曾曉珊，彭 丹，石媛媛，謝 偉，劉愛民

(袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司，湖南長沙 410006)

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利用SSR標(biāo)記構(gòu)建水稻核心親本指紋圖譜

曾曉珊，彭 丹，石媛媛，謝 偉，劉愛民*

(袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司，湖南長沙 410006)

利用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1433-2014)中公布的48對(duì)SSR引物構(gòu)建27個(gè)水稻核心親本指紋圖譜，并獲得所有親本的SSR分子身份證號(hào)。48對(duì)SSR引物在27個(gè)親本中共擴(kuò)增到162個(gè)多態(tài)性片段，平均每對(duì)引物可檢測(cè)到3.53個(gè)等位基因。能擴(kuò)增到2個(gè)以上等位基因的SSR引物共45對(duì)，PIC值變化范圍0.07～0.80，平均0.46。聚類分析結(jié)果表明，27個(gè)親本的遺傳相似性系數(shù)在0.593～0.944之間，基本上反映了不同材料間的親緣關(guān)系。核心親本SSR分子身份證的確定，不僅為品種鑒定提供了一個(gè)平臺(tái)和標(biāo)尺，便于建立品種的遺傳指紋檔案，還為保護(hù)品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，鑒定品種真?zhèn)渭凹兌忍峁┝丝煽恳罁?jù)。

水稻；核心親本；SSR標(biāo)記；指紋圖譜；分子身份證

水稻是我國的主要糧食作物之一。近年來，參加區(qū)試的水稻新品種每年呈遞增趨勢(shì)。傳統(tǒng)的水稻新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性(DUS)測(cè)試因鑒定周期長、鑒定結(jié)果易受環(huán)境影響等原因，已不能滿足現(xiàn)代新品種快速選育及推廣的要求?；谥貜?fù)基元重復(fù)次數(shù)變化的等位位點(diǎn)多態(tài)性，賦予了SSR標(biāo)記能較好反應(yīng)品種間遺傳多樣性的特點(diǎn)，使其能用于品種鑒定的研究。莊杰云等[1]利用24個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建了103個(gè)水稻主栽品種的分子指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，并對(duì)數(shù)據(jù)庫中各個(gè)標(biāo)記、各組材料表現(xiàn)進(jìn)行分析，剔除了1個(gè)假雜交稻。McCouch等[2]利用6個(gè)SSR標(biāo)記鑒別了71個(gè)相似水稻品種。目前國際新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)已將SSR標(biāo)記用于新品種的DUS測(cè)試中。我國農(nóng)業(yè)部亦出臺(tái)了相應(yīng)方法標(biāo)準(zhǔn)[3]用于水稻品種鑒定。但隨著育種進(jìn)程的發(fā)展，少量親本的延續(xù)使用，新品種間的遺傳差異越來越小，品種間相似性逐漸增加。為滿足新品種鑒定和市場(chǎng)監(jiān)管的需要，農(nóng)業(yè)部新制定了《NY/T 1433-2014 水稻品種真實(shí)性鑒定方法》[4]作為水稻新品種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。該方法在SSR標(biāo)記數(shù)目、檢測(cè)方法等方面進(jìn)行了修改、補(bǔ)充。

利用SSR標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜，不僅可應(yīng)用于品種保護(hù)，還可用于品種真實(shí)性及純度鑒定。彭鎖堂等[5]利用SSR標(biāo)記RM17檢測(cè)雜交水稻‘汕優(yōu)63’和‘兩優(yōu)培九’種子，純度分別為96.0%和98.0%，與田間測(cè)定結(jié)果96.2%和97.7%接近。同時(shí)，通過計(jì)算親本間遺傳距離，利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，可明確各品種間的遺傳差異，對(duì)科學(xué)配制雜交組合、預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)、提高抗病蟲高產(chǎn)的育種效率等具有指導(dǎo)作用。陳躍進(jìn)等[6]利用55個(gè)SSR標(biāo)記研究23個(gè)品種的親緣關(guān)系，采用UPGMA構(gòu)建系統(tǒng)樹和計(jì)算遺傳距離，結(jié)果表明，23個(gè)品種分為秈型、粳型、偏秈型、偏粳型等4類。其中，偏秈型品種之間和偏粳型品種之間的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，選用他們作為親本，可提高雜種優(yōu)勢(shì)。因此，建立一套水稻品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，對(duì)于假種鑒別、保護(hù)育種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)與育種者的權(quán)益意義重大。

