楊陽　霍文珊　周政　張琪　曾涵

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新能源材料化學(xué)實驗室，烏魯木齊830054)

固定漆酶聚苯胺-CoC2O4納米復(fù)合物修飾電極的直接電化學(xué)

楊陽霍文珊周政張琪曾涵＊

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新能源材料化學(xué)實驗室，烏魯木齊830054)

采用循環(huán)伏安法、微分脈沖伏安法、交流阻抗譜以及計時電流法等電化學(xué)方法，結(jié)合紅外光譜、紫外-可見分光光度法、原子力顯微鏡、透射電子顯微鏡以及原子吸收光譜等輔助手段，表征了固定漆酶的聚苯胺-草酸鈷納米復(fù)合物的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和形貌，測試了納米復(fù)合物固酶前后的導(dǎo)電性能的變化，研究了納米復(fù)合物修飾電極上固定漆酶的直接電化學(xué)行為，評估了該電極的催化氧還原效能以及作為電化學(xué)傳感器檢測氧分子的性能。實驗結(jié)果表明該電極在不含電子介體的溶液中以酶活性中心T2作為首要電子受體，將得到電子傳遞給化學(xué)吸附的氧氣使其被電還原，其表觀電子遷移速率為0.017 s-1，且具有良好的催化氧還原性能(氧還原起始電位:460 mV vs NHE，轉(zhuǎn)化氧分子為水的表觀速率常數(shù)為2.6×10-4s-1)，酶電催化氧還原為水分子步驟為反應(yīng)的速控步。該電極作為電化學(xué)傳感器對氧具有極低檢測限(0.20μmol·L-1)，寬線性響應(yīng)范圍(0.4～7.5μmol·L-1)以及對底物高親和力(KM=122.4μmol·L-1)等優(yōu)勢。

聚苯胺-草酸鈷納米復(fù)合物；漆酶；直接電化學(xué)；催化氧還原反應(yīng)；電化學(xué)傳感器

0　引言

酶燃料電池是一種新型，對環(huán)境友好的能量來源，一般認為限制酶燃料電池能量輸出性能的最重要因素在于陰極氧還原反應(yīng)，而提高氧還原反應(yīng)效率的方法除了提升固酶載體對氧的親和力，化學(xué)吸附氧的性能以及氧在介質(zhì)中的傳質(zhì)動力學(xué)之外，更重要的是要改善酶-導(dǎo)電基體間的電子遷移性能[1]。漆酶(Laccase，簡稱為Lac)可以在催化酚類，有機雜環(huán)化合物氧化的同時，按照四電子機制將化學(xué)吸附的氧分子轉(zhuǎn)化為水分子而不經(jīng)過生成過氧化氫的中間過程[2]。Lac由于具有較高氧化還原式電位，對底物選擇性高以及較快的催化反應(yīng)速率等優(yōu)勢，從而成為當前研究最多的一種酶基燃料電池陰極催化劑[1-4]，但Lac活性中心由于結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜且被不導(dǎo)電的多肽鏈包覆在蛋白質(zhì)內(nèi)部，難以實現(xiàn)酶-電極間直接電子導(dǎo)通[5]。迄今為止文獻報道實現(xiàn)酶-電極間有效電子導(dǎo)通的方法仍然存在一些缺陷：使用電子中介體會降低電池的輸出能量密度，小分子有機物作為電子介體對生物體有毒副作用且易變性[6-7]，穩(wěn)定性較差，不適宜作為體內(nèi)電化學(xué)器件組分使用[7]；制備氧化還原水凝膠的工序復(fù)雜，成本高，機械穩(wěn)定性和pH值耐受性都不夠好，加上制備過程中需要使用貴重金屬，也不適合在生物體內(nèi)使用；而基于含大共軛π鍵的芳香化合物修飾納米器件吸附酶的酶基電極也存在不足：制備電極時使用有毒且性質(zhì)不穩(wěn)定，易燃燒或爆炸的化合物，電流輸出密度不高，催化劑無法回收，長期使用穩(wěn)定性欠佳等[8-11]。一般認為以直接的方式實現(xiàn)酶-電極間有效電子遷移是提高酶燃料電池和酶基電化學(xué)傳感器性能的最有效途徑[12-13]，常見的方法包括將酶分子固定在表面含有能和酶活性中心發(fā)生某些有效相互作用的載體，或者以自組裝的方式將某些既能在導(dǎo)電基體表面可逆得失電子，又可以與酶活性中心進行有效電子交換的官能團或分子與酶分子以靜電吸引，化學(xué)偶聯(lián)或配位等方式整合于導(dǎo)電基體。這些載體包括金屬氧化物納米管[3]，碳納米管[4]，金屬含氧酸鹽層狀納米片[12]，以及水凝膠-無機納米材料復(fù)合物[13]等。目前文獻[8-10,14-15]所見多數(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)酶-電極間直接電子遷移的Lac基電極，在沒有外加介體存在時一般觀察不到表征酶活性中心發(fā)生電子遷移的電化學(xué)信號，這就給深入研究固酶電極催化反應(yīng)機制帶來一定的困難。定量研究固酶電極結(jié)構(gòu)參數(shù)對固酶電極催化底物反應(yīng)性能的影響，電極表面固定酶分子催化底物的反應(yīng)動力學(xué)，反應(yīng)決速步和限制固酶電極催化性能的主要因素的確定依然是制備高性能酶燃料電池亟待解決的難題。聚苯胺因其合成制備簡易，結(jié)構(gòu)易于調(diào)控，導(dǎo)電性能優(yōu)越等優(yōu)勢，在二次電池電極材料以及傳感器等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[16]，文獻[16-17]研究表明聚苯胺或聚苯胺衍生物接枝多壁碳納米管對氧還原反應(yīng)有著良好的催化性能，但其缺陷在于長期使用性能較差。由于聚苯胺的導(dǎo)電性能還不足以和普通電子導(dǎo)體或離子導(dǎo)體相競爭，因此將導(dǎo)電聚合物與無機金屬納米粒子復(fù)合是一個合理的選擇。這種復(fù)合物結(jié)合了兩者的優(yōu)點從而具有獨特的力，光，電，磁，熱以及化學(xué)活性[18]。由于聚苯胺含有共軛大π鍵，易于依靠疏水-疏水作用接近Lac分子活性位附近的疏水分子結(jié)合位，因此被吸附的酶分子有較高概率實現(xiàn)酶活性中心與導(dǎo)電基體之間的直接電子遷移[19]。草酸鈷(CoC2O4)納米棒具有良好的力學(xué)性能和導(dǎo)電性能，其包含的羧基可與Lac分子表面氨基發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)，聚苯胺分子中的亞氨基氮原子與酶活性中心Cu2+之間可能存在的配位作用加上前述的疏水-疏水作用，聚苯胺-草酸鈷納米復(fù)合物可以依靠這三種作用的協(xié)同效應(yīng)將酶分子穩(wěn)定地固定在載體表面。這種協(xié)同作用也可能利于實現(xiàn)酶-導(dǎo)電基體之間的直接電子遷移。盡管如此，直接將這類納米復(fù)合物滴涂在基底電極表面并不能獲得穩(wěn)定的納米復(fù)合物修飾電極，仍然需要黏度較高，延展性較好的高分子聚合物作為成膜劑將固酶納米微粒牢固地附著在電極表面。目前最常用的高分子成膜劑是殼聚糖及其衍生物，這類化合物不導(dǎo)電，對生物分子具有良好的親和力。盡管部分這類化合物可以吸附氧分子，但研究表明這類化合物單獨使用并不能夠有效催化氧分子的電還原[6]。

