李 婧， 尤元義， 石慶喜， 李 旭

(西安交通大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

?

·儀器設(shè)備供應(yīng)與管理·

Leica DMI6000 B活細胞工作站的配置及應(yīng)用

李 婧， 尤元義， 石慶喜， 李 旭

(西安交通大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

通過介紹Leica DMI6000 B活細胞工作站(Live Cell Application, LCA)的配置和技術(shù)參數(shù)，樣品制備要求，圖像采集的參數(shù)設(shè)置原則等，并以實例講解LCA目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。DMI6000 B配有細胞孵育系統(tǒng)和圖像采集系統(tǒng)，孵育系統(tǒng)對活細胞進行常氧或缺氧培養(yǎng)，圖像采集系統(tǒng)實時采集細胞圖像。圖像采集系統(tǒng)中的焦平面跟蹤系統(tǒng)，可防止在延時拍攝中圖像變虛；明場與熒光多通道采集，可幫助實現(xiàn)活細胞熒光示蹤；多位點采圖，可幫助實現(xiàn)多視野動態(tài)觀察；拼接掃描可采集樣本全景圖像；z軸掃描可對樣本進行立體觀察。LCA具有倒置熒光顯微鏡和細胞培養(yǎng)箱的雙重功能，可跟蹤觀察活細胞的動態(tài)變化；DMI6000 B還可在缺氧條件下完成上述功能。

活細胞工作站； Leica DMI6000 B； 延時拍攝； 配置及應(yīng)用

0 引 言

LCA是對活細胞進行不同水平動態(tài)研究的一款新儀器，對活細胞在培養(yǎng)的同時進行圖像采集，彌補了傳統(tǒng)顯微鏡只能定時觀察的不足。LCA在細胞水平可以實現(xiàn)定性與定量分析、活細胞圖像處理、活細胞動態(tài)示蹤，如研究活細胞增殖、遷移[1]、侵襲[2]、凋亡[3]、內(nèi)吞[4]等生物學(xué)現(xiàn)象，細胞遷移過程的動態(tài)評估[5]、細胞遷移速率及軌跡的研究[6]、精卵結(jié)合過程研究[7]、受精卵起始72 h發(fā)育觀察[8]。在分子水平可做到基因定位定量表達的動態(tài)分析，如蛋白質(zhì)翻譯[9]、降解、運輸、蛋白質(zhì)相互作用的動態(tài)研究、蛋白質(zhì)合成與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞骨架(細胞3D結(jié)構(gòu)重建及空間定位)、細胞骨架的代謝動力學(xué)測定、細胞周期各時相的動態(tài)觀察[10]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET、熒光示蹤[11]等。因此，熟悉該儀器的配置和使用對從培養(yǎng)的細胞獲取更多有價值的研究資料具有非常重要意義。

1 Leica DMI6000 B配置和技術(shù)參數(shù)

(1) DMI6000 B倒置研究型熒光顯微鏡。該顯微鏡包含五個物鏡鏡頭：5×，10×，20×，40×，63×(油鏡)。其中5×，10×，20×物鏡具有相差功能。

顯微鏡使用EL6000緊湊型光源，熒光光源為汞燈，包含A、I3、N2.1三個熒光濾塊。A為UV激發(fā)藍光，激發(fā)光波長范圍：340～380 nm，發(fā)射光波長425 nm；I3為藍光激發(fā)綠光，激發(fā)光：450～490 nm，發(fā)射光515 nm；N2.1為綠光激發(fā)紅光，激發(fā)光：515～560 nm，發(fā)射光590 nm。

顯微鏡配有shuttle開關(guān)，用于減少延時拍攝中光源對樣本的損傷。每次采圖，shuttle自動打開，光源照射樣本采圖；采集完畢，shuttle自動關(guān)閉。

(2) PECON O2-CO2-℃孵育系統(tǒng)。該系統(tǒng)可提供的細胞常規(guī)培養(yǎng)條件：5%CO2，37 ℃恒溫，飽和濕度；可達到的缺氧濃度范圍1%～10%。