本研究利用NY/T 1433-2014所推薦的48對(duì)SSR標(biāo)記物，構(gòu)建27個(gè)水稻核心親本的分子指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上對(duì)品種間的遺傳相似性進(jìn)行分析，從分子水平上為水稻育種、品種鑒定以及種子生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用27個(gè)水稻核心親本包括：H032、R1128、R19、R2010、R608、華占、R299、R012、R1341、R571、R130、黃華占、R248、R9595、R199、R2469、R1102、R527、R0293、R812、R116、R1813、R618、R534、黃莉占、R4024、H472，均由湖南隆平種業(yè)有限公司提供。親本分別在三亞、長沙種植，經(jīng)嚴(yán)格去雜后收獲。為保證供試材料的真實(shí)性和純度，種子純度嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB4404.1[7]的規(guī)定檢測(cè)，種子分樣和保存按照GB/T3543.2[8]的規(guī)定進(jìn)行。

1.2 DNA提取

水稻種子不少于30粒，催芽3～4 d后，取胚芽，按CTAB法[9]混合提取DNA，并溶解于200 μL 0.1×TE中，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。

1.3 DNA定量及PCR擴(kuò)增

利用NaroDrop 2000 DNA微量檢測(cè)儀將DNA濃度調(diào)整至50 ng/μL，用于PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板DNA2.0 μL，25 mmol/L buffer 2.0 μL，10 pmol/μL引物2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP1.6 μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.2 μL，雙蒸水12.2 μL。反應(yīng)在ABI 9700 PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min；最后10℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及檢測(cè)

在每管PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4 μL上樣緩沖液，充分混勻，于3000 rpm瞬時(shí)離心。用10 μL八道排槍取2.0 μL PCR產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳(200 V，60 min)。電泳結(jié)束后，取出凝膠，于0.1% AgNO3溶液并輕搖銀染8～10 min。之后用蒸餾水漂洗1次(20 s)；再將凝膠置于顯影液(15.0 g/L NaOH，0.4%甲醛溶液)中，待凝膠適度著色后，取出凝膠，在凝膠成像系統(tǒng)的白光燈下拍照并記載位點(diǎn)。

1.5 SSR引物

本研究所用SSR引物，為國家行標(biāo)NY/T 1433-2014所推薦，用于水稻品種真實(shí)性鑒定的4組、共48對(duì)引物(表1)。

1.6 指紋圖譜構(gòu)建

按1.4的方法，得到48對(duì)SSR引物對(duì)27個(gè)水稻親本的電泳圖譜。SSR引物按其先分組(共4組)，后按染色體號(hào)由小到大順序排列(表1)，組成構(gòu)建指紋圖譜的SSR引物組合。27個(gè)水稻親本按表1中順序排列，每個(gè)水稻親本在48對(duì)SSR引物上的圖譜組合，便構(gòu)成這些品種的特異SSR指紋圖譜。

1.7 親本SSR指紋圖譜身份證號(hào)