本文以含有剛性芳環(huán)結(jié)構(gòu)的聚苯胺(PAn)與CoC2O4混合所得納米復(fù)合物作為固定Lac載體，制備了固定Lac基電極，以電化學(xué)技術(shù)結(jié)合光譜學(xué)方法研究了此固酶電極的直接電化學(xué)行為及催化氧還原性能，評估了其作為氧電化學(xué)傳感器的性能。這些研究不僅為研究高性能酶燃料電池提供了新的思路，也有利于進一步了解酶催化氧還原機制和活性中心在催化反應(yīng)中發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化，為開發(fā)仿生生物電子器件提供有益的探索經(jīng)驗。

1　實驗部分

1.1儀器和試劑

云芝漆酶(Lac，源自Trametes Versicolor，分子量68 000)，膽紅素氧化酶(BOD，源自M.Verrucaria.分子量79 000)，2,6-二甲氧基苯酚(DMP)購自美國Sigma化學(xué)試劑有限公司，直接使用無需進一步純化；殼聚糖(脫乙酰度不小于90%，分子量250 000，簡寫為CTS)，購自上海升耀生物技術(shù)有限公司；二水合草酸鈷(CoC2O4·2H2O)、草酸（H2C2O4·2H2O）和其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。實驗過程中使用的緩沖溶液為0.2 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液(PBS)，溶液pH值籍調(diào)節(jié)磷酸氫二鈉和檸檬酸溶液體積比例來調(diào)控；所有溶液均用Milli-Q超純水配制。N2，O2(優(yōu)級純，來自南京特氣)。2K15型高速離心機(德國Sigma公司)，BRUKER TENSOR-27型紅外光譜儀(德國BRUKER公司，KBr壓片)，日立z2000型原子吸收光譜儀(日本HITACHI公司，主機：單光束火焰/石墨爐原子吸收分光光度計，光譜范圍：190～900 nm)，U-2810型紫外可見分光光度計(日本島津公司，比色皿厚度1 cm)，透射電鏡照片以H-800型透射電子顯微鏡(日本日立JEOL公司，加速電壓：200 kV)拍攝，CSPM-5500型原子力顯微鏡(中國廣州本原納米儀器有限公司)，采用“輕敲”模式(tapping mode)；Zahner Zennium電化學(xué)工作站(Kronach，德國)，CHI-1140A型電化學(xué)分析儀(CHI Inc,上海辰華)，玻碳電極(GCE，直徑3 mm，購自天津艾達恒晟工貿(mào)有限公司)，飽和甘汞電極作為參比電極，對電極鉑絲電極自制。工作電極使用前先以3500#砂紙，1.0和0.5μm氧化鋁粉漿拋光，再用丙酮和三次重蒸水超聲清洗各2次，每次2 min。文中如無特殊說明，所有的電極電位均為相對于標準氫參比電極(NHE)而言。

1.2聚苯胺-CoC2O4納米復(fù)合物的制備

納米草酸鈷(CoC2O4)的制備過程參考文獻[18]簡述如下：將1.0 mmol CoC2O4·2H2O置于瑪瑙研缽中磨細，加入1.0 mmol研細的草酸，研磨反應(yīng)2 h后轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，加入50 mL水于70℃水浴中加熱反應(yīng)3 h，產(chǎn)物用超純水洗滌到中性，干燥。

將制備的納米CoC2O40.089 g超聲分散在50 mL草酸(0.5 mol·L-1)溶液中。加入0.75 mL苯胺單體，超聲40 min，按與單體1:1的物質(zhì)的量之比加入氧化劑過硫酸銨，繼續(xù)超聲50 min，產(chǎn)物過濾，用超純水和無水乙醇洗滌至濾液無色，55℃下真空干燥24 h，得到目標產(chǎn)物PAn-CoC2O4納米復(fù)合物。

1.3固酶納米復(fù)合物修飾電極的制備，直接電化學(xué)及催化氧還原性能

稱取2 mg PAn-CoC2O4納米復(fù)合物加入1 mL pH=4.4的磷酸鹽緩沖液，超聲分散30 min形成均勻穩(wěn)定的分散相，向其中加Lac 1 mg，磁力攪拌30 min后放置于0℃冰箱中冷藏12 h。將固酶復(fù)合物于8 000 r·min-1下離心沉降20 min，倒去上清液后以少量PBS清洗沉積在離心管底部的固酶復(fù)合物3次，于同樣轉(zhuǎn)速下離心沉降，移除上清液后保留離心管底部的固酶復(fù)合物，收集上清液和濾液，將兩者合并后，會同溶解Lac的母液一并送去測定銅離子濃度，便可參照文獻[20]報道的石墨爐原子吸收法測定固酶復(fù)合物中固載Lac的量(mg·g-1，單位質(zhì)量載體擔載酶的質(zhì)量)，按前文[21]給出公式計算Lac固定百分率和載體對Lac的擔載量。取5μL固酶納米復(fù)合物滴涂到預(yù)處理過的GCE上，再抽取2μL CTS(質(zhì)量濃度為1.5%)的冰乙酸溶液(冰乙酸質(zhì)量濃度為3.0%)滴涂到玻碳電極表面，扣上燒杯于4℃冰箱內(nèi)干燥6 h便可得到固定Lac基玻碳電極，縮寫為Lac/PAn-CoC2O4/GC，類似地可以制備對比電極PAn-CoC2O4/GC。

