于 盈，王鳳玲

（浙江省臺州市立醫(yī)院感染內(nèi)科，浙江 臺州 318000）

大黃素治療大鼠急性肝功能衰竭時核因子－ B的動態(tài)變化

于 盈，王鳳玲

（浙江省臺州市立醫(yī)院感染內(nèi)科，浙江 臺州 318000）

目的 探討大黃素治療大鼠急性肝功能衰竭時大鼠肝臟中核因子－ B(NF－ B)的動態(tài)變化。方法 將SD大鼠隨機分為健康對照組、肝衰竭模型組（ALF組）、大黃素治療組。以 D－氨基半乳糖（D－Gal）建立大鼠急性肝功能衰竭模型，建模后12 h，大黃素治療組腹腔注射10 mg／kg大黃素，2次／天。ALF組及大黃素治療組分別在建模后24，72，120，168 h隨機各取6只大鼠，取門靜脈血查肝功能，10%甲醛液固定肝組織，免疫組化檢測NF－ B。結(jié)果 造模后24 h，大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）明顯升高，且顯著高于健康對照組（以72 h為著），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝5.521，7.743，P＜0.01）；建模后72 h相同時點，ALF組大鼠肝功能指標均顯著高于大黃素治療組（P＜0.01）；建模后24 h，ALF組NF－ B表達高于健康對照組（q＝3.325，P＜0.01），其表達72 h達高峰，120 h后逐漸下降；建模后72，120，168 h大黃素治療組與 ALF組的NF－ B表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q＝5.638，5.527，5.314，P＜0.01）。結(jié)論 大黃素對大鼠急性肝功能衰竭有保護作用，其機制可能與下調(diào)NF－ B的表達有關(guān)。

肝功能衰竭；急性；大黃素；核因子－ B；大鼠

肝功能衰竭是由多種因素引起的肝細胞合成、分泌及生物轉(zhuǎn)化嚴重障礙臨床綜合征，患者以黃疸、肝性腦病、腹腔積液、凝血功能障礙等為主要臨床表現(xiàn)。其包括急性、慢性和亞急性肝功能衰竭，其中急性肝功能衰竭（ALF）是由于肝臟功能急劇減退，導(dǎo)致以明顯黃疸、凝血功能低下和肝性腦病為主要表現(xiàn)的綜合征，是最嚴重的一種表現(xiàn)。ALF患者發(fā)病急，病情進展迅速，當(dāng)前臨床尚無特效治療方法。大黃是臨床使用較廣泛的中藥之一，其主要有效成分為大黃素，不少臨床研究和試驗研究發(fā)現(xiàn)，大黃素具有多種生物學(xué)作用，包括抗炎、肝功能保護、免疫調(diào)節(jié)等，也有不少學(xué)者采用大黃制劑防治肝癌、保護肝功能等[1－4]。細胞增殖S期會表達核因子－κB（NF－κB）蛋白，不少研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB能參與細胞增殖過程，NF－κB的變化能直接反映細胞的增殖功能，因此可用來評價肝細胞的再生作用。本研究中擬通過建立ALF大鼠模型，采用大黃素干預(yù)，分析NF－κB變化，探討大黃素對肝臟功能保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥、動物

1.1.1 儀器及試藥

主要儀器包括全自動生化分析儀（濟寧市潤煤工礦物資有限公司）。主要試劑包括NF－κB一抗（廣州泰諾迪生物科技有限公司）；D－氨基半乳糖（D－Gal，重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室）；大黃素（廣州泰諾迪生物科技有限公司，批號為110756－200110）。NF－κB免疫組化試劑盒（廣州泰諾迪生物科技有限公司）。

1.1.2 試驗動物及分組

研究符合動物試驗倫理學(xué)原則。選取健康清潔級雄性SD大鼠（溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物合格證編號為2010－04－12）54只，體質(zhì)量180～220 g。按隨機數(shù)字表法分成健康對照組（6只），肝功能衰竭模型組（ALF組，24只），大黃素治療組（24只）。3組大鼠均給予相同喂養(yǎng)條件和飲食：溫度18～26℃，相對濕度5% ～10%，噪聲小于85 dB，每1 h通氣換風(fēng)8～12次，飼喂量5 g。術(shù)前12 h禁食，術(shù)前4 h禁飲。大黃素治療組和ALF組分別于建模后24，72，120，168 h取6只大鼠，采集門靜脈血標本，同時留取肝組織標本。