對(duì)任意一對(duì)SSR引物得到的指紋圖譜條帶，根據(jù)其分子量大小對(duì)所有復(fù)等位位點(diǎn)從大到小依次進(jìn)行阿拉伯?dāng)?shù)字編號(hào)。按1.6方法中親本、引物的排列左右順序，獲得27個(gè)水稻親本在48對(duì)引物中的等位位點(diǎn)對(duì)應(yīng)具體數(shù)值。每個(gè)親本在48對(duì)引物上的等位位點(diǎn)數(shù)值組合便組成其SSR指紋圖譜身份證號(hào)。對(duì)于含兩個(gè)帶型的以分?jǐn)?shù)形式表示，但只占一個(gè)數(shù)位。指紋圖譜身份證號(hào)48位制固定不變，每個(gè)數(shù)位代表的SSR引物位置固定不變。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

SSR擴(kuò)增產(chǎn)物以“0”、“1”統(tǒng)計(jì)帶型，親本對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物在電泳圖中有條帶出現(xiàn)賦值為“1”，無條帶出現(xiàn)賦值為“0”；缺失賦值為“9”，以此方法建成Excel數(shù)據(jù)表。每2份親本間的遺傳差異按Nei等[10]的方法求算遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD)：

GS=2Mxy/(Mx+My)

GD=1-GS

式中：Mx和My分別為x和y兩親本的總片段數(shù)，Mxy為兩材料的公共片段數(shù)。

根據(jù)所得遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)平均數(shù)UPGMA方法(unweighted pair group method using arithmetic averages)進(jìn)行遺傳相似性聚類。以上運(yùn)算通過NTSYS-pc Version 2.10軟件[11]進(jìn)行(軟件中參數(shù)為DICE)。

根據(jù)Smith等[12]報(bào)道的方法計(jì)算每1對(duì)SSR引物的多態(tài)性信息含量指數(shù)(polymorphic information content，簡稱PIC值)：

式中：fi表示第i種等位基因(alleles)的頻率。

以上運(yùn)算通過生物學(xué)軟件POPGENE 1.31進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性及品種鑒別

48對(duì)引物在27個(gè)親本中共擴(kuò)增到162個(gè)多態(tài)性片段，第I、II、III、IV組標(biāo)記各獲得49、41、37、35個(gè)多態(tài)片段。除RM85、RM423及RM567在27個(gè)親本中僅檢測(cè)到1個(gè)片段外，其他標(biāo)記均可擴(kuò)增到2個(gè)及2個(gè)以上等位基因，平均每對(duì)引物可檢測(cè)到3.53個(gè)等位基因(表1)。45個(gè)SSR位點(diǎn)的PIC值變化范圍0.07～0.80，平均為0.46。等位基因數(shù)超過平均值的標(biāo)記有17個(gè)；PIC值超過平均值的標(biāo)記有25個(gè)。在兩類大于平均值的指數(shù)中，共同出現(xiàn)的引物有15對(duì)，分別為RM583、RM71、RM336、RM311、RM209、RM208、RM232、RM258、RM224、RM493、RM21、RM424、RM289、RM332和RM7102。這些引物的等位基因數(shù)越多，PIC值越高，區(qū)分品種能力也越強(qiáng)。圖1為引物RM7102對(duì)27個(gè)親本材料的擴(kuò)增結(jié)果。

在162個(gè)等位基因中，有28個(gè)只存在1個(gè)品種，其中涉及到19對(duì)引物及14個(gè)水稻親本(表2)。這些特異等位位點(diǎn)的特征譜帶將有助于識(shí)別和鑒定相應(yīng)水稻品種。

表1 27份雜交水稻核心親本SSR指紋標(biāo)記等位基因數(shù)及多態(tài)性信息指數(shù)(PIC值)Table 1 The allele number and PIC of 27 hybrid rice core parental lines based on SSR fingerinting markers

表2 雜交水稻核心親本特征性標(biāo)記Table 2 Characteristic markers of hybrid rice core parent lines

2.2 SSR指紋圖譜構(gòu)建

利用48對(duì)引物，依次對(duì)27個(gè)水稻親本材料基因組DNA(按順序排列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)顯影、拍照，得到一套SSR引物的圖譜(圖1)。根據(jù)所構(gòu)建的指紋圖譜，可對(duì)某一品種的真實(shí)性進(jìn)行鑒定。