系統(tǒng)核心構(gòu)成包括五部分：孵育器S.，加熱插件P或M96，3700 CTI控制器，37-2型電子溫控器，氧氣控制器。另外還配有CO2氣瓶、氮氣氣瓶和加濕器等。

系統(tǒng)工作原理：孵育器和加熱插件構(gòu)成培養(yǎng)細胞的密閉小室；氮氣或壓縮空氣通過氧氣控制器和加濕器后，與CO2氣體共同進入CTI控制器加熱并混合，再輸出進入小室，為細胞提供常氧或缺氧培養(yǎng)環(huán)境。電子溫控器調(diào)控加熱插件及混合氣體溫度，溫控范圍10～40 ℃；CTI控制器調(diào)控CO2濃度，調(diào)控范圍2%～7.5%；氧氣控制器通過調(diào)控氮氣進入的流速來調(diào)控缺氧濃度。

(3) 焦平面跟蹤系統(tǒng)AFC(Adaptive Focus Control)。AFC可根據(jù)實驗時間及細胞空間位置(尤為垂直方向)的改變自動調(diào)節(jié)焦平面，確保在整個延時拍攝中，持續(xù)獲得樣本最清晰圖像。

AFC還可幫助實現(xiàn)多點延時拍攝，其AFC+HighSpeed模式可自動、快速調(diào)節(jié)不同視野的焦平面，消除因數(shù)次位置移動帶來的圖像變虛。

(4) CCD相機。配置了Leica DFC365FX，一款擁有144萬像素的高端熒光全幀CCD相機。它在信號較弱時，仍能采集到清晰的熒光照片，并可扣除樣本雜背景。

相機擁有標(biāo)準(zhǔn)和NIR兩種采集模式。NIR為近紅外模式，可采集并增強波長大于700 nm的近紅外波段，彌補了常規(guī)顯微鏡不能敏銳檢測近紅外波段熒光的缺陷。

(5) AF6000寬場系統(tǒng)。該系統(tǒng)成像原理為“面成像”，即一個時間點獲得整個二維圖像，區(qū)別于激光共聚焦的點成像，點成像是對樣本焦平面實現(xiàn)點照明，點掃描[12]。

(6) 操作和分析軟件。LAS AF 2.5操作軟件。

2 活細胞工作站樣品制備要求

(1) 待觀察樣品。貼壁或懸浮細胞、部分活體組織(DFC365FX相機說明書提及的三日齡黑腹果蠅幼蟲)。

(2) 熒光染料的選擇。參考前述1.1，熒光濾塊的觀察范圍。

(3) 培養(yǎng)器材的選擇。延時拍攝可選擇器材：直徑為35 mm或60 mm細胞培養(yǎng)皿、激光共聚焦專用皿、POC-R2顯微鏡細胞組織培養(yǎng)系統(tǒng)(見圖1)、96孔板、三維培養(yǎng)Lab-Tek Chamber Slide(見圖2)等。

圖1 POC-R2系統(tǒng)

圖2 Lab-Tek chamber slide

普通拍攝可選擇器材：不同直徑細胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、孔板、載玻片(選用0.13～0.17 μm厚度的蓋玻片[13])等。

3 Leica DMI6000 B圖像采集基本參數(shù)設(shè)置

3.1 長時間定時拍攝(延時拍攝)

(1) 時間序列采圖。單擊激活t選項，設(shè)置采集兩張圖片的時間間隔、采集圖像總時間或總循環(huán)數(shù)等(如，每15 min拍攝一張，拍攝8 h)。將圖像調(diào)節(jié)清晰后，選擇Adaptive Focus Control模式，勾選AFC on、on demand mode、Hold current position，開啟圖像采集。

(2) 多位點采圖。激活“Mark & Find”選項。在該選項中點擊相應(yīng)圖標(biāo)，可存儲或刪除某位置，設(shè)置完畢，點擊Start，儀器會按照設(shè)定的位置逐一采圖；還可實現(xiàn)多位點延時采圖，此時需開啟AFC+HighSpeed 模式，如前1.3述。

(3) 多通道采圖。點擊“+”“-”設(shè)置通道(FCr)數(shù)量，通過色表(LUT selection)為通道設(shè)定偽彩；在光路設(shè)置(Light Path Settings)中，通過Contrast Method選擇觀察方式如，明場BF、微分干涉DIC、熒光FLUO。