采用紫外-可見分光光度法(UV-Vis)測定PAn-CoC2O4納米復(fù)合物固定Lac前后的吸收光譜變化的具體方法如下：按照本節(jié)所述方法分別制備固定/未固定Lac的PAn-CoC2O4納米粒子復(fù)合物，隨后分別移取這些納米粒子復(fù)合物200μL并均勻地涂覆在銦錫氧化物(ITO)玻璃片上，待干燥后插入比色槽中進行測定。所有測定的波長均在190～800 nm范圍內(nèi)，室溫下進行。復(fù)合載體固定漆酶的比活力測定參照前文[21]方法，稱取制備的固酶復(fù)合物5 mg與3mL pH值為4.4的PBS和100μL的10 mmol·L-1DMP混合液共混1 min后，測定室溫下溶液中DMP氧化產(chǎn)物2，6-二甲氧基苯醌在470 nm處的吸光度，記錄吸光度-時間關(guān)系曲線。2,6-二甲氧基苯醌的摩爾吸光系數(shù)為49 600 L·mol-1·cm-1，定義酶活力單位為1 min內(nèi)氧化1μmol DMP所需要漆酶的量(1U)。電極的活性表面積按照文獻[22]給出的方法，以K3[Fe (CN)6]作為探針進行標定，根據(jù)不同掃描速率下獲得電流-電壓曲線中陰陽極峰電流平均值與掃速平方根關(guān)系曲線擬合所得的斜率，便可測得PAn-CoC2O4/ GC的活性表面積為0.10 cm2。所有電化學(xué)測試在常規(guī)三電極電解池中進行。以Lac/PAn-CoC2O4/GC作為工作電極，不含任何電子介體的PBS緩沖液(pH= 4.4)作為電解質(zhì)溶液。電化學(xué)阻抗譜(EIS)測試是在開路電壓～235 mV，頻率范圍0.1～105Hz，交流激勵信號幅值為5 mV的條件下進行；微分脈沖伏安法(DPV)曲線的測定是在電位范圍-0.4～0.6 V，階躍電位5 mV的條件下進行；研究固酶電極直接電化學(xué)行為實驗中，實驗前先向溶液中鼓泡通入N2除氧至少30 min，循環(huán)伏安法(CV)測試過程中電解液上方通入N2使溶液保持惰性氣氛(所有電流-電壓i-E曲線均為穩(wěn)態(tài)下記錄，即以掃描第10圈為準)。在催化氧還原實驗中，實驗前先向PBS緩沖液中不斷鼓泡通入高純O2至少15 min使溶液為O2飽和，實驗中溶液上方維持O2氣氛，所有測定均是在(25.0±0.4)℃下進行。文中給出的電流密度為測定的催化電流對電極的活性表面積歸一化所得。以出現(xiàn)極限擴散電流時的電位處的電流差|iOxygen-iNitrogen|來表征固酶電極催化氧還原活力

1.4固酶納米復(fù)合物修飾電極作為氧電化學(xué)傳感器的性能

采用時間-電流曲線法(t-C)評估Lac/PAn-CoC2O4/GC對氧氣的傳感性能。t-C曲線系固酶電極在含有一系列不同O2濃度的PBS溶液中(pH=4.4)于恒定電壓下記錄響應(yīng)電流-時間關(guān)系曲線而得到，這一系列不同O2濃度的PBS溶液系向N2氣飽和的PBS溶液中加入不同體積的空氣飽和PBS溶液(氧氣濃度大約是260μmol·L-1)而制得，氧還原電位參考文獻[6]，以極限擴散電流對應(yīng)電位作為工作電位。

2　結(jié)果與討論

2.1PAn-CoC2O4納米粒子復(fù)合物的形貌和結(jié)構(gòu)表征

圖1為CoC2O4·2H2O，PAn和PAn-CoC2O4納米復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜圖(FTIR)。從圖1可以看出：PAn-CoC2O4納米復(fù)合物的FTIR中不但含有CoC2O4·2H2O的特征吸收峰，也含有PAn的特征吸收峰，除了Co-O的特征吸收峰由于復(fù)合物中共軛苯環(huán)存在而發(fā)生藍移(分別位于591.5和674.1 cm-1)之外，還可以觀察到一個新的吸收峰，位置在543.1 cm-1附近，這個吸收峰對應(yīng)于-NH-的面外彎曲受到Co-N之間的作用影響，使其發(fā)生了藍移，這間接證明納米CoC2O4與聚苯胺之間發(fā)生了某種程度的化學(xué)作用。

圖1 CoC2O4·2H2O,PAn和PAn-CoC2O4納米復(fù)合物的FTIR譜圖Fig.1 FTIR spectra of CoC2O4·2H2O,PAn and PAn-CoC2O4nano-composite

圖2為PAn-CoC2O4納米復(fù)合物薄膜固酶前后的UV-Vis對比圖。從圖2可以看出：固酶納米復(fù)合物薄膜在560 nm附近出現(xiàn)一個對應(yīng)于納米復(fù)合物誘陷Lac活性位T1氧化態(tài)Cu2+d-d配位躍遷吸收峰，但此吸收峰位置與游離Lac的Cu2+d-d配位躍遷吸收峰(605 nm)[23]相比負向移動了45 nm，表明酶分子中Cu2+的d-d配位躍遷吸收峰在Co2+-N(聚苯胺或Lac分子中組氨酸殘基中的N原子)和/或Cu-N配位作用的影響下，配體場較強引起d軌道分裂能增大，導(dǎo)致吸收峰發(fā)生了負移；此外200和280 nm的2個尖銳吸收峰對應(yīng)于復(fù)合物中PAn芳環(huán)的強吸收帶。這一現(xiàn)象暗示固酶載體中導(dǎo)電聚合物結(jié)構(gòu)單元中雜原子與固定Lac活性中心Cu離子之間的相互作用對游離酶T1活性中心氧化態(tài)Cu離子固有配位構(gòu)型產(chǎn)生了明顯影響。值得說明的是，這種固酶納米復(fù)合物所固定的Lac比活力為1.05 U·mg-1，大約保留了游離Lac比活力(1.52 U·mg-1)的70%，相對于文獻[24]報道的納米多孔金固酶復(fù)合物的比活力(0.83 U·mg-1)具有更高的催化活力。這一結(jié)果表明雖然酶-載體間的相互作用對酶活性中心離子的配位構(gòu)型產(chǎn)生了一定的影響，但并沒有過多地影響酶活性中心的催化反應(yīng)機制，即酶分子內(nèi)電子遷移橋鏈并沒有被破壞。

圖2 PAn-CoC2O4納米復(fù)合物固酶前后的UV-Vis譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of PAn-CoC2O4nano-composite with Laccase(solid line)and without enzyme (dashed line)

圖3為納米CoC2O4和PAn-CoC2O4納米復(fù)合物的原子力顯微鏡(AFM)照片，提供了它們的表面形貌和三維立體圖像細節(jié)。從圖3可以看出，納米CoC2O4具有不規(guī)則的幾何形狀和凹凸不平的表面，這種具有不平整表面的形貌是由于制備的CoC2O4納米棒通過堆積、重疊和擠壓形成的；而PAn-CoC2O4納米復(fù)合物則呈現(xiàn)出較為光滑的表面形貌，并能看到明顯的層次分布，因此可以推測PAn在聚合過程中將具有不規(guī)則外形的CoC2O4納米粒子包覆起來，因此具有均勻且平整的表面形貌。

圖3“敲擊”模式下的納米CoC2O4(a)及PAn-CoC2O4納米復(fù)合物(b)的AFM形貌圖Fig.3 AFM topography images under tapping-mode of nano-CoC2O4(a)and PAn-CoC2O4nano-composite(b)