圖1 RM7102對(duì)27個(gè)雜交水稻核心親本的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification profile of 27 hybrid rice core parental lines at RM7102

2.3 SSR指紋身份證系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

利用得到的Excel數(shù)據(jù)，構(gòu)建SSR指紋身份證數(shù)據(jù)庫。27個(gè)水稻親本材料的SSR指紋身份證號(hào)見表3。由表3可見，6對(duì)引物檢測(cè)到了雜合位點(diǎn)，分別為RM209、OSR28、RM590、RM571、RM316和RM7102。

表3 27個(gè)雜交水稻核心親本的SSR指紋身份證號(hào)Table 3 The SSR Molecular identity cards of 27 hybrid rice core parent lines

(續(xù)表3)

以SSR標(biāo)記遺傳相似系數(shù)為原始數(shù)據(jù)，用UPGMA法對(duì)所有供試親本材料進(jìn)行聚類分析，并繪制成樹狀圖(圖2)。根據(jù)樹狀圖，可直觀地了解親本間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。以相似系數(shù)0.667為閾值，R4024為單獨(dú)類群，與其他26個(gè)親本差異最大；以相似系數(shù)0.704為閾值，可將26個(gè)親本分為兩個(gè)亞群：第一亞群包含H032和R1128，第二亞群包含其余24個(gè)親本。第二亞群在相似系數(shù)0.710閾值處又可分為2個(gè)亞群，A亞群的親本攜帶蜀恢527、明恢63等血緣；B亞群親本的遺傳相似性反映了不同地理緯度的關(guān)系。

圖2 27個(gè)水稻核心親本UPGMA聚類分析圖Fig.2 UPGMA clustering for 27 rice core parent lines

3 討論

隨著近年來水稻新品種的逐漸增多，多數(shù)品種遺傳基礎(chǔ)不斷變窄，對(duì)于品種一致性、穩(wěn)定性鑒定方法，需要不斷完善。我國制定的《NY/T 1433-2014 水稻品種真實(shí)性鑒定方法》，不僅增加了檢測(cè)標(biāo)記的數(shù)量，還對(duì)檢測(cè)方法、檢測(cè)流程作了詳細(xì)的規(guī)范，為新《種子法》在種質(zhì)特異性、一致性、穩(wěn)定性及品種審定、種子安全生產(chǎn)經(jīng)營等方面提供了依據(jù)。

為確保研究結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)的一致性，本研究以國標(biāo)規(guī)定的水稻品種真實(shí)性鑒定方法中要求的48對(duì)引物，對(duì)27個(gè)親本進(jìn)行了DNA指紋分析。首先，在特異性中發(fā)現(xiàn)，RM85、RM423及RM567在27個(gè)親本中間無多態(tài)；RM17、RM219等標(biāo)記的等位位點(diǎn)數(shù)及PIC值遠(yuǎn)低于平均值。這說明，27個(gè)親本品種間有較高的平均遺傳相似系數(shù)，但親緣關(guān)系很近。這與前人認(rèn)為我國當(dāng)前水稻品種遺傳基礎(chǔ)較狹窄的結(jié)果一致[14，15]。其次，本研究中所用SSR標(biāo)記具有代表性。一方面，聚類分群的結(jié)果與傳統(tǒng)系譜對(duì)水稻的劃分情況基本一致；另一方面，本研究中檢測(cè)到的等位基因數(shù)和PIC值超過平均值的標(biāo)記15個(gè)，等位基因數(shù)和PIC值均低于相關(guān)平均值的標(biāo)記。在其他來源品種的研究中，等位基因數(shù)和PIC值均都較高，如黃瑞等[16]在構(gòu)建非洲水稻種質(zhì)資源SSR指紋圖譜時(shí)，RM85、RM17、RM219的等位基因數(shù)分別為4、5、9，PIC值分別為0.463、0.658和0.823。這說明本研究所采用的指紋標(biāo)記本身具有較高的代表性，由這些標(biāo)記所構(gòu)建的分子指紋圖譜在品種鑒定、品種選育及種子管理等方面具有現(xiàn)實(shí)意義。