3.2 熒光采圖

在激發(fā)光濾片(Excitation Filter)中選擇合適的濾光片，如，A、I3、N2.1，見前述1.1。

將激發(fā)光強度(Intensity)調(diào)至4或5，若熒光染料抗淬滅性差可調(diào)至3；曝光時間(Exposure)200 ms左右最佳，最長不超過1 s；攝像頭信號的電子增益(Gain)不宜過高，建議調(diào)至2。

3.3 拼接掃描

激活“Tile Scan”選項，點擊鼠標(biāo)定義某區(qū)域的兩個對角位置，可拼接多個相鄰視野，獲得大視野圖像。樣本較厚且要進行熒光拼接掃描時，需同時啟動z軸掃描，設(shè)定采圖上、下限，以獲得最清晰圖像(見圖5)。

3.4 z軸序列采圖

激活z選項，z-position代表焦平面當(dāng)前位置。調(diào)節(jié)好樣本焦平面后，點擊并挪動立方體兩側(cè)箭頭設(shè)置z軸掃描上限(Begin)和下限(End)，點擊Start，儀器會采集該樣本不同層面的圖像。

4 活細胞工作站主要功能及在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

4.1 明場條件下的延時拍攝

明場條件下的延時拍攝通過時間序列掃描，對活細胞進行長時間培養(yǎng)及觀察，實現(xiàn)對活細胞的動態(tài)研究。實驗結(jié)果既可導(dǎo)出隨時間改變的序列組圖，也可導(dǎo)出Movie。具體應(yīng)用如，單細胞示蹤、實時觀察細胞遷移[1]、侵襲[2]、凋亡[3]、增殖(見圖3)、內(nèi)吞[4]、融合[14]等生物學(xué)過程。

圖3 明場延時拍攝卵巢癌細胞SKOV3的增殖過程(100×)

細胞在傳代后4 h貼壁，19 h左右展現(xiàn)出完整形態(tài)，21 h變球形準(zhǔn)備分裂，22 h第一次分裂完成；51 h其中一個子代細胞變球形準(zhǔn)備分裂，51.5 h分裂完成；59 h另一個子代細胞變球形準(zhǔn)備分裂，60 h分裂完成。最終由一個細胞生成4個細胞。

4.2 多通道圖像采集與熒光示蹤

多通道圖像采集可同時進行明場與熒光延時拍攝，并進行后期不同通道圖像疊加，可實現(xiàn)熒光示蹤等功能。用于觀察記錄細胞內(nèi)外某特定成分的動態(tài)變化過程。如，熒光示蹤細胞周期中核的動態(tài)變化過程(熒光標(biāo)記細胞核)[10]、老鼠胚胎干細胞體外發(fā)育過程(胞質(zhì)表達熒光融合蛋白)[15]、小鼠卵母細胞后期成熟與極體排放過程(熒光標(biāo)記DNA)[11]、腫瘤細胞凋亡過程(GFP標(biāo)記細胞核)[16]、成釉細胞內(nèi)吞熒光標(biāo)記蛋白的過程[17]、熒光標(biāo)記的siRNA片段轉(zhuǎn)染細胞過程(見圖4)等。

每張圖像右上角表示拍攝時間(時：分：秒：毫秒)。組圖依次為轉(zhuǎn)染后0，1，2 h直至8 h的明場與熒光疊加圖像。隨時間延長，細胞內(nèi)綠色熒光增多，說明通過轉(zhuǎn)染進入細胞的siRNA片段增多。

4.3 拼接掃描

拼接掃描可用于拍攝明場或熒光條件下的組織全景圖、細胞或組織大視野圖(見圖5)。

4.4 z軸掃描

用于觀測樣品空間結(jié)構(gòu)和空間定位。

4.5 缺氧培養(yǎng)

4.1及4.2所述功能也可在缺氧條件下進行，大大拓寬了該儀器的應(yīng)用范圍。

圖4 雙通道延時拍攝FAM標(biāo)記的siRNA片段轉(zhuǎn)染SKOV3細胞過程(200×)

