洪寶建 蘇麗韞 梁麗娟 朱月霞 徐芳 陳建忠

NLRP3炎性體相關(guān)分子表達(dá)與老年2型糖尿病的關(guān)系

洪寶建 蘇麗韞 梁麗娟 朱月霞 徐芳 陳建忠

目的 研究核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性體相關(guān)分子表達(dá)與老年2型糖尿病（T2DM）的關(guān)系。方法 采用ELISA法測(cè)定30例老年T2DM患者、30例健康體檢者（對(duì)照組）血漿中IL-1β、IL-18和IL-37水平，分別采用定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)和ELISA技術(shù)檢測(cè)糖尿病患者單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞（MDM）表達(dá)NLPR3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和IL-1β mRNA水平及葡萄糖誘導(dǎo)MDM分泌IL-1β和TNF-α的水平。結(jié)果 老年T2DM患者血漿中的IL-1β和IL-18水平均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而IL-37無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；T2DM患者M(jìn)DM中NLPR3、ASC和IL-1β mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；且經(jīng)葡萄糖刺激后IL-1β、TNF-α水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 NLRP3炎性體相關(guān)分子的表達(dá)與炎性體活化可能參與老年T2DM的炎癥反應(yīng)過程。

白細(xì)胞介素-1β 2型糖尿病 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 炎性體 腫瘤壞死因子

我國糖尿病患者已超過9 200萬，此外尚有約1.48億人處于糖尿病前期，有發(fā)展為糖尿病的趨勢(shì)。2型糖尿?。═2DM）是一種多基因遺傳性、進(jìn)展性疾病，盡管其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但是越來越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床研究證明炎癥與免疫是T2DM發(fā)生、發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力[1-3]。近年來有學(xué)者提出核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）介導(dǎo)的炎性體激活途徑在T2DM發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[4-10]，筆者通過觀察老年T2DM患者NLRP3炎性體相關(guān)分子的表達(dá)以及葡萄糖刺激劑對(duì)巨噬細(xì)胞炎性體活化途徑的作用，探討NLRP3炎性體活化途徑在T2DM發(fā)病中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2014年1月至2015年6月在浙江省人民醫(yī)院門診及住院的老年T2DM患者共30例，男13例，女17例，年齡62～89（76.3±14.5）歲。所有患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，初診，未經(jīng)任何降糖藥物等治療。排除嚴(yán)重心、肝、腎疾病、糖尿病慢性并發(fā)癥、急性和慢性感染、近期手術(shù)和創(chuàng)傷、惡性腫瘤、自身免疫病以及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。選取浙江省人民醫(yī)院同期健康體檢者30例作為對(duì)照組，男16例，女14例，年齡56～85（74.6±13.4）歲；排除T2DM、動(dòng)脈粥樣硬化、痛風(fēng)病等疾病。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 T2DM患者入院后清晨空腹抽取靜脈血5ml，健康對(duì)照組于健康體檢時(shí)抽取，肝素抗凝，充分混勻后，以1 200r/min離心10min，將血漿和紅細(xì)胞迅速分離，將血漿置于EP管，置于4℃冰箱保存，用于檢測(cè)IL-1β、IL-18和IL-37含量。

1.2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 采用密度梯度離心法分離T2DM患者和健康對(duì)照組的單個(gè)核細(xì)胞，分化為巨噬細(xì)胞（MDM），提取總RNA，采用定量PCR檢測(cè)MDM NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、IL-1β mRNA表達(dá)。用葡萄糖刺激患者和對(duì)照組的MDM，采用ELISA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β水平。

1.2.3 定量PCR檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)和合成引物，詳見表1。

表1 引物序列

1.2.4 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取總RNA，加入20μl的DEPC水溶解，測(cè)定RNA濃度和光密度比值（OD），符合要求后按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，10μl反應(yīng)體系中包括 PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 1μl，5xPrimeScriptTMBuffer 2μl，RNA 2μl，引物1μl，DEPC水4μl，反應(yīng)物4℃儲(chǔ)存待用。根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]在ABI 7500定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，20μl反應(yīng)體系中含SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）10μl，PCR上游和下游引物各1μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（cDNA溶液）2μl，DEPC水6μl，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，并使用熔解曲線分析引物特異性。用2-△△Ct法計(jì)算出每組樣本的基因表達(dá)量，每種檢測(cè)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞因子檢測(cè) 采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）檢測(cè)外周血IL-1β、IL-18和細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-1β水平，按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）測(cè)定450nm處吸光度（A）值，以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿中細(xì)胞因子水平的比較 T2DM組患者IL-1和IL-18水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；IL-37水平略高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 兩組血漿中細(xì)胞因子水平的比較

2.2 兩組MDM NLRP3炎性體相關(guān)分子表達(dá)水平的比較 T2DM組患者NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），詳見表3。T2DM患者分離的MDM經(jīng)葡萄糖刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α、IL-1β水平均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），詳見表4。