圖4分別為納米CoC2O4(A)，PAn-CoC2O4納米復(fù)合物(B)和固定Lac的PAn-CoC2O4納米復(fù)合物(C)的透射電子顯微鏡(TEM)照片。從圖4可看出：制備的納米CoC2O4呈現(xiàn)出不規(guī)則的棒狀結(jié)構(gòu)，其中還有部分棒狀納米CoC2O4相互聚集，出現(xiàn)了更大、更寬的柱狀結(jié)構(gòu)，這可歸因為相互接近的納米CoC2O4依靠表面COOH間的氫鍵作用導(dǎo)致的團聚成簇(圖4A)；PAn-CoC2O4納米復(fù)合物的形貌則呈現(xiàn)出整體上不規(guī)則的形態(tài)：部分保持納米纖維形態(tài)，而另一部分納米粒子相互纏繞形成無定形的團簇結(jié)構(gòu)(圖4B)；而固定Lac的PAn-CoC2O4納米復(fù)合物的形貌與前兩者皆有明顯差異：原有的棒狀結(jié)構(gòu)大部分消失了，由于納米復(fù)合物表面被蛋白質(zhì)分子包覆，因此可以觀察到復(fù)合物周圍存在柔性的膜狀物質(zhì)，在靠近納米復(fù)合物表面可以發(fā)現(xiàn)存在顏色較深的刺狀突起(圖 4C)，這暗示部分酶分子以某種特定構(gòu)型被固定于納米復(fù)合物表面，這可歸因于聚苯胺中的芳環(huán)結(jié)構(gòu)與Lac分子活性中心T1附近的疏水分子結(jié)合位之間的π-π堆積效應(yīng)。

此外，測定結(jié)果表明該納米復(fù)合物與傳統(tǒng)的固酶載體比如介孔硅微球[25]以及多孔納米金粒子[24]相比，其對Lac擔載量(20.3 mg·g-1)和固酶百分率(35.0%)居中，這可能是因為PAn-CoC2O4納米復(fù)合物對Lac的吸附具有特定的方向選擇性(可歸因于前述π-π堆積效應(yīng)以及CoC2O4和Lac分子表面氨基酸殘基之間的氫鍵作用的協(xié)同效應(yīng))，與其他固酶納米復(fù)合物顯示表面較為光滑的無規(guī)則團簇的形貌有較大差異[26]，故前者相對于后者只能固定較少量的酶分子，而且穩(wěn)定性也不如后者。當固酶復(fù)合物以離心沉降形式分離上清液和固酶載體時，轉(zhuǎn)速較高時一部分吸附不緊密的表面酶分子就會從固酶載體上脫落(在上清液中加入DMP，觀察到由于泄漏的酶催化DMP氧化導(dǎo)致溶液顏色迅速變紅這一現(xiàn)象)。

圖4　納米CoC2O4(A)，PAn-CoC2O4納米復(fù)合物(B)及固定Lac的PAn-CoC2O4納米復(fù)合物(C)的TEM照片F(xiàn)ig.4 TEM images of nano-CoC2O4(A),PAn-CoC2O4nano-composite(B)and PAn-CoC2O4nano-composite with immobilized Lac molecules(C)

圖5　裸GC電極(a)，PAn-CoC2O4納米復(fù)合物修飾電極(b)以及固定Lac的PAn-CoC2O4納米復(fù)合物修飾電極在5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]+0.1 mol·L-1KCl混合液中以100 mV·s-1掃速掃描所得CV曲線，附圖為上述電極在相同電解質(zhì)溶液中的Nyquist曲線Fig.5 CV curves of bare GC electrode(a),basal electrode modified by PAn-CoC2O4nano-composite(b)and basal support over-coated by PAn-CoC2O4nano-composite with entrapped Lac molecules(c)in mixed solution of 5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]+0.1 mol·L-1KCl recorded at 100 mV·s-1,inset: Nyquist plots at all electrodes described previously in the same electrolyte

2.2固酶納米復(fù)合物修飾電極的直接電化學(xué)及催化氧還原性能

2.2.1固酶納米復(fù)合物修飾電極的直接電化學(xué)

圖5及其附圖分別是裸GC電極(a)，納米復(fù)合物修飾電極(b)以及固定Lac納米復(fù)合物修飾電極在5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]+0.1 mol·L-1KCl混合液中掃描所得CV曲線，以及這3個電極在此電解液中所得EIS譜圖。從圖5及其附圖可看出：納米復(fù)合物修飾電極與裸GC電極的CV曲線相比，氧化還原峰電位差ΔEP有一定程度的降低(從121.5 mV下降到了115.3 mV)，陰陽極峰電流比值ip,a/ip,c接近(分別是0.967和0.989)，這表明納米復(fù)合物增大了電極的活性表面積(活性面積增加了大約30%)并提高了電極上電活性物種反應(yīng)的可逆性；而固定Lac的納米復(fù)合物修飾電極的CV相對于電極固定酶分子之前，不但氧化還原峰電流和電極活性表面積有明顯的下降(下降了大約48.8%)，而且ΔEP明顯增大(140.2 mV)，這不僅表明電極反應(yīng)的可逆性有所下降，而且電極表面活性面積也有顯著的降低，這可歸因于電極上負載的部分不導(dǎo)電的酶分子阻礙了電活性物種在導(dǎo)電基體表面的氧化還原反應(yīng)。值得注意的是電活性物種在固酶復(fù)合物修飾電極界面上仍然可以較為可逆地進行氧化還原反應(yīng)，考慮到納米復(fù)合物表面基本被酶分子所覆蓋(圖4C)，這一結(jié)果暗示納米復(fù)合物表面覆蓋的酶分子至少有部分可以視作電極表面-電活性物種之間的“電子介體”。從EIS譜圖也可以看出，納米復(fù)合物修飾電極的電阻相對于裸GC電極，明顯降低，而固酶納米復(fù)合物的電阻雖然相對于未固酶納米復(fù)合物修飾電極有明顯的增加(原因如前所述)，但值得注意的是其傳荷電阻與裸GC電極相近(與前述分析所得結(jié)論相一致)。這一結(jié)果表明定向覆蓋在納米復(fù)合物表面，充當電子介體的酶分子并沒有顯著降低電極表面的導(dǎo)電性能，這一結(jié)論與文獻[6]報道結(jié)果有明顯不同。