圖5 銀杏樹枝橫截面 熒光拼接掃描局部圖(200×)

5 活細胞工作站維護與管理

5.1 日常維護

(1) 嚴(yán)格遵守儀器操作流程，避免因操作不當(dāng)造成儀器損壞。

(2) 整個操作過程不要有液體流入系統(tǒng)，保持系統(tǒng)干燥和清潔，以防真菌生長。

(3) 使用完畢，切斷電源，清潔物鏡目鏡。鏡頭表面用擦鏡紙蘸取少量無水酒精，從中心往外周螺旋式擦拭。擦拭時勿對鏡頭表面施加壓力。鏡頭表面浸油可先用擦鏡紙抹去，再蘸取酒精擦拭。

(4) 顯微鏡表面和任何塑料部件只可用清水擦拭，不可使用有機溶劑。光學(xué)部件表面灰塵可用吸耳球吹去。

(5) 房間最適溫度15～25 ℃，濕度60%；系統(tǒng)工作溫度15～40 ℃(顯微鏡切勿超過40 ℃)。

5.2 使用過程注意事項

(1) 載物臺初始化：打開顯微鏡前，務(wù)必先將密閉小室從通氣與出氣管上取下，放在合適位置。否則開啟顯微鏡，載物臺自動初始化會使小室發(fā)生劇烈震動，損害儀器；

(2) 啟動多位點拍攝前載物臺初始化：開啟軟件時再做一次初始化。

(3) CTI控制器預(yù)熱30 min后再輸入CO2。若做缺氧培養(yǎng)，先輸入CO2，再輸入氮氣。

(4) 加濕器內(nèi)最多加入350 mL水。

(5) 使用63×油鏡時，需使用顯微鏡DRY/IMM按鈕完成切換。

(6) 圖像和數(shù)據(jù)資料必須用光盤刻錄，嚴(yán)禁使用U盤。

[1] Gujral T S, Chan M, Peshkin L. A Noncanonical Frizzled2 Pathway Regulates Epithelial-Mesenchymal Transition and Metastasis[J]. Cell.2014, Cell159: 844-856.

[2] Wong A D, Searson P C. Microvessel Platform Live-Cell Imaging of Invasion and Intravasation in an Artificial [J]. Cancer Res 2014, 4937-4945.

[3] Poon I K H, Chiu Y H, Armstrong A J. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis [J]. Nature, 2014, Vol507:329-334.

[4] Overholtzer M, Mailleux A A, Mouneimne G. A Nonapoptotic Cell Death Process, Entosis, that Occurs by Cell-in-Cell Invasion[J]. Cell, 2007, Cell131: 966-979.

[5] 胡劍江，雷洪濤，侯燕鳴. 腫瘤細胞遷移過程中的動態(tài)評估方法[J]. 中國藥理學(xué)通報，2010， 26(1): 128-131.

[6] 易誠青，姚愛華，馬春輝.裝載趨化因子CXCL13的中空羥基磷灰石微球?qū)﹂g充質(zhì)干細胞的趨化效應(yīng)研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報，2012，32(12):1532-1535.

[7] YAMASHITA M, YAMAGATA K, TSUMURA K. Acrosome Reaction of Mouse Epididymal Sperm on Oocyte Zona Pellucida[J]. Journal of Reproduction and Development, 2007, 53(2):255-262.

[8] Chawla M, Fakih M, Shunnar A. Morphokinetic analysis of cleavage stage embryos and its relationship to aneuploidy in a retrospective time-lapse imaging study[J]. EMBRYO BIOLOGY, 2014.

[9] Calmettes G, Weiss JN, Degtyar VE. A Quantitative Method to Track Protein Translocation between Intracellular Compartments in Real-Time in Live Cells Using Weighted Local Variance Image Analysis[J]. PLoS one, 2013, 8(12).

[10] Sakaue-Sawano A, Kurokawa H, Morimura T. Visualizing Spatiotemporal Dynamics of Multicellular Cell-Cycle Progression[J]. Cell, 2008, Cell132: 487-498.