1.2 模型建立

準確稱取 D－Gal 10 g，溶入0.9%氯化鈉注射液100 mL中，采用1 mol／L NaOH調(diào)溶液pH至7.0，溶液最終濃度在10%。ALF組大鼠腹腔注射1.25 g／kg D－Gal溶液，健康對照組大鼠注射等量生理鹽水。12 h后，大黃素治療組大鼠腹腔注射 10 mg／kg大黃素，2次／天。健康對照組大鼠在給藥24 h后留取靜脈血，取肝組織。ALF組及大黃素治療組分別在給藥后24，72，120，168 h時取6只大鼠行腹腔麻醉，取靜脈血，同時留取大鼠肝組織。靜脈血離心取上清液，在－80℃冰箱保存；大鼠肝組織采用甲醛固定，行病理及免疫組化檢測。

1.3 檢測方法

全自動生化分析儀檢測血清標本中肝功能指標變化，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。甲醛固定肝組織，石蠟包埋切片，蘇木素－伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

甲醛固定肝組織，脫水，檢測NF－κB水平，嚴格按照試劑盒說明操作。采用苯基丁酸（PBA）為陰性對照，以出現(xiàn)棕黃色細胞核為陽性。采用Image－ProPlus 6.0圖像分析，測量肝組織平均光密度 OD值，光密度OD＝積分光密度（IODSUM）／組織面積（Area SUM）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 Microsoft Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多樣本計量資料比較采用 SNK法，組內(nèi)不同時間點比較采用 LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALT與AST水平

血清ALT和AST經(jīng)方差齊性檢驗，組間兩兩比有顯著性差異（F＝36.28，P＜0.01）；建模24 h后，ALF組肝功能指標均顯著上升，與對照組相比有顯著性差異（t＝5.521，7.743，P＜0.01）；建模后24 h，ALF組和大黃素治療組血清ALT和AST等差異不明顯，建模后72 h達高峰。此后，大黃素治療組ALT和AST顯著下降，相同時間點，顯著低于ALF組（P＜0.01）。ALF組和大黃素治療組建模后120，168 h血清ALT和AST均持續(xù)下降。詳見表1。

表1 各組大鼠不同時點肝功能變化（s，U／L，n＝6）

表1 各組大鼠不同時點肝功能變化（s，U／L，n＝6）

注：與健康對照組比較， P＜0.05；與 ALF組同時點比較，P＜0.05。

組別 時間健康對照組ALF組 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h大黃素治療組 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h ALT 28.7±2.6 321.3±89.7 724.0±121.4 191.4±51.0 88.3±13.9 293.9±69.5 187.4±52.1 102.7±27.2 52.4±9.7 AST 76.4±5.2 575.5±117.3 223.2±73.1 171.7±53.9 150.5±38.7 535.3±110.9 179.5±71.5 110.3±25.6 75.7±15.1

2.2 肝組織病理學(xué)改變

HE染色結(jié)果表明，健康對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，能清晰看到肝索。注射 D－Gal后，ALF組大鼠肝組織染色顯示，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞大面積壞死。見圖1和圖2。

圖1 健康對照組大鼠肝組織（HE染色，×400）

圖2 ALF組大鼠肝組織（HE染色，×400）

2.3 肝組織NF－ B的表達

健康對照組 NF－κB不表達或有少量表達，24 h后，ALF組 NF－κB水平顯著高于健康對照組（q＝3.325，P＜0.01），ALF組和大黃素治療組NF－κB均在72 h達到最高，隨后開始緩慢下降。72 h開始至168 h，大黃素治療組肝組織NF－κB表達較ALF組明顯減少（q＝5.638，5.527，5.314，P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠不同時點肝組織內(nèi)NF－ B表達水平比較（s， g／mL，n＝6）

表2 各組大鼠不同時點肝組織內(nèi)NF－ B表達水平比較（s， g／mL，n＝6）

注：與健康對照組相比， P＜0.05；與 ALF組同時點比較，P＜0.05。

組別 時間健康對照組ALF組 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h大黃素治療組 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h NF－ B 0.038±0.004 0.121±0.020 0.201±0.032 0.109±0.007 0.092±0.006 0.113±0.014 0.172±0.025 0.074±0.006 0.053±0.006