圖6A是處于靜止狀態(tài)的Lac/PAn-CoC2O4/GC在N2飽和的PBS(pH=4.4)中掃描獲得的CV曲線，附圖是處于靜態(tài)的BOD/PAn-CoC2O4/GC分別在N2，空氣，O2飽和的PBS(pH=4.4)中掃描獲得的CV曲線。從圖6A可以看出：與文獻[24,27]報道的固定Lac電極不同，在掃描電位區(qū)間內(nèi)：PAn-CoC2O4納米復(fù)合物修飾電極出現(xiàn)了一對明顯的氧化還原峰(基底電極GC在相同電位掃描區(qū)間內(nèi)沒有任何與背景電流區(qū)分的電化學(xué)信號)，氧化峰和還原峰電位分別位于431和220 mV附近，還原峰電流明顯遠高于氧化峰電流(ip,a/ip,c=0.55)，此結(jié)果與文獻[16]報道的聚苯胺接枝功能化多壁碳管修飾電極類似(氧化還原峰電位差接近300 mV)，但氧化還原峰電位差明顯減小(210 mV)，參照文獻[16-17]所得結(jié)論，這對可逆性較差的氧化還原峰可歸于N,N′-二苯基聯(lián)苯胺陽離子自由基-N,N′-二苯基聯(lián)苯胺電對發(fā)生的氧化還原反應(yīng)(得失電子數(shù)n為2)。如前所述，由于Co-N之間的相互作用對該氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生了較大的影響，因此氧化還原峰整體負移了將近340～410 mV；與之類似，固酶電極Lac/PAn-CoC2O4/GC在相同電位掃描區(qū)間范圍內(nèi)也出現(xiàn)了一對位置相近的氧化還原峰(氧化峰和還原峰分別位于439和269 mV，氧化還原峰電位差縮小了40 mV)，氧化還原反應(yīng)可逆程度略有提高(ip,a/ip,c=0.61)，其中值電位354.0 mV vs NHE，遠離Lac活性中心T1或T3的式電位區(qū)間(文獻[28]報道700～800 mV vs NHE)，而更接近Lac活性中心T2的式電位區(qū)間(文獻[28]報道約為400 mV vs NHE)。值得注意的是，該電極在固酶前后氧化還原峰面積從1.95×10-6A·V減少到1.35×10-6A·V，鑒于固酶納米復(fù)合物修飾電極氧化還原峰的出峰位置和峰面積與未固酶電極存在差異，可以合理推測這個減弱的氧化還原峰是電極表面固載酶活性中心T2與納米復(fù)合物含有的電活性基團單獨或聯(lián)合作用的得失電子過程所致。但如果要確定這個電化學(xué)信號具體是酶活性中心單獨產(chǎn)生還是酶活性中心和納米復(fù)合物中所含電活性基團共同產(chǎn)生，還需要更多證據(jù)來作出判斷。

圖6　(A)處于靜態(tài)的Lac/PAn-CoC2O4/GC和PAn-CoC2O4/GC分別在N2飽和的PBS(pH=4.4)中以5 mV·s-1掃描獲得的CV曲線，附圖是靜止的BOD/PAn-CoC2O4/GC分別在N2，空氣和O2飽和的PBS(pH=4.4)中以50 mV·s-1掃速掃描所得CV曲線；(B)靜止的Lac/PAn-CoC2O4/GC在不含電子介體的無氧PBS(pH=4.4)中以不同掃描速率得到的CV曲線，附圖為對應(yīng)的陰極，陽極峰電流與掃描速率平方根關(guān)系擬合曲線；(C)靜止的Lac/PAn-CoC2O4/GC在N2飽和的PBS (pH=4.4)中以20 mV·s-1掃描，不同脈沖高度下獲得的DPV曲線Fig.6(A)CV curves of Lac/PAn-CoC2O4/GC and PAn-CoC2O4/GC in N2saturated PBS(pH=4.4)recorded at scan rate:5 mVs-1, respectively,electrodes in static mode,inset:CV curves of BOD/PAn-CoC2O4/GC recorded at scan rate:50 mV·s-1in N2,air and O2saturated PBS(pH=4.4);(B)CV curves of Lac/PAn-CoC2O4/GC electrode in deaerated PBS(pH=4.4)in the absence of electron mediator recorded at variable scan rates of 2,5,10,20 and 50 mVs-1when electrode in static status,inset:fitting plots of corresponding cathodic,anodic peak currents versus square root of scan rates; (C)DPVs of static Lac/PAn-CoC2O4/GC recorded at 20 mV·s-1in N2saturated PBS(pH=4.4)with variable pulse height, from curve a to j corresponding to pulse height at 10,20,30,50,100,200,300,400,500,600 mV

證明出現(xiàn)的電化學(xué)信號是屬于電極表面固定Lac活性中心與導(dǎo)電基體間直接電子遷移的證據(jù)包括：固載其他氧化還原酶的納米復(fù)合物修飾電極上能觀察到不同于固定Lac納米復(fù)合物修飾電極CV曲線上的氧化還原信號，這表明此種納米復(fù)合物吸附其他的氧化還原酶后，得到的修飾電極也可以實現(xiàn)酶-電極間的直接電子遷移，但隨著酶-載體間相互作用和電子遷移機制的不同，表現(xiàn)出不同的電極反應(yīng)動力學(xué)機制(限于篇幅，僅以與Lac結(jié)構(gòu)和催化活性相近的BOD為例，參見圖6A附圖)。從圖6A附圖可看出，固定BOD的納米復(fù)合物修飾電極在N2飽和的電解液中掃描所得的CV曲線上，除了出現(xiàn)上述納米復(fù)合物中電活性基團氧化還原反應(yīng)的微弱電信號之外，還分別于690和613 mV vs NHE出現(xiàn)了較弱的氧化和還原峰(ip,a/ip,c=1.55，反應(yīng)可逆性明顯優(yōu)于固定Lac的納米復(fù)合物修飾電極)，其中值電位為651.5 mV vs NHE，更接近BOD活性中心T3或T1的式電位[28]。根據(jù)納米復(fù)合物修飾電極固定Lac前后的CV曲線上氧化還原峰面積變化(圖6A)，固酶前后電極活性表面積的變化以及電位掃描速率等參數(shù)，依據(jù)文獻[24]方法可估算出粗略估算出導(dǎo)電酶分子的表面濃度下限為4.2×10-8mol·cm-2。此數(shù)值明顯高于文獻報道[24,27]的納米多孔金和樹枝型聚合物/導(dǎo)電聚合物修飾電極表面的導(dǎo)電酶分子濃度(分別為2.1×10-11mol·cm-2和3.8×10-10mol·cm-2)。而根據(jù)電極表面固定漆酶的量(由石墨爐原子吸收法測定得到載體對酶的擔載量、漆酶平均分子量、固酶載體活性表面積以及電極表面修飾的固酶復(fù)合物質(zhì)量可以求算)4.0×10-9mol，可以估算出導(dǎo)電酶分子占載體總固載酶分子的70%，這表明依靠部分酶分子在固酶載體表面的特定取向吸附，可以大大提高載體表面固定酶分子實現(xiàn)直接電子遷移的幾率，這一結(jié)論與前文[29]報道的聚芳酰胺包覆多壁碳納米管固定Lac修飾電極測試結(jié)果相一致。此外值得指出的是，無論是使用CTS作為載體固載Lac還是單獨使用CTS作為電極表面修飾劑，都無法實現(xiàn)酶-電極間的直接電子遷移，即該固酶電極在不含底物的溶液中既不能觀察到任何與背景電流區(qū)分的電化學(xué)信號，也觀察不到有效催化氧還原的信號，因此CTS僅僅作為成膜劑使用，對酶-電極間的有效電子遷移和電催化反應(yīng)沒有有效貢獻。

