李 虹, 杜立波, 張 晗, 肇玉明, 劉 揚

(1. 中國科學院化學研究所, 北京 100190; 2. 首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院, 北京 100069;3. 中國科學院大學, 北京 100049)

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［研究快報］

小尺寸低聚殼聚糖/丹參酮IIA納米載藥體系

李 虹1,3, 杜立波1, 張 晗1, 肇玉明2, 劉 揚1,3

(1. 中國科學院化學研究所, 北京 100190; 2. 首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院, 北京 100069;3. 中國科學院大學, 北京 100049)

小尺寸殼聚糖納米膠束; 丹參酮IIA; 神經(jīng)保護劑; 難溶藥物轉(zhuǎn)運

納米載藥系統(tǒng)以其獨特的化學性質(zhì)已廣泛應用于小分子藥物轉(zhuǎn)運, 并已有相關的臨床實例報道[1～6]. 殼聚糖(CS)因其所特有的無生物毒性、 易生物降解和良好生物相容性等優(yōu)點而備受關注[7～16]. 由于傳統(tǒng)方法制備的殼聚糖納米顆粒粒徑高達數(shù)百納米, 使其生物利用度低, 限制了其更廣泛應用. 我們在前期工作中發(fā)現(xiàn): 一種無殘留合成方法可以制備粒徑在50～80 nm的小尺寸低聚殼聚糖納米載體, 并可攜帶藥物高效穿透細胞膜, 顯著提高藥效[17,18]. 但該載體尚未能解決難溶小分子藥物[如抗中風中藥丹參酮IIA(TSIIA)]的有效包載[19]. 考慮到D-α-生育酚琥珀酸酯(TPS)具有優(yōu)良的親脂性, 對許多難溶性藥物都是一種優(yōu)良的溶劑[20], 并且結(jié)構(gòu)與難溶性藥物具有相似相容的特征, 本文設計并制備了一種TPS修飾的低聚殼聚糖兩親性聚合物膠束體系, 并以TSIIA為難溶藥物檢驗了其載藥能力、 生物安全性與神經(jīng)細胞攝入能力.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器 TPS, Sigma-Aldrich 公司; 殼聚糖、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC, 純度98.5%)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS, 純度98.5%)和二甲基亞砜(DMSO, 純度96%), 國藥集團化學試劑有限公司. 瑞士Bruker公司AVANCE400型核磁共振波譜儀(1H NMR)與TENSOR-27型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR); 日本日立公司S-4800型掃描電子顯微鏡(SEM); 日本島津公司UV-2450型紫外-可見分光光度計(UV-Vis).

1.2 實驗過程 依據(jù)實驗室前期報道[17], 殼聚糖經(jīng)氧化降解后再經(jīng)羥乙基化獲得分子量約為4000的水溶性低聚CS, 然后通過EDC/NHS反應接枝上TPS, 反應過程如Scheme 1所示. 將質(zhì)量分數(shù)為2%CS的DMSO溶液用EDC/NHS(摩爾比為1.2∶1)活化2 h, 加入TPS的DMSO溶液, 于45 ℃攪拌2 h, 所得溶液透析2 d后凍干, 產(chǎn)物CS-g-TPS經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜分析其分子量不大于4000(見本文支持信息, 圖S1). 將上述CS-g-TPS粉末溶于水, 再少量多次加入TSIIA藥物粉末后即刻超聲振蕩, 得初級載藥納米顆粒, 然后加入戊二醛進行交聯(lián)后再羥乙基化, 獲得納米載藥系統(tǒng)TSIIA@CS-g-TPS.

用噻唑藍(MTT)方法評價納米細胞毒性, 納米載體細胞攝入的熒光成像實驗見本文支持信息.

2 結(jié)果與討論

2.1 載藥殼聚糖納米顆粒的表征與納米自組裝 低聚CS和CS-g-TPS的1H NMR譜見本文支持信息. 根據(jù)TPS末端甲基質(zhì)子氫與CS特征峰積分面積比計算出取代度約為1.4%. 對比CS和 CS-g-TPS 的紅外光譜, 可看出TPS接枝到 CS 骨架上. FTIR與1H NMR結(jié)果可互相印證接枝成功.

采用紫外-可見分光光度法測得載體對TSIIA包載量為14.1%, 包封率為100%. TSIIA分子的能量結(jié)構(gòu)決定其熔點高且極難溶于水. 但TPS親脂性強且生物相容性好, 與TSIIA藥物結(jié)構(gòu)相似, 因此本文設計并制備TPS連接的聚合物包載TSIIA.