3 討論

急性肝功能衰竭最突出的表現(xiàn)是短時間內(nèi)肝細胞變性、壞死等，炎性因子顯著增加，由于ALF病情進展快，存在多種并發(fā)癥，臨床治療難度較大，而且預(yù)后極差，死亡率很高，其治療是研究的難點和重點。肝移植治療肝功能衰竭較有效，但臨床應(yīng)用中由于供體缺乏、費用昂貴，無法推廣采用[5－6]，故研究更加合理的中藥治療有重要現(xiàn)實意義。

大黃素是大黃主要有效成分之一，屬于蒽醌類，又名朱砂蓮甲素，提取出的大黃素常溫下呈針狀結(jié)晶狀。近幾年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中對大黃素的研究較為廣泛，當(dāng)前的研究發(fā)現(xiàn)，大黃素具有多種生物學(xué)作用，包括肝細胞保護、抗炎、抗腫瘤作用等，有學(xué)者分析了大黃在急性胰腺炎中的應(yīng)用，治療前，兩組患者淀粉酶、二胺氧化酶（DAO）等指標差異不明顯，連續(xù)治療1周，兩組患者血淀粉酶、DAO等均顯著下降，觀察組血淀粉酶、DAO顯著低于對照組（P＜0.05），故認為大黃能抑制鈉離子和鉀離子，促進上皮細胞離子主動運轉(zhuǎn)，具有廣泛抗菌、抗病毒的效果[7]。大黃素對機體具有雙重調(diào)節(jié)作用，既能抑制T淋巴細胞增殖，減小膿毒血癥陽性率，減小炎性因子過度釋放，又能抑制不同有絲分裂刺激脾細胞增殖。

本研究中建立了大鼠急性肝功能衰竭模型，同時在建模72 h后注射大黃素，結(jié)果大鼠血清ALT及AST水平顯著下降，且與肝衰竭模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明大黃素對肝功能有一定保護作用。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，大黃素能抑制炎性因子作用，減少內(nèi)毒素血癥，同時在清除氧自由基、減少炎性遞質(zhì)方面也有明顯作用[8]。其他研究中還發(fā)現(xiàn)，注射大黃素后，體內(nèi)炎性因子，如腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細胞介素（IL）－6、IL－1等的分泌顯著減少，故認為大黃素能減少肝細胞凋亡，減輕炎性反應(yīng)[9]。本試驗中，大黃素的肝保護作用可能與上述機制有關(guān)。

NF－κB為反映肝細胞增殖的重要蛋白質(zhì)，細胞DNA的合成與NF－κB密切相關(guān)[10]。NF－κB對啟動細胞增殖有重要作用，其表達量能直接反映細胞增殖和復(fù)制活躍程度，已成為反映細胞增殖效應(yīng)的重要指標[11－14]。

本研究中觀察了NF－κB水平的變化，結(jié)果顯示，隨著時間的推移，肝衰竭模型組大鼠肝組織的NF－κB水平上升，在72 h達到最高峰，隨后逐漸下降，而采用大黃素處理后，NF－κB則明顯下降，且下降趨勢一直持續(xù)到建模后168 h，這種變化趨勢與肝衰竭模型組存在明顯差異。說明大黃素不僅會對ALT和AST產(chǎn)生影響，還會影響NF－κB的表達。提示大黃素可能通過抑制炎癥細胞分泌和聚集減少NF－κB表達，進而發(fā)揮抗細胞凋亡作用。

綜上所述，本研究中通過建立肝衰竭大鼠模型，同時注射大黃素進行治療，分析大黃素對肝細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)大黃素可能減少炎性因子的釋放，抑制IKK細胞信號傳導(dǎo)通路，進而達到抑制肝細胞凋亡的效果，也能為肝細胞再生提供微環(huán)境，這可能是其治療肝功能衰竭的機制，對大黃素今后的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

[1]劉 岸，羅 江，張堅紅，等.大黃素聯(lián)合吉西他濱抑制體內(nèi)外胰腺癌生長及其機制研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（5）：652－656.

[2]董妙先，綦艷秋，朱蘭芹，等.大黃素對肝纖維化大鼠肝臟組織中Ⅰ型前膠原mRNA表達的影響[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，34（14）：2 029－2 030.

[3]阮志燕，商 玲，鄧向亮，等.大黃素對CT26結(jié)腸癌小鼠調(diào)節(jié)性 T細胞功能的影響[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（15）：2 377－2 380.

