周娟娣 謝尚鬧 王國良 謝達(dá)飛 湯海敏 施宜均 趙福光

MIB-1、p63在乳腺腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及意義

周娟娣 謝尚鬧 王國良 謝達(dá)飛 湯海敏 施宜均 趙福光

目的 探討MIB-1、p63在不同病理類型乳腺腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義。方法 根據(jù)WHO（2003）乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，收集乳腺腫瘤患者手術(shù)切除標(biāo)本：非典型性增生（ADH）組24例、乳腺原位癌組（DCIS）20例、浸潤性癌（IDC）組45例，乳腺普通型增生（UDH）20例作為對照組。應(yīng)用免疫組化進(jìn)行MIB-1、p63檢測，觀察其在不同病理類型乳腺組織中的分布及表達(dá)水平。結(jié)果

乳腺腫瘤 MIB-1 p63 細(xì)胞增殖

乳腺癌的發(fā)病率已躍居女性惡性腫瘤首位，而發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來，隨著分子生物學(xué)、免疫組化學(xué)，基因工程學(xué)等學(xué)科技術(shù)的發(fā)展，有可能對乳腺腫瘤細(xì)胞的增值機(jī)制進(jìn)行深入研究，其中MIB-1（ki-67抗原）、p63基因也是目前關(guān)注的熱點(diǎn)之一。筆者應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測MIB-1、p63基因在乳腺不同病理類型中的表達(dá)，以探討其在乳腺腫瘤細(xì)胞增殖中的意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2012年05月至2015年11月在我院手術(shù)治療的乳腺腫瘤患者，根據(jù)WHO（2003）乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[1]分為：非典型性增生（ADH）組24例、導(dǎo)管原位癌（DCIS）組20例及浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）組45例，研究對象均為女性，術(shù)前否認(rèn)合并其他腫瘤病史，未經(jīng)過化療、放療及免疫治療，并均經(jīng)病理確診。另選取20例普通乳腺上皮增生（UDH）作為對照組。IDC組45例患者年齡23～75歲，中位年齡47歲，其中≥35歲28例，＜35歲17例，按pTNM國際分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ期10例、Ⅱ期14例、Ⅲ期12例、Ⅵ期9例。合并淋巴轉(zhuǎn)移28例，脈管侵犯6例。乳腺癌組織學(xué)分級依照腺管形成、核的多形性及核分裂像多少分為：Ⅰ級5例、Ⅱ級22例、Ⅲ級18例。從手術(shù)當(dāng)日到2015年11月止，對45例IDC患者進(jìn)行隨訪，共隨訪到34例，隨訪率75.5%，隨訪時(shí)間3～42個(gè)月，平均28.6個(gè)月。在隨訪到的患者中死亡3例。各組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 試劑 即用型MIB-1單克隆抗體及p63單克隆抗體，SP超敏免疫組化染色試劑盒及DAB染色劑，均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 所有手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，采用免疫組化EnVision法檢測MIB-1、p63在普通上皮增生、非典型增生、原位癌、浸潤癌各組中的染色程度，步驟按說明書操作。MIB-1均采用枸櫞酸緩沖液高壓熱力修復(fù)抗原，DAB染色，蘇木精復(fù)染，用已知陽性片作為陽性對照，用PBS代替第一抗體，作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 兩人雙盲法觀察染色切片，參照國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)：以陽性細(xì)胞數(shù)占切片中細(xì)胞數(shù)5%以上，記（+），陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%為（+）；25%～75%為（++）；＞75%為（+++）；MIB-1在細(xì)胞核中表達(dá)，陽性染色者細(xì)胞核呈棕黃色，MIB-1標(biāo)記的增殖指數(shù)（PI）記數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[2]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，變量間的關(guān)系采用相關(guān)分析Log rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MIB-1、p63在乳腺不同病理類型中的表達(dá) MIB-1標(biāo)記的PI在UDH、ADH、DCIS、IDC組分別為2.25±0.54、4.08±0.57、5.50±0.56、30.22±2.41，從 UDH到 ADH、DCIS，再到IDC組，MIB-1標(biāo)記的PI顯著遞增（P＜0.05）。IDC組中MIB-1主要表達(dá)于癌細(xì)胞核，在癌細(xì)胞向間質(zhì)浸潤最明顯之處，其表達(dá)最強(qiáng)。p63主要在導(dǎo)管周圍的肌上皮表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度在UDH、ADH、DCIS、IDC中分別為++～+++、++、+、-（表1），隨著病變異型性加重，p63陽性表達(dá)率明顯減低，IDC組與ADH、DCIS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），ADH組與DCIS組比較有明顯差異（P＜0.01），與UDH組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，其陽性染色呈遞減）。