圖6B和附圖更進一步給出了該納米復(fù)合物固定Lac電極在相同電解液中以不同電位掃描速率獲得的CV曲線以及對應(yīng)陰陽極峰電流與掃描速率關(guān)系擬合曲線，從圖6B及其附圖可以看出：陰陽極峰電流均隨著電位掃描速率的升高而增加，而且在測試速率范圍內(nèi)均與掃速平方根保持良好的線性關(guān)系，陰陽極峰電流之比值ip,a/ip,c隨著掃速的提高從0.22升高至0.60，而陰陽極峰電位分別負向和正向移動，陰極峰電位負移程度明顯高于陽極峰電位(這暗示隨著掃速上升，陽極電化學(xué)氧化速率明顯升高，即高掃速時酶促N,N′-二苯基聯(lián)苯胺氧化反應(yīng)受到抑制)。上述結(jié)果表明該電極表面固載的Lac活性中心T2與導(dǎo)電基體間發(fā)生的直接電子遷移過程為薄層控制型準可逆氧化還原反應(yīng)，可以理解為納米復(fù)合物中電活性基團通過所謂“擺動”的模式實現(xiàn)固定的酶活性中心-納米復(fù)合物中電活性基團間的電子傳遞，這與文獻[30]報道的固定BOD的氧化還原水凝膠修飾電極的電子遷移機制類似。從圖6B附圖給出的陰陽極峰電流-掃速平方根關(guān)系曲線擬合所得的斜率，結(jié)合前述電極反應(yīng)得失電子數(shù)n，電極表面電活性物種濃度以及電極活性表面積等參數(shù)，按照文獻[31]給出方法可以估算出電極表面薄層中得失電子過程的電對“擺動”引起的表觀擴散系數(shù)D，為1.02×10-7cm2·s-1。利用文獻[23]提及的Nicholson公式，根據(jù)求算的表觀擴散系數(shù)D，峰電位差的依賴參數(shù)Ψ，電位掃描速率v，實驗溫度T以及電極反應(yīng)得失電子數(shù)n等參數(shù)，則可以估算出該固酶納米復(fù)合物修飾電極上異相電子遷移速率khet為5.6×10-5cm·s-1，再利用文獻[32]給出的電極表面反應(yīng)層的定義和反應(yīng)層厚度計算公式Δ=DKM/（kcatC)，結(jié)合電活性物種表觀擴散系數(shù)D，電極表面酶分子濃度C，酶催化電活性物種反應(yīng)速率[32]kcat以及酶對電活性物種的米氏常數(shù)[16-17]KM就可以估算出反應(yīng)層厚度為0.04 cm，以估算的khet對求算的反應(yīng)層厚度進行歸一化處理后所得電極表面異相電子遷移標準速率常數(shù)為0.017 s-1。

圖6C為納米復(fù)合物固定Lac電極在無氧的PBS(pH=4.4)中以不同的脈沖高度，相同的電位掃描速率獲得的DPV曲線，從圖6C可以看出當脈沖高度較小時，曲線上的氧化峰電位與圖6A的CV曲線上的氧化峰電位接近，而當脈沖高度較大時，DPV曲線上的氧化峰電位逐漸負移到接近氧化還原電對N,N′-二苯基聯(lián)苯胺陽離子自由基-N,N′-二苯基聯(lián)苯胺的中值電位的位置，這暗示后者得失電子的電化學(xué)活性要高于實現(xiàn)直接電子遷移的酶活性中心。值得注意的是，和文獻[33]報道的結(jié)果不同，此固酶納米復(fù)合物電極在掃描電位區(qū)間范圍內(nèi)只出現(xiàn)了一個單獨的氧化峰，并沒有觀察到兩個式電位接近的電活性物種發(fā)生電子轉(zhuǎn)移時產(chǎn)生的信號重疊現(xiàn)象，結(jié)合前述的出峰電位數(shù)值，可以合理推測當脈沖高度較小時固酶活性中心的T2銅離子作為首要電子給體，釋放出電子給導(dǎo)電基體，而當脈沖高度較大時，酶活性中心僅作為電子介體，觀察到的電化學(xué)信號可歸因于納米復(fù)合物中電活性基團釋放電子的氧化反應(yīng)。

2.2.2固酶納米復(fù)合物修飾電極的催化氧還原(ORR)性能

圖7是處于靜態(tài)的Lac/PAn-CoC2O4/GC分別在氧氣飽和和無氧的不含任何介體的PBS(pH=4.4)中掃描獲得的CV曲線。從圖7可以看出，固酶電極在氧氣飽和以及無氧PBS中的CV曲線存在明顯差異：盡管兩者正向掃描所得的氧化峰峰電位和峰面積基本保持不變，但是固酶電極在氧氣飽和溶液中負向掃描時，于460 mV處還原電流急劇增加，直到～220 mV時達到第一個極限電流(這可以歸因為電極表面固載Lac化學(xué)氧化N,N′-二苯基聯(lián)苯胺產(chǎn)物將電子傳遞給電極表面固定Lac吸附的氧分子，使之電化學(xué)還原的過程)，隨著電位繼續(xù)負移，電流進一步迅速增加直到～-260 mV處達到第二個極限電流(這可以歸因于固酶納米復(fù)合物化學(xué)吸附的氧分子在超電勢較大時電化學(xué)還原的過程，一個旁證是將固酶復(fù)合物修飾電極放入空氣飽和的電解液中過夜后，結(jié)果顯示溶液中氧氣濃度降低到初始值的大約78%)，這充分表明電極表面固定的酶有效催化了氧還原，這一現(xiàn)象與圖6A附圖中給出的固定BOD納米復(fù)合物在相同電解液中測試結(jié)果相一致，不再贅述。值得注意的是未固酶電極PAn-CoC2O4/ GC沒有明顯的催化氧還原效能，即該電極在無氧和氧氣飽和的溶液中掃描所得的CV沒有明顯區(qū)別。相對于氧在此條件下還原的平衡電位970 mV vs NHE，固酶電極催化氧還原的超電勢雖然高達510 mV，但仍然比類似電子遷移機制的固定Lac電極[27,34](前者在相同電位掃描區(qū)間范圍內(nèi)沒有明顯的催化氧還原效能，后者氧還原起始電位為400 mV vs NHE)的氧還原超電勢小得多，與文獻報道固酶電極[24]實現(xiàn)直接電子遷移時的氧還原起始電位(530 mV vs NHE)接近。與文獻[6]報道的固酶電極不同的是氧化峰電流沒有明顯下降，這暗示雖然電極表面處于氧化態(tài)的Lac活性中心T2接受了氧氣給予的電子被消耗，但同時又將電子傳遞給了氧化態(tài)的N, N′-二苯基聯(lián)苯胺陽離子自由基，從而使氧化峰電流相對保持恒定。以獲得的穩(wěn)態(tài)催化還原電流(以200 mV時為準)對電極活性面積歸一化就可以得到穩(wěn)態(tài)催化還原電流密度j為4.2μA·cm-2，結(jié)合前述估算的導(dǎo)電固酶分子的表面濃度Γ，由公式：j=nkcΓF(kc為表觀電催化氧還原反應(yīng)速率常數(shù)，n為氧還原反應(yīng)得失電子數(shù)，一般認為電極表面固定的Lac無論是通過電子介體介導(dǎo)，還是通過直接電子遷移的方式，氧還原都是按照四電子機制進行，氧直接被還原為水而不會形成中間體過氧化氫。文獻[30]也指出以極限擴散電流對旋轉(zhuǎn)圓盤電極旋轉(zhuǎn)角速率平方根作圖，根據(jù)擬合曲線所得斜率就可估算出氧還原反應(yīng)得失電子數(shù)為4)便可以估算出此電極上固定Lac催化氧還原為水分子的表觀速率常數(shù)上限為2.6×10-4s-1，這一數(shù)值明顯低于文獻[35]報道的數(shù)值(0.07 s-1)，與吸附Lac的碳納米管修飾電極[36]接近(根據(jù)數(shù)據(jù)估算為2.2×10-4s-1)，這一數(shù)值接近于Lac活性位T3上形成的配合物分解為水分子的反應(yīng)速率[28](0.034 s-1)，即電催化氧還原的過程實際上受制于酶分子活性位上吸附氧形成的配合物分解的過程。這暗示固酶納米復(fù)合物與固定Lac分子之間的復(fù)雜相互作用對固定Lac的催化效率存在較大影響，這與PAn-CoC2O4特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)和表面形貌有密切關(guān)聯(lián)。