[4]Chen XH，Sun RS，Hu JM，et al.Inhibitory effect of emodinon bleomycin－induced pulmonaryfibrosisin mice[J].ClinExp Pharmacol Physiol，2009，36（2）：146－153.

[5]Bernal W，Auzinger G，Dhawan A，et al.Acute liver failure[J].Lancet，2010，376（9 736）：190－201.

[6]Lee WM.Acute liver failure[J].Semin Respir Crit Care Med，2012，33（1）：36－45.

[7]張 揚，扈曉宇，駱建興，等.清熱化瘀中藥對急性肝衰竭模型大鼠肝功能及生存期的影響[J].世界華人消化雜志，2012，20（21）：1 961－1 966.

[8]Ha MK，Song YH，Jeong SJ，et al.Emodin inhibitsproinflammatory responses and inactivates histone deacetylase 1in hypoxic rheumatoid synoviocytes[J].Biol Pharm Bull，2011，34（9）：1 432－1 437.

[9]Ding Y，Zhao L，Mei H，et al.Exploration of Emodin to treatalphanaphthylisothiocyanate－induced cholestatic hepatitis viaanti－inflammatory pathway[J].Eur J Pharmacol，2008，590（1－3）：377－386.

[10]Celis JE，Madsen P，Celis A，et al.Cyclin（PCNA，auxiliaryprotein of DNA polymerase delta）is a central component ofthe pathway（s）leading to DNA replication and cell division[J].FEBS Lett，1987，220（1）：1－7.

[11]Moldovan GL，Pfander B，Jentsch S.PCNA，the maestro ofthe replication forK[J].Cell，2007，129（4）：665－679.

[12]Kang JS，Kang HG，Dark YI，et al.Expression ofepithelial cell adhesion molecule and proliferating cell nuclear antigen in diethylnitrosamine－induced hepatocarcinogenesis in mice[J].Exp Ther Med，2013，5（1）：138－142.

[13]Li S，Zhong J，Yang Q，et al.Effect of seaweed pigmentglycoprotein on the expression of PCNA and Bcl－2 protein in hepatocarcinoma cells in mice[J].Journal of Hygiene Research，2011，40（2）：220－222.

[14]Alenzi FQ，E－Nashar EM，A－Ghamdi SS，et al.Investigation of Bcl－2 and PCNA in Hepatocellular Carcinoma：Relation to Chronic HCV[J].Egypt Natl Canc Inst，2010，22（1）：87－94.

Effects of Emodin on NF－κB in Rats with Acute Liver Failure

Yu Ying，Wang Fengling
（Department of Infectious Diseases，Taizhou Municipal Hospital，Taizhou，Zhejiang，China 318000）

Objective To explore the dynamic changes of NF－κB in the liver of rats treated with emodin in acute hepatic failure.M ethods SD rats were randomly divided into three groups：healthy control group，liver failure model group（ALF group），and emodin group.A rat model of acute liver failure was made by D－galactosamine（D－Gal）.12 h after the model was established，the emodin group received intraperitoneal injection of 10 mg／kg emodin twice daily.At 24，72，120 and 168 h after modeling，6 rats were randomly selected from the ALF group and the emodin group.The hepatic function was examined by portal vein blood.Liver tissue was fixed with 10% formalin，and immunohistochemistry was used to detect NF－κB.Results After 24 h of modeling，the levels of alanine aminotransferase（ALT） and aspartate aminotransferase（AST） in serum were significantly higher than those in the healthy control group，the difference was statistically significant（t＝5.521，7.743，P＜0.01）；after 72 h of modeling，the liver function of rats in ALF group was significantly higher than that of emodin group at the same time point（P＜0.01）；after 24 h of modeling，the expression of NF－κB in ALF group was significantly higher than that in healthy control group（q＝3.325，P ＜0.01），and reached the peak at 72 h，and decreased after 120 h.There were significant differences in the expression of NF－κB between the emodin group and the Alf group（q＝5.638，5.527，5.314，P＜0.01）at 72，120 and 168 h after modeling.Conclusion Emodin has protective effect on acute liver failure in rats，and its mechanism may be related to the down－regulation of NF－κB expression.

liver function failure；acute；emodin；NF－κB；rats

2016－07－13；

2016－08－11)

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計劃項目，項目編號：2010ZA118；浙江省臺州市椒江區(qū)科技計劃項目，項目編號：112070。

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2016)22－0023－04