表1 p63在乳腺不同病理類型中的表達(dá)（例）

2.2 MIB-1在乳腺不同病理類型中染色結(jié)果 MIB-1（ki-67抗原）在細(xì)胞核中表達(dá)，陽性染色者細(xì)胞核呈棕黃色，從ADH到DCIS再到IDC，ki-67表達(dá)水平逐漸增高，而且在IDC組中MIB-1主要表達(dá)于癌細(xì)胞核，在癌細(xì)胞向間質(zhì)浸潤最明顯之處，其表達(dá)最強(qiáng)（圖1）。

圖1 MIB-1在乳腺不同病理類型中染色結(jié)果[a：ADH；b：DCIS；c：IDC（30%）；d：IDC（70%）；EnVision染色，×400]

2.3 MIB-1在IDC組表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。由表2可見，MIB-1在IDC組表達(dá)與病理分期、分子分型有關(guān)（P＜0.05），臨床分期晚（Ⅲ、Ⅳ期）、分子分型為HER-2型、三陰性患者，其PI均分別顯著高于臨床分期早（Ⅰ、Ⅱ期）、分子分型為管腔型和正常乳腺細(xì)胞型（P＜0.05）的患者，而與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其個(gè)數(shù)無關(guān)。

表2 MIB-1在IDC組表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞的異常增殖相關(guān)。本組病例著重研究p63、MIB-1在乳腺良性上皮增生向惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)展過程中的基因表達(dá)情況，從而探究與乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性。p63是一種抑癌基因，可表達(dá)于多種器官的基底細(xì)胞，在乳腺組織中通常只表達(dá)于肌上皮，而在乳腺腺上皮、間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞和血管平滑肌中不表達(dá)[3]。因此文獻(xiàn)報(bào)道p63在乳腺癌中可作為抑癌基因發(fā)揮阻止乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要功能[4-5]。本研究結(jié)果顯示p63在UDH、ADH中呈陽性表達(dá)，在DCIS中呈弱陽性表達(dá)，而在IDC中呈陰性表達(dá)。且隨著異型性的增加，陽性度逐漸減弱，IDC與其余各組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ADH與DCIS相比有明顯差異，但與UDH比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這與國外文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]，因此p63蛋白的抗原性較強(qiáng)，是乳腺肌上皮較為敏感和特異的抗體，可以區(qū)別良性上皮增生與浸潤性導(dǎo)管癌，但不能區(qū)分UDH與ADH，Werling等[7]報(bào)道了極少數(shù)IDC患者仍見局灶狀癌細(xì)胞表達(dá)p63，可能認(rèn)為表達(dá)的癌細(xì)胞有基底或上皮細(xì)胞分化的傾向。因此p63特別對某些形態(tài)學(xué)不典型的病例或有分化改變的癌細(xì)胞，其表達(dá)仍存在一定的假陽性。

MIB-1（ki-67抗原）是一種貫穿表達(dá)于增殖細(xì)胞中的核抗原，有兩種變異體，在維持細(xì)胞增殖活動(dòng)中起重要作用，它存在于細(xì)胞周期中除有絲分裂G0期以外的所有階段，并且在M期達(dá)到高峰，由于其半衰期短，可以準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖活性，其結(jié)果明顯優(yōu)于PCNA指數(shù)、DNA指數(shù)、DNA倍體含量等表示細(xì)胞增殖的指標(biāo)[8]。因此MIB-1是近年來認(rèn)為更能有效評估腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)記物，已成為檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性最可靠的指標(biāo)[9]。MIB-1可以很好地反映宮頸癌、鼻咽癌、肝癌等細(xì)胞增殖情況，目前國內(nèi)已有不少研究報(bào)道，MIB-1表達(dá)陽性率高者，其腫瘤惡性程度高，細(xì)胞增殖活躍，腫瘤侵襲性強(qiáng)，預(yù)后較差。而MIB-1在乳腺癌細(xì)胞增殖表達(dá)情況研究不多。國外文獻(xiàn)報(bào)道乳腺癌ki-67表達(dá)的高低對評價(jià)細(xì)胞的增殖狀態(tài)、癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及總體生存率等預(yù)后的評估具有重要價(jià)值[10]。本組研究結(jié)果顯示MIB-1標(biāo)記的PI在UDH、ADH、DCIS、IDC組分別為2.25±0.54，4.08±0.57，5.50±0.56，30.22±2.41，反映出從 UDH到ADH、DCIS，再到IDC，PI顯著升高，3者間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），而在IDC中，MIB-1表達(dá)與臨床病理分期、分子病理分型有關(guān)，與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)。研究結(jié)果顯示PI與乳腺腫瘤的臨床分期呈正相關(guān)，隨著腫瘤分期增高，ki-67的陽性率明顯增高，且各期陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。盡管長期以來臨床分期被作為乳腺癌最重要的預(yù)后因素，但臨床上分期相同的患者，其預(yù)后仍不全一樣，說明乳腺癌的預(yù)后與多種因素相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，MIB-1的PI與病理分子分型有關(guān)，HER-2型、三陰性型的PI高于管腔型A或B患者。這與國外學(xué)者報(bào)道的文獻(xiàn)一致[11]?？梢娤嗤R床分期的患者，其預(yù)后情況不盡相同，MIB-1可作為同期乳腺癌的預(yù)后判斷較好的標(biāo)記物之一，在IDC組MIB-1過度表達(dá)者預(yù)示癌細(xì)胞增殖活躍，更易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，并且可能是癌預(yù)后不良的指標(biāo)[12]。

