結(jié)合的核酸適配子(W1, W3, W6, W9, W14, W17和W22). 研究結(jié)果表明, 7個核酸適配子均不與正常細(xì)胞結(jié)合, 但可與具有侵襲轉(zhuǎn)移傾向的不同組織來源的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合, 表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特異性. 由于這些核酸適配子可結(jié)合同一靶腫瘤細(xì)胞, 本文探討了這些核酸適配子是否存在對轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞進(jìn)行多靶點(diǎn)應(yīng)用的潛力, 以期為核酸適配子的廣泛應(yīng)用及轉(zhuǎn)移性大腸癌的成像和定量分析提供新的方法和手段.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鏈霉親和素標(biāo)記的量子點(diǎn)605(QD-SA, 武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)有限公司); 核酸適配子序列和原文庫(Library)序列(上海生工生物公司, 序列如表1所示); DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司); 胎牛血清(FBS公司)和胰蛋白酶(HyClone 公司); 牛血清白蛋白(BSA, Biosharp公司); 鯡魚精DNA(Sigma公司); 其它試劑均為國產(chǎn)分析純; 實(shí)驗(yàn)用水為電阻率18.2 MΩ·cm的純凈水.

FACScalibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司); 熒光顯微鏡(日本Olympus公司).

Table 1 DNA sequences used in experiments

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

對LoVo, HCT116和SW620細(xì)胞用含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基, 對CL187和HEK293細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基, 在37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3 核酸適配子的前處理

將合成的核酸適配子溶于結(jié)合緩沖液(PBS+10%BSA+1%鯡魚精DNA)中, 于95 ℃加熱變性5 min, 然后置于冰上10 min, 于-20 ℃保存待用.

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測核酸適配子與細(xì)胞的特異性結(jié)合

取對數(shù)生長期大腸癌細(xì)胞或正常細(xì)胞, 用無酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞, 吹打成單細(xì)胞懸液. 加入FITC標(biāo)記的各核酸適配子或7個核酸適配子混合液, 終濃度為250 nmol/L, 與細(xì)胞于4 ℃共孵育30 min; 以1000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min, 棄去上層清液; 加入0.3 mL PBS重懸細(xì)胞, 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測每組細(xì)胞的熒光信號強(qiáng)度, 利用FlowJo軟件計(jì)算熒光信號強(qiáng)度值.

1.5 流式細(xì)胞術(shù)分析不同核酸適配子對靶細(xì)胞結(jié)合的相互競爭

取對數(shù)生長期LoVo細(xì)胞, 用無酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞, 吹打成單細(xì)胞懸液. 分別加入各個核酸適配子作為抑制劑, 終濃度為2500 nmol/L, 與細(xì)胞于4 ℃孵育30 min; 以1000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min, 棄去上層清液; 然后加入FITC標(biāo)記的核酸適配子, 終濃度為250 nmol/L, 與細(xì)胞于4 ℃共孵育30 min, 以1000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min, 棄去上層清液; 加入0.3 mL PBS重懸細(xì)胞, 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測每組細(xì)胞的熒光信號強(qiáng)度.

1.6 熒光顯微鏡觀察核酸適配子的特異性成像

取對數(shù)生長期LoVo細(xì)胞接種于六孔板中(內(nèi)置蓋玻片), 過夜培養(yǎng). 用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次, 加入生物素標(biāo)記核酸適配子, 終濃度為250 nmol/L, 與細(xì)胞于4 ℃共孵育30 min. 再用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞, 加入QD-SA(1∶200稀釋)于室溫反應(yīng)20 min; 用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞, 用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光信號, 并利用顯微圖像分析系統(tǒng)對每個圖像的熒光信號進(jìn)行半定量分析.

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析, 結(jié)果用x±s表示, 采用單因素方差分析和T檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 以P<0.05為有顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 核酸適配子與LoVo細(xì)胞的特異性結(jié)合

Fig.1 Flow cytometry for the binding of FITC-labeled aptamers to LoVo(A1—A7) and HCT-8(B1—B7) cells a. Library; b. aptamer. (A1, B1) W1; (A2, B2) W3; (A3, B3) W6; (A4, B4) W9; (A5, B5) W14; (A6, B6) W17; (A7, B7) W22.