表4 兩組MDM經(jīng)葡萄糖刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子水平的比較

3 討論

T2DM發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，近年來隨著固有免疫研究的迅速進(jìn)展，有關(guān)固有免疫細(xì)胞炎性體途徑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在自身免疫炎癥性疾病中的作用越來越受到關(guān)注。炎性體是由模式識(shí)別受體如NLR識(shí)別配體后與接頭蛋白ASC、半胱天冬酶-1等形成的大分子的復(fù)合物[11]，形成后能激活半胱天冬酶-1，活化的半胱天冬酶-1繼而通過酶切IL-1β和IL-18前體分子而生成具有生物學(xué)活性的IL-1β和IL-18，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。NLRP3炎性體是研究較多的一種，由NLRP3、ASC和半胱天冬酶-1組成[5]。多種內(nèi)源性刺激物[12]如葡萄糖、游離脂肪酸、尿酸鈉（MSU）結(jié)晶及胞質(zhì)外ATP和外源性刺激物如細(xì)菌、病毒等成分能誘導(dǎo)NLPR3的活化，通過誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子如IL-1β的產(chǎn)生，在如糖尿病[4，6-7]、動(dòng)脈粥樣硬化[13-14]等免疫炎癥性疾病[15]中的作用日益受到重視。

近來研究發(fā)現(xiàn)固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞吞噬游離脂肪酸（FFA）、葡萄糖后，可激活炎性體途徑，釋放炎癥因子如IL-1β、TNF-α等，在T2DM的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用[4，6-7]。本研究顯示，老年T2DM患者血漿中的IL-1β和IL-18水平顯著高于健康對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]相似，提示老年T2DM患者的可能存在慢性低度炎癥狀態(tài)。IL-37是新近發(fā)現(xiàn)的具有抗炎癥作用的細(xì)胞因子[16]，本研究結(jié)果顯示，老年T2DM患者血漿中IL-37水平略高于對(duì)照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示IL-37在T2DM炎癥的調(diào)節(jié)中可能起一定的作用。為進(jìn)一步研究T2DM患者固有免疫細(xì)胞NLRP3炎性體相關(guān)分子的表達(dá)以及對(duì)葡萄糖刺激的敏感性，將外周血單個(gè)核細(xì)胞分離后進(jìn)一步分化為MDM，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)MDM中NLRP3、ASC、IL-1β mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)老年T2DM患者來源MDM的NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，提示患者的炎性體易被激活。用一定濃度的葡萄糖刺激后發(fā)現(xiàn)T2DM患者M(jìn)DM的TNF-α、IL-1β水平均顯著高于對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病患者NLRP3炎性體相關(guān)分子表達(dá)及葡萄糖能誘導(dǎo)NLRP3炎性體激活相一致[7]。以上結(jié)果提示由葡萄糖刺激引起的炎性體激活途徑可能在老年人T2DM的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)老年T2DM患者血漿IL-1β和IL-18水平顯著高于對(duì)照組，并發(fā)現(xiàn)患者來源的MDM NLRP3炎性體相關(guān)分子的基因表達(dá)水平高于對(duì)照組，經(jīng)葡萄糖刺激后IL-1β和TNF-α的水平顯著高于健康對(duì)照組，結(jié)果提示NLRP3炎性體活化途徑在老年人T2DM的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用。近來研究發(fā)現(xiàn)炎性體活化途徑抑制劑在炎性體相關(guān)疾病的治療中取得較好的效果[18]，為進(jìn)一步研制開發(fā)有效的T2DM藥物提供了一定的策略。

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Expression of NLRP3 inflammasome-related molecules in elderly patients with type 2 diabetes mellitus

HONG Baojian,SU Liyun, LIANG Lijuan,et al.Department of Central Laboratory Medicine,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014，China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of NLRP3 inflammasome-related molecules in elderly patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM). Methods The plasma levels of IL-1β,IL-18 and IL-37 in 30 T2DM patients and 30 healthy controls were measured with ELISA;the expression of NLRP3,ASC and IL-1β in monocytes derived macrophages(MDM)were detected by real time PCR.The contents of IL-1β and TNF-α secreted by MDM treated by glucose were also analyzed. Results Plasma IL-1β and IL-18 levels in T2DM patients was significantly higher than those in healthy controls(P＜0.05),while IL-37 level was no significantly increased(P＞0.05).Expression of NLRP3,ASC and IL-1 in MDM and IL-1β,TNF-α secreted by MDM were significantly higher than those in controls(P＜0.05). Conclusion The NLRP3 inflammasome pathway may be involved in the inflammatory process of elderly patients with T2DM.

IL-1β T2DM NLRP3 InflammasomesTNF

2016-05-03）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016KYB032）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心（洪寶建、蘇麗韞、梁麗娟、朱月霞、徐芳）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所（陳建忠）

陳建忠，E-mail：chenjianzhong@zju.edu.cn