圖7　Lac/PAn-CoC2O4/GC分別在不含介體的為O2和N2飽和的靜止PBS(pH=4.4)中以2 mV·s-1的掃速掃描所得CV曲線Fig.7 CV curves of static Lac/PAn-CoC2O4/GC electrode recorded at rate:2 mV·s-1in N2bubbled and oxygen-saturated PBS(pH=4.4)in the absence of external mediator,respectively

2.2.3固酶電極催化性能的重現(xiàn)性、長期使用性、熱穩(wěn)定性及pH值耐受性

圖8A為同一批次制備的固酶電極置于氧氣飽和的PBS(pH=4.4)中掃描所得CV曲線上極限催化電流密度的對比圖，從圖8A可以看到5個按同一工序制備的Lac/PAn-CoC2O4/GC電極極限催化電流密度顯著性差異較小，這表明該固酶電極催化氧還原性能具有良好的重現(xiàn)性；圖8B為Lac/PAn-CoC2O4/GC于氧氣飽和的PBS中掃描所得極限催化電流密度與電極低溫儲存時間的關(guān)系曲線。從圖8B可看出：新制備的Lac/PAn-CoC2O4/GC電極在氧氣飽和的PBS中立即進行測試和此電極在4℃冰箱中儲存7 d后測試得到的極限催化電流差異很小(極限催化電流密度的降低幅度僅為10%)，而且氧還原起始電位沒有明顯改變(通過對比兩者的CV可以看出，圖不再給出)，隨著儲存時間延長固酶電極催化氧還原性能隨之緩慢下降，當?shù)蜏貎Υ鏁r間超過10 d后電極催化氧還原性能下降迅速，電極儲存21 d后催化性能仍然可以保留初始值的大約47.2%，這一結(jié)果要優(yōu)于文獻[37]報道結(jié)果(同樣溫度下儲存21 d后性能下降到不足初始值的15%)。圖8C為固酶電極在氧氣飽和的不同pH值PBS溶液中以相同掃速(2 mV·s-1)，常溫下測定的穩(wěn)態(tài)催化電流密度-pH關(guān)系曲線，以及最佳pH值條件，相同掃速(2 mV·s-1)下測定的極限催化電流密度-溫度關(guān)系曲線。從圖8C可以看出：納米復(fù)合物固定Lac修飾電極催化氧還原性能與游離Lac類似，存在一個最佳pH值，但與游離Lac不同，最佳pH值出現(xiàn)在4.4，這表明載體表面固定的Lac由于催化活性中心所處的微環(huán)境發(fā)生了明顯的改變，進而使得催化活力-pH關(guān)系也與游離Lac存在明顯差異，據(jù)此pH= 4.4被設(shè)定為測試固酶電極催化氧還原性能的工作pH值；此外還可以觀察到在測試溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，在328 K之前極限催化電流密度隨溫度線性升高，而當溫度超過328 K之后極限催化電流密度迅速下降，這個結(jié)果與文獻[30]報道固酶電極的催化電流密度-溫度關(guān)系非常相似，這表明此電極表面的固酶載體很可能以化學(xué)吸附的形式固定Lac，而當溫度升高后酶變性從而造成電池輸出性能下降(溫度升高后并沒有檢測到酶分子從電極表面的固酶載體上脫落)。根據(jù)圖中數(shù)據(jù)可以估算出電池催化反應(yīng)的表觀活化能大約是43.5 kJmol-1，而酶變性的活化能則大約是66.3 kJ·mol-1。

圖8　Lac/PAn-CoC2O4/GC催化氧還原性能的重現(xiàn)性(A)，長期使用性(B)以及溫度/pH-催化性能間的依賴關(guān)系(C)Fig.8 Reproducibility of catalysis for ORR(A),long-term stability of catalysis for ORR(B)and dependence of its catalytic effect on temperature or pH(C)for Lac/PAn-CoC2O4/GC

圖9　計時電流法表征Lac/PAn-CoC2O4/GC對氧傳感的性能，插圖為對應(yīng)的極限催化電流密度-氧氣濃度雙倒數(shù)關(guān)系曲線Fig.9 Performance for oxygen detection of Lac/ PAn-CoC2O4/GC characterized by chronoamperometry in stirring PBS(pH=4.4), electrode in stationary status and applied potential at 160 mV,inset is corresponding double reciprocal plot of limited catalytic current density vs concentration of substrate-dioxygen