首先合成5′端FITC標(biāo)記的核酸適配子(W1, W3, W6, W9, W14, W17和W22), 將它們和Library分別與細(xì)胞LoVo和HCT-8共孵育, 然后測定結(jié)合熒光強(qiáng)度. 通常, 與Library相比, 如果熒光信號的平均值超過10%即可認(rèn)為是與靶細(xì)胞結(jié)合. 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(圖1)顯示, 與Library(曲線a)相比, 7個核酸適配子與靶細(xì)胞LoVo共孵育后熒光峰(曲線b)發(fā)生不同程度的右移, 表明核酸適配子均與LoVo相結(jié)合. 同時, 各核酸適配子與消減細(xì)胞HCT-8的結(jié)合峰與Library峰基本重合, 未發(fā)生明顯的右移, 表明7個核酸適配子與HCT-8未發(fā)生結(jié)合. 進(jìn)一步對檢測到的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析, 結(jié)果(圖2)顯示, 核酸適配子與LoVo細(xì)胞均有不同程度的結(jié)合, 而與HCT-8細(xì)胞均不結(jié)合, 表明這7個核酸適配子均具有良好的靶細(xì)胞特異性.

Fig.2 Quantitative results based on flow cytometry Data were presented as the mean±standard deviation.

2.2 核酸適配子具有不同的細(xì)胞表面識別靶點(diǎn)

腫瘤組織/細(xì)胞具有高度異質(zhì)性, 且腫瘤轉(zhuǎn)移是涉及多個階段、 多個步驟的復(fù)雜過程, 其中包括多個信號通路及多種分子的改變[17]. 基于單一標(biāo)志物的檢測和分析會導(dǎo)致假陰性判斷, 而多個標(biāo)志物聯(lián)合檢測可有效避免單一指標(biāo)造成的遺漏, 有助于轉(zhuǎn)移性腫瘤的正確診斷[16,18].

為了探討所得核酸適配子能否進(jìn)行多靶點(diǎn)應(yīng)用, 利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了7個核酸適配子與靶細(xì)胞的結(jié)合競爭實(shí)驗(yàn). 先分別向細(xì)胞中加入未熒光標(biāo)記的各核酸適配子, 與細(xì)胞孵育30 min后, 再分別加入FITC標(biāo)記的各核酸適配子. 結(jié)果(圖3)顯示, 以FITC-W1為例, 當(dāng)加入W1作為競爭抑制劑時, FITC-W1與LoVo細(xì)胞的結(jié)合熒光峰與Library組相比無明顯移動, 表明由于存在競爭抑制, FITC-W1與LoVo細(xì)胞的結(jié)合率降低. 相反, 當(dāng)加入其它核酸適配子(W3, W6, W9, W14, W17, W22)進(jìn)行競爭時, FITC-W1與LoVo細(xì)胞的結(jié)合熒光峰與Library組相比發(fā)生明顯右移, 表明核酸適配子W1與靶細(xì)胞的結(jié)合未受到影響, 說明其它核酸適配子與W1均不存在競爭抑制. 其它流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一推測, 即7個核酸適配子與靶細(xì)胞的結(jié)合之間均沒有競爭關(guān)系, 不存在相互干擾, 表明這些核酸適配子結(jié)合的細(xì)胞表面靶分子不同, 提示其具有潛在的多靶點(diǎn)應(yīng)用功能.

Fig.3 Mutual effects of aptamers on the recognition of targets by competitive experiment

2.3 多個核酸適配子聯(lián)合使用對靶細(xì)胞LoVo進(jìn)行多靶點(diǎn)成像

核酸適配子作為腫瘤識別分子結(jié)合熒光染料能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向成像, 但是由于有機(jī)染料存在信號強(qiáng)度低、 靈敏度有限以及光穩(wěn)定性不足等缺點(diǎn), 在臨床應(yīng)用中受到了極大的限制. 隨著納米技術(shù)的發(fā)展, 核酸適配子結(jié)合納米材料量子點(diǎn)用于腫瘤的靶向成像備受關(guān)注, 相對于傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料, 量子點(diǎn)具有很好的光化學(xué)穩(wěn)定和寬而連續(xù)的激發(fā)光譜, 更有利于成像檢測[19].

Fig.4 Fluorescence(A1—A9) and optical(B1—B9) images of LoVo cells stained by aptamers-QD

Fig.5 Quantitative results based on QD-cells

實(shí)驗(yàn)篩選得到的7個核酸適配子結(jié)合的靶分子不同, 然而它們又可識別共同的靶細(xì)胞, 因此可利用結(jié)合不同靶分子的多個核酸適配子進(jìn)行靶腫瘤細(xì)胞的多靶點(diǎn)檢測. 首先, 選取靶細(xì)胞LoVo聯(lián)合量子點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)成像, 熒光顯微鏡結(jié)果(圖4)顯示, 采用7個核酸適配子混合并偶聯(lián)QD后對靶細(xì)胞LoVo進(jìn)行同時成像時, 可獲得更強(qiáng)的熒光信號強(qiáng)度, 而且視野下幾乎所有靶細(xì)胞的細(xì)胞表面均被染成紅色熒光; 相反, 采用單個核酸適配子對靶細(xì)胞進(jìn)行成像時, 熒光強(qiáng)度明顯較低且部分靶細(xì)胞未被成像. 如核酸適配子W17和W22組, 視野下僅有個別靶細(xì)胞被染成紅色, 絕大部分細(xì)胞未被成像; 即使是7個核酸適配子中結(jié)合能力最強(qiáng)的W3組, 雖然視野下絕大部分靶細(xì)胞已經(jīng)被染成紅色, 但是與混合核酸適配子組相比, 熒光信號明顯較弱. 分別對核酸適配子染色的細(xì)胞數(shù)和熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析, 結(jié)果(圖5)顯示, 與W3組相比, 多個核酸適配子聯(lián)合成像時的陽性細(xì)胞檢出率和熒光強(qiáng)度明顯提高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 此結(jié)果提示同時運(yùn)用多個核酸適配子對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行成像可以增加成像的靈敏度, 以及提高陽性檢出率.