可見MIB-1隨ADH病變到細(xì)胞增殖功能的進(jìn)行性失調(diào)，從正常上皮發(fā)展到浸潤性生長到腫瘤晚期，MIB-1標(biāo)記指數(shù)顯著上調(diào)；而p63表達(dá)呈顯著下調(diào)，MIB-1過度表達(dá)者，乳腺異型增生細(xì)胞及癌變細(xì)胞的增殖能力均顯著增強(qiáng)。有學(xué)者報(bào)道[13-14]，MIB-1可作為晚期腫瘤放化療療效的預(yù)測因素，MIB-1高表達(dá)者對放化療敏感性高，其療效好。另有研究表明ki-67可作為乳腺癌化療敏感性指標(biāo)，腫瘤細(xì)胞增殖率的降低比腫瘤腫塊的縮小更能反映腫瘤對化療的敏感程度。因此聯(lián)合檢測MIB-1、p63基因不僅可以將乳腺UDH與DCIS、IDC 3者之間進(jìn)行鑒別，還可以完整地反映乳腺疾病細(xì)胞增殖的演變過程及預(yù)后判斷；動(dòng)態(tài)檢測MIB-1還有助于臨床醫(yī)生更精確地分析乳腺癌的高危復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移因素，為臨床個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

[1] Otterbach F,Bankfalvi A,Bergner S,et al.Cytokeratin 5/6 immunohistochemistry assists the differential diagnosis of atypical proliferations ofthe breast[J].Histopathology,2000,37(25):232.

[2] 江忠淸,連成英,林岷,等.宮頸鱗癌組織埃茲蛋白表達(dá)與局部浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志,2007,3（6）:308-312.

[3] Barbareschi M,Pecciarini L,Cangi M G,et al.p63,a p53 homologue,is a selective nuclear marker of myoepithelial cells of the human breast[J].Am J Surg pathol,2001,25(8):1054.

[4] D2-40/p63 defined lymphvessel invasion has additional prognostic value in highly proliferating operable node negative breast cancer patients[J].Mod Pathol,2011,24(4):502-11.

[5] Clinical relevance of the putative stem cell marker p63 in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2010,122(3):765-75.

[6] Batistatou A,stefanou D,ArkoumaniE,et al.The usefulness ofp63 as a markerofbreast myoepithelialcells[J].In Vivo,2003,17(6):573.

[7] Werling R W,Hwang H,Ysziji H,et al.Immunohistochemical distinction of invasive from noninvasive breast lesions[J].Am J Surg Pathol,2003,27(1):82.

[8] Duchrow M,Gerdes J,Schluter C,et al.The proliferation associated Ki-67 protein:definition in molecular terms[J].Ceil Prolf, 1994,27(5):235-242.

[9] Hall P A,Levison D A,Woods A L,et al.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)immunolocalization in paraffin sections:an index of cellproliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms[J].J Pathol,1990,162(4):285-294.

[10] Stuart-Harris R,Caldas C,Pinder S E,et al.Proliferation markers and survival in early breast cancer:a systematic review and meta-analysis of85studies in 32,825 patients[J].Breast,2008,17 (4):323-334.

[11] Niikura N,Masuda S,Kumaki N,et al.Prognostic significance of the Ki67 scoring categories in breast cancer subgroups[J]. Clin Breast Cancer,2014,14(5):323-329.