Fig.1 In vitro cytotoxicity of CS-g-TPS(A) and TSIIA@CS-g-TPS(B) in primary neural cell

Fig.2 Confocal images of SH-SY5Y cells incubated with FITC-labeled TSIIA@CS-g-TPS (A, A′) Fluorescence; (B, B′) bright-field; (C, C′) overlay; (A—C) 0.5 h; (A′—C′) 3 h.

2.2 殼聚糖納米載藥體系的細胞毒性檢驗與細胞攝入性能分析 中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為機體的重要器官, 在藥物干預時, 需要高效且低毒的轉(zhuǎn)運系統(tǒng). TSIIA作為神經(jīng)保護類抗中風藥物, 載藥體系的生物安全性和細胞跨膜特性至關重要, 對細胞毒性的要求也遠高于抗癌藥物載體. 因此, 本文采用最接近活體效果的小鼠原代神經(jīng)元來檢驗載體體系的細胞毒性, 結(jié)果見圖1. 可見載藥體系TSIIA@CS-g-TPS[圖1(A)] 還是空載體CS-g-TPS[圖1(B)]均未導致明顯的細胞毒性. 圖1(A)中的MTT結(jié)果甚至顯示當包載藥物后細胞存活率可超過100%, 展現(xiàn)出藥物營養(yǎng)細胞的效果.

納米載藥體系通常是以內(nèi)吞方式被高效攝入靶細胞[17,18,21,22], 因此其藥效與細胞內(nèi)吞速度密切相關. 為了驗證本文中的小尺寸低聚殼聚糖納米載體可高效通透細胞膜的假設, 采用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測了用FITC熒光標記的TSIIA@CS-g-TPS通透神經(jīng)細胞株SH-SY5Y的狀況, 結(jié)果示于圖2. 當孵育3 h后, 在細胞質(zhì)內(nèi)清晰可見攝入大量帶熒光標記的TSIIA@CS-g-TPS. 其細胞攝入效率甚至比未接枝TPS的殼聚糖載體更高(前文中神經(jīng)細胞顯著攝入的時間為6～12 h)[17]. 結(jié)果表明本文的新載藥體系有望在中風等神經(jīng)損傷相關疾病的治療方面展示出更大的應用潛力.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20160288.

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(Ed.: D, Z)

New Tanshinone IIA Delivery System Using Chitosan Nanomicelles of Small Size?

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.31570856, 31571020), the Beijing Natural Science Foundation of China(No.5152005) and the 2016 Scientific Research Project of Beijing Educational Committee of China(No.KM201610025003).

LI Hong1,3, DU Libo1, ZHANG Han1, ZHAO Yuming2*, LIU Yang1,3*

(1.InstituteofChemistry,ChineseAcademyofSciences,Beijing100190,China;2.SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;3.UniversityofChineseAcademyofScience,Beijing100049,China)

It is still a great challenge to design and synthesize ultra-small chitosan nanoparticles for encapsulating highly hydrophobic neuroprotectants, such as anti-stroke drug tanshinone IIA. To address the issue, a new amphiphilic polymeric micelle system(i.e. CS-g-TPS) was synthesized by covalent linking ofD-α-tocopherol succinic acid ester with hydroxylethyl-chitosan in a green and effective approach. The results showed that the obtained CS-g-TPS can be self-assembled into ultra-small nanoparticles by hydrophilic-hydrophobic interaction in aqueous solution, which can be effectively loaded with tanshinone IIA. The particle size and morphology were characterized by scanning electron microscopy(SEM) and dynamic light scattering(DLS), respectively. Bioassays of cell viability and drug uptake further revealed that the CS-g-TPS/tanshinone IIA delivery system could achieve excellentinvitrobiocompatibility, as well as high cellular uptake efficiency. It indicated that CS-g-TPS might be a promising drug delivery system for water insoluble neuroprotectant with the characteristics of high biosafety.

Chitosan nanomicelles of small size; Tanshinone IIA; Neuroprotectant; Delivery for poorly soluble drugs

2016-04-24.

日期: 2016-06-16.

國家自然科學基金(批準號: 31570856, 31571020)、 北京市自然科學基金(批準號: 5152005)和2016年北京市教育委員會科技計劃一般項目基金(批準號: KM201610025003)資助.

O636

A

聯(lián)系人簡介:劉 揚, 男, 博士, 研究員, 主要從事納米生物學與自由基生物學研究. E-mail: yliu@iccas.ac.cn

肇玉明, 女, 博士, 副教授, 主要從事神經(jīng)藥理學研究. E-mail: yumingzhao@ccmu.edu.cn