2.4 核酸適配子聯(lián)合使用定量評價(jià)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能

Fig.6 Flow cytometry assays of the binding of aptamers with cells

Fig.7 Relative fluorescence intensities of aptamers-cells

為了驗(yàn)證多個核酸適配子聯(lián)合檢測能夠更準(zhǔn)確地評價(jià)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能, 進(jìn)一步選擇其它大腸癌細(xì)胞系進(jìn)行了檢測. 流式細(xì)胞術(shù)(圖6)結(jié)果顯示, 多個核酸適配子聯(lián)合檢測時, 具有轉(zhuǎn)移侵襲潛能的大腸癌細(xì)胞系LoVo, SW620和HCT116的熒光結(jié)合峰與單個核酸適配子相比明顯發(fā)生右移, 而沒有侵襲轉(zhuǎn)移潛能的大腸癌細(xì)胞系CL187和正常人胚腎細(xì)胞系HEK293的熒光結(jié)合峰未發(fā)生改變, 提示核酸適配子聯(lián)合使用仍然體現(xiàn)了很好的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的特異性. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果(圖7)顯示, 核酸適配子聯(lián)合使用與使用單個核酸適配子相比, 對腫瘤細(xì)胞檢測靈敏度上的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05). 此外, 當(dāng)核酸適配子聯(lián)合使用檢測時, 熒光強(qiáng)度順序?yàn)長oVo>SW620>HCT116>CL187, 與已報(bào)道[20]的大腸癌細(xì)胞系本身的轉(zhuǎn)移侵襲潛能一致, 此結(jié)果提示多個生物標(biāo)志物同時檢測可更全面地反映腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲潛能.

3 結(jié) 論

以多個結(jié)合不同靶分子的具有轉(zhuǎn)移性大腸癌特異性的核酸適配子作為靶向識別分子, 連接QDs形成特異性成像探針, 通過多個核酸適配子探針的聯(lián)合使用可有效提高對靶細(xì)胞識別的靈敏度和準(zhǔn)確性, 為核酸適配子的廣泛應(yīng)用及大腸癌的靶向診斷提供了新的研究思路和手段.

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(Ed.: N, K)

Quantitative Multi-targeted Imaging of Metastatic Colorectal Cancer Cells Using Aptamer Probes in Combination?

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.21375149, 81502703) and the Foundation of Shenyang Municipal Science & Technology Bureau, China(No.F13-220-9-29).

LI Wanming, FANG Jin*

(DepartmentofCellBiology,KeyLaboratoryofCellBiology,MinistryofPublicHealth,andKeyLaboratoryofMedicalCellBiology,MinistryofEducation,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

We developed seven aptamer probes towards metastatic colorectal cancer cells by conjugating the aptamers to quantum dots(QD605) for multi-targeted cancer cell imaging. The results of competitive assay showed that the seven aptamers could recognize their individual targets on the same cell without any mutual interference, revealing that they may be applied in combination for multi-target cancer cell imaging. The results of quantitative assay of the fluorescence images showed that compared with a single probe, the seven probes in combination can significantly increase the fluorescent intensity on the cell surface, and the detection rate of positive cells increased significantly, resulting in a higher detection sensitivity. Further, the probes were used to detect several colorectal cancer cell lines using flow cytometry. The results showed that seven probes used in combination could effectively evaluate colorectal cancer metastatic potential. This study demonstrated that usage of multiple aptamer probes in combination could effectively improve the sensitivity and accuracy of target imaging which provides a novel approach for targeted diagnosis of colorectal cancer.

Aptamer; Metastatic colorectal cancer; Multi-target; Quantum dot; Molecular imaging

2016-04-18.

日期: 2016-06-15.

國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 21375149, 81502703)和沈陽市科技局資助項(xiàng)目(批準(zhǔn)號: F13-220-9-29)資助.

10.7503/cjcu20160254

O657.3

A

聯(lián)系人簡介: 方 瑾, 女, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事腫瘤標(biāo)志物的篩選及鑒定方面的研究. E-mail: jfang61@netease.com