[12] Saadettin Kilickap,Yalcin Kaya,Birsen Yucel,at al.Higher Ki67 Expression is Associates With Unfavorable Prognostic Factors and Shorter Survival in Breast Cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(3),1381-1385.

[13] Nakano T,Ohno T,Ishikawa H,et al.Current advancement in radiation therapy for uterine cervical cancer[J].J Radiat Res, 2010,51(1):l-8.

[14] CabibiD,GiovannelliL,Martorana A,et al.Predictive role of histologicalfeatures and Ki-67 pattern on high-riskHPVpresence in atypicalcervicallesions[J].Histopathology,2007,51(5):713-716.

Significance and expressions of cell proliferation markers(MIB-1 and p63)in Breast carcinoma

ZHOU Juandi，XIE Shangnao，CAI Yuanjie，et al.Department of breastsurgery，Zhejiang Hospital，Hangzhou 310013，China

【 Abstract】 Objective To explore the significance and expressions of cell proliferation markers ((MIB-1 and p63)in the differential diagnosis of benign and malignant breast lesions. Methods experiment group，including atypical duct hyperplasia (ADH,n=24),duct in situ arcinoma(DCIS,n=20)and invasive duct carcinoma(IDC,n=45),were obtained from our department according to the WHO classification of the breast cancer(2003)[1].Usual duct hyperplasia(UDH,n=20)as control group.The immunohistochemical method was performed to detect expressions of MIB-1 and p63. Results In UDH,ADH and DCIS,the expressions of p63 were mainly located in the myoepithelial cells surrounding the glands,There was no deference among ADH and DCIS,In contrast to,UDH,the positive rate for p63 was significantly decreased in ADH and DCIS.In IDC focal positive cells for p63 was seened/t in the any case.The staining reaction of MIB-1 was maily confined to the cellular nucleus the cervical neoplasm.The PI labeled by MIB-1 in UDH,ADH,DICS and IDC groups were 2.25±0.54、4.08±0.57、5.50±0.56 and 30.22± 2.41 respectively.The PI increased remarkably from UDH ADH TO DCIS and then to IDC accordingly(P＜0.05).In contrast to p63 ,the expressions of p63 were reduced remarkably.In IDC,MIB-1-high tumors were significantly associated with advanced stage (Ⅲ-Ⅳ)(P＜0.05)and Triple negative.But there has no something with ages,tumors in size,grade and lymphnode postivity(P＞0.05). Conclusion A panel of myoepithelial markers,including MIB-1 and p63,can be used to differentiate the benign and malignant breast lesions.Else,The level of ki-67 expression was also presented as a progrnostic factor predicting the treatment and risk stratification of breast cancer patients in future.

Breast tumor Proliferating cellMIB-1 p63

2016-05-20）

（本文編輯：田云鵬）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般研究計(jì)劃項(xiàng)目（2013KYB12）

310012 杭州，浙江醫(yī)院乳腺外科

周娟娣，E-mail：zjd731@126.com

p63在UDH、ADH、DCIS組中均有不同程度的陽性表達(dá)，主要表達(dá)于導(dǎo)管周圍的肌上皮，ADH、DCIS兩組間無明顯差異，但與UDH組相比，其陽性表達(dá)率明顯下降，在IDC組中p63幾乎不表達(dá)；MIB-1主要表達(dá)于增殖細(xì)胞中的核抗原，陽性染色定位于腫瘤細(xì)胞核，MIB-1標(biāo)記的增殖指數(shù)PI在UDH、ADH、DCIS、IDC組分別為2.25±0.54、4.08±0.57、5.50±0.56、30.22±2.41，從UDH到ADH、DCIS，再到IDC，PI顯著升高，p63表達(dá)呈逐漸減弱。MIB-1在IDC表達(dá)與臨床病理分期、分子分型有關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其個(gè)數(shù)無關(guān)，臨床分期越晚（Ⅲ、Ⅳ期）、分子分型為HER-2型、三陰性患者，其PI均分別高于臨床分期早（Ⅰ、Ⅱ期）、分子分型為管腔型A或B患者（P＜0.05）。結(jié)論 聯(lián)合檢測p63、MIB-1可以較好地反映乳腺增生性病變的程度，正確鑒別乳腺的良惡性病變，通過檢測MIB-1的增殖表達(dá)水平可預(yù)測乳腺惡性腫瘤的浸潤程度及整體預(yù)后評估。