[11] 畢 曄，張克梅. 活細胞工作站技術(shù)在小鼠卵母細胞實時觀察中的應(yīng)用[J]. 臨床檢驗雜志，2011，29(9):678-679.

[12] 段 妍，關(guān)苑君，藍秀健. Zeiss LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡的使用和管理[J]. 實驗室研究與探索，2012,31(8):228-230,239.

[13] 邊 瑋. 激光共聚焦顯微鏡樣品制備方法(二)組織切片樣品[J]. 電子顯微學(xué)報，2010,29(4):399-402.

[14] 俞索靜，肖魯偉，吳承亮. 破骨細胞血系起源的活細胞成像觀察[J]. 中國骨傷，2012， 25(4):317-323.

[15] Nowotschin S, Eakin G S, Hadjantonakis A K. Live-imaging fluorescent proteins in mouse embryos: multi-dimensional, multi-spectral perspectives [J]. Trends in Biotechnology, 2009, 266-276.

[16] 趙凱迪，高 靜，李 香. 吡啶錳配合物誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的作用及對線粒體功能的影響[J]. 中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2012，34(6):544-554.

[17] 楊 婷，周 濤，段小紅. 成釉細胞受體介導(dǎo)的內(nèi)吞功能的研究[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(3):307-310.

·知識園地·

摘要的分類

按摘要的不同功能來劃分，大致有如下3種類型：報道性摘要、指示性摘要、報道—指示性摘要。

本刊要求科技論文寫成報道性摘要，而對綜述性、資料性或評論性文章可寫成另兩種摘要形式，下面著重介紹報道性摘要。

報道性摘要是指明一次文獻的主要范圍及內(nèi)容梗概的簡明摘要，相當(dāng)于簡介。報道性摘要一般用來反映科技論文的目的，方法及主要結(jié)果與結(jié)論，在有限的字?jǐn)?shù)內(nèi)向讀者提供盡可能多的定性或定量的信息，充分反映該研究的創(chuàng)新之處?？萍颊撐娜绻麤]有創(chuàng)新內(nèi)容，如果沒有經(jīng)得起檢驗的與眾不同的方法或結(jié)論，是不會引起讀者的閱讀興趣的，所以本刊選用報道性摘要，以比其他類摘要字?jǐn)?shù)稍多的篇幅，向讀者介紹論文的主要內(nèi)容，以“摘錄要點”的形式報道出作者的主要研究成果和比較完善的定量及定性的信息。篇幅以300字左右為宜。

(本編輯部摘編)

Configuration and Application of Live Cell Application Leica DMI6000 B

LIJing,YOUYuan-yi,SHIQing-xi,LIXu

(The First Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

This paper introduces the configuration and function of Leica DMI6000 B Live Cell Application. It aims to expand applications of LCA in the field of biomedical research. The configuration and technical parameters, sample preparation requirements, parameter setting principles of image acquisition etc are comprehensively introduced, examples of applications of LCA in biomedical research are given. DMI 6000 B is equipped with incubating system as well as image acquiring system, the latter acquires real-time cell images when the former incubates cells in normoxia or hypoxia. In order to capture successive clear images in time-lapse imaging, adaptive focus control of image acquiring system is needed. The bright and fluorescence field help to realize living cell fluorescence trace, and multi-position image acquisition helps to get real-time cell images of several fields meanwhile. Tile scan supplies overview image of a sample; z-menu scans samples in three-dimensional. Therefore, LCA can be used for observing the dynamic changes of the cultured living cells since it integrates the function of inverted fluorescence microscope with cell culture incubator, furthermore, DMI6000 B can accomplish functions mentioned above in hypoxia.

live cell application; Leica DMI6000 B; time-lapse imaging; configuration and application

2015-04-15

國家自然科學(xué)基金面上項目(81372151)

李 婧(1984-)，女，陜西西安人，碩士，助理研究員，主要從事科研儀器設(shè)備與實驗室管理。

Tel.: 029-85323528, 18291420181; E-mail: li-jing-smile@163.com

李 旭(1956-)，男，陜西西安人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤學(xué)方面的研究。

Tel.: 029-85323528; E-mail: lixu56@mail.xjtu.edu.cn

Q 334

A

1006-7167(2016)02-0273-04