2.3固酶電極作為氧電化學(xué)傳感器的性能評估

漆酶除了能化學(xué)催化氧化特定結(jié)構(gòu)的酚類化合物和一些雜環(huán)化合物之外，還能夠同時按照四電子機制電還原化學(xué)吸附的氧分子為水。一般認為只有當酶-電極間可以實現(xiàn)有效的電子遷移(無論是通過使用電子介體還是以直接電子遷移的方式)時，才能夠通過檢測響應(yīng)電流的方式以確定酶催化反應(yīng)底物的氧分子的濃度[6,29]。圖9為Lac/CoC2O4/GC電極在不含電子介體的無氧PBS(pH=4.4)中，分批加入不同體積空氣飽和的PBS(pH=4.4)時產(chǎn)生的響應(yīng)電流密度與時間關(guān)系曲線，插圖則是固酶電極的穩(wěn)態(tài)催化電流密度倒數(shù)與底物氧分子濃度倒數(shù)間的關(guān)系校正曲線。從圖9及插圖可以看出：固酶電極可以有效催化氧分子還原，對其響應(yīng)迅速。此電極在氧氣濃度0.43～7.5μmol·L-1的范圍內(nèi)，穩(wěn)態(tài)催化電流與氧氣濃度均能保持良好的線性關(guān)系。這一固酶電極對氧的靈敏度為0.006μA·L·μmol-1，這一數(shù)值雖遠低于文獻[6]報道的殼聚糖-多壁碳納米管固定Lac電極對氧分子的靈敏度(27.3μA·L·μmol-1)，但其對氧的檢測限(檢測限的定義是背景電流平均值加上3倍背景信號標準偏差所得的電流和，在響應(yīng)電流-底物濃度工作曲線上對應(yīng)的濃度值)可以低至0.20μmol·L-1，這一數(shù)值僅為文獻[6]報道的固酶電極(7.8μmol·L-1)的1/39。從雙倒數(shù)L-B曲線擬合所得的固酶電極對氧分子的KM數(shù)值(122.4μmol·L-1)來看，本文制備的固定Lac的PAn-CoC2O4納米復(fù)合物修飾電極對氧氣的親和力很高，不但遠遠高于文獻[6]報道的固酶電極對氧的親和力(KM=3.22 mmol·L-1)，而且亦高于文獻[38]報道的固酶電極對氧分子的親和力(191.0μmol·L-1)。此外由溶液中氧氣濃度-固酶電極浸泡時間關(guān)系曲線(圖略)的斜率求算出氧分子平均消耗速率V(0.024 5μmol·L-1·s-1)，以及電極表面納米復(fù)合物修飾層中固酶物質(zhì)的量nE(2.8×10-9mol)，根據(jù)文獻[24]給出公式V=kEnE(kE為酶化學(xué)吸附氧分子表觀速率常數(shù))可以估算kE為0.26 s-1。

將所有獲得的酶催化反應(yīng)相關(guān)過程的動力學(xué)參數(shù)在同一量綱下進行對比發(fā)現(xiàn)，固定Lac電化學(xué)還原氧分子的速率遠低于酶化學(xué)吸附氧的速率，也低于酶-導(dǎo)電基體之間直接電子遷移速率，這表明降低吸附的氧分子轉(zhuǎn)化的活化能才是改善這型固酶電極性能的關(guān)鍵，在保留該納米復(fù)合物對氧較高親和力的前提下，合理調(diào)控納米復(fù)合物官能團對氧的結(jié)合能力，將可以提升該固酶電極的催化效率。

3　結(jié)論

利用PAn-CoC2O4納米復(fù)合物作為固定Lac的載體，依靠化學(xué)吸附，物理吸附以及配位作用的協(xié)同效應(yīng)穩(wěn)定的固載了Lac，進一步制備了固酶基電極。采用光譜學(xué)技術(shù)手段表征了固酶納米復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和形貌，以電化學(xué)方法測試了此電極的導(dǎo)電性能，研究了電極表面固酶的直接電子遷移性能及催化氧還原性能，在此基礎(chǔ)上評估了其作為氧電化學(xué)傳感器的性能。實驗結(jié)果表明：固酶納米復(fù)合物修飾電極在測試電位區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)一個式電位接近酶活性中心T2的準可逆電化學(xué)信號，具有較快的電子遷移速率，該固酶電極具有較高的氧還原起始電位(460 mV vs NHE)和較快的化學(xué)吸附氧分子速率，但酶電催化氧分子還原反應(yīng)受限于吸附氧分子轉(zhuǎn)化為水的過程。這種納米復(fù)合物固酶電極還顯示出較為良好的催化性能重現(xiàn)性，長期使用性，熱穩(wěn)定性以及pH耐受性。該電極作為電流型氧電化學(xué)傳感器的測試結(jié)果表明其具有極低的檢測限以及對底物較高的親和力等優(yōu)勢。

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Direct Electrochemistry of Electrode Modified with Thin Film of Laccase Immobilized in Nano-Composite of Polyaniline-CoC2O4

YANG Yang HUO Wen-Shan ZHOU Zheng ZHANG Qi ZENG Han＊
(Laboratory of New Energy Materials Chemistry,Chemistry and Chemical Engineering Academy,XinJiang Normal University, Urumuqi 830054,China)

Electrochemical methods including cyclic voltammetry,differential pulse voltammetry,electrochemical impedance spectrometry and chronoamperometry,together with auxiliary means such as F-T infrared spectrometry, Ultra-violetvisible spectrometry,atomic force microscopy,transmission electron microscopy and atomic adsorption spectrometry were used to characterize the chemical composition,structure and morphology of polyaniline-CoC2O4nano-composite,to measure the change of conductivity in nano-composite before and after Laccase immobilization and to investigate the direct electrochemistry of redox protein molecules entrapped in the matrix.Its catalytic effect on oxygen reduction reaction and performance as electrochemical sensor for oxygen detection were evaluated subsequently.Results from tests indicated this Laccase-based electrode shuttled electrons from enzyme active site T2as primary electron acceptor to dioxygen molecules attached chemically in the matrix,achieving the electro-reduction of O2in the absence of any external mediator with its apparent electron transferring rate:0.017 s-1.This laccase-based electrode displayed favorable catalytic effecton oxygen reduction reaction(onsetpotential for catalysis:460 mV vs NHE,apparent turn-over frequency for oxygen reduction reaction:2.6×10-4s-1).Enzymatic oxygen electro-reduction into water should be ascribed to the key process to promote the performance of biocathode.This Laccase based electrochemical sensor had such advantages as extremely low detection limit (0.20μmol·L-1)to oxygen monitoring,wide linear responding range of concentration(0.4～7.5μmol·L-1)and high affinity towards substrate(KM=122.4μmol·L-1).

Polyaniline-CoC2O4nano-composite;Laccase;Direct electrochemistry;Catalytic oxygen reduction reaction;Electrochemical sensor

O643.3

A

1001-4861(2016)12-2117-12

10.11862/CJIC.2016.277

2016-06-13。收修改稿日期：2016-10-14。

國家自然科學(xué)基金(No.21363024,31560249)、新疆師范大學(xué)博士科研啟動基金(No.XJNUBS1228)、新疆維吾爾自治區(qū)2013年度高?？蒲杏媱澢嗄杲處熍嘤椖?No.XJEDU2013S29)、新疆師范大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目基金(No.XSY201502009)和新疆師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(No.201510762074)資助。

＊通信聯(lián)系人。E-mail：zenghan1289@163.com;Tel:+86-991-4332279