DNA分子指紋圖譜以可見的譜帶形式來表示各品種DNA的組成。通過對(duì)譜帶進(jìn)行條帶賦值，構(gòu)建品種指紋圖譜數(shù)據(jù)和分子身份證庫，可實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)管理。判斷新選育組合是否是水稻新品種，只需將其指紋信息或分子身份證輸入數(shù)據(jù)庫，與現(xiàn)有品種進(jìn)行比較，可達(dá)到鑒定目的。本研究已構(gòu)建了27個(gè)親本的分子身份證數(shù)據(jù)庫，隨著后期研究深入，已構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫會(huì)有一定的局限性。這就需要繼續(xù)往數(shù)據(jù)庫中添加品種及其SSR指紋身份證號(hào)，進(jìn)一步豐富和完善數(shù)據(jù)庫。

對(duì)育種家而言，了解品種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近是育種工作的基礎(chǔ)。根據(jù)指紋圖譜中所計(jì)算的品種間遺傳距離，經(jīng)UPGMA法所構(gòu)建的品種間親緣關(guān)系樹狀圖，可直觀地看出各品種間的遺傳差異。根據(jù)Xiao等[17]和趙慶勇等[18]的研究結(jié)果，聚類分析結(jié)果能較好地預(yù)測(cè)亞種內(nèi)的雜種優(yōu)勢(shì)，而亞種間的相關(guān)程度不足以預(yù)測(cè)產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)。本研究所選用的親本均為秈稻品種，指紋圖譜及聚類分析結(jié)果對(duì)于科學(xué)配制雜交組合、預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)具有一定指導(dǎo)作用，并為下一步的分子設(shè)計(jì)育種打下基礎(chǔ)。

種子混雜、外來花粉授粉造成種質(zhì)資源的變異及遺傳漂變?cè)斐傻母淖兪菍?dǎo)致親本不純的主要因素。為長期保存種質(zhì)資源，可利用SSR標(biāo)記來有效鑒定各親本材料，以確保保存材料的真實(shí)性。本研究中還檢測(cè)到14個(gè)親本具有特征性標(biāo)記，在進(jìn)行入庫前的真實(shí)性和純度檢測(cè)時(shí)，可優(yōu)先選用這些標(biāo)記。

研究中，筆者還發(fā)現(xiàn)了7個(gè)標(biāo)記雜合位點(diǎn)，這說明親本可能不完全純合。根據(jù)前人的研究報(bào)道[1]，這些雜合位點(diǎn)可能引起剩余遺傳效應(yīng)，導(dǎo)致雜交稻與其親本不匹配，品種不穩(wěn)定遺傳等情況。田大剛等[19]認(rèn)為，這種不穩(wěn)定遺傳的情況是廣泛存在的。對(duì)于本研究中遺傳不穩(wěn)定的標(biāo)記，在品種一致性、穩(wěn)定性及雜種純度檢測(cè)的研究中，盡量不選擇使用；在品種選育過程中，需緊密結(jié)合大田選育，以獲得具有目標(biāo)性狀、穩(wěn)定遺傳的新種質(zhì)/材料。

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Fingerprinting Construction of Rice Core Parental Lines with SSR Markers

ZENG Xiaoshan，PENG Dan，SHI Yuanyuan，XIE Wei，LIU Aiming*

(Yuanlongping High-Tech Agriculture CO.LTD.，Changsha，Hunan 410006，China)

Fingerprinting profiles and molecular identity cards of 27 rice core parental lines were established using 48 SSR markers recommended by “Sector Standard of Agriculture (NY/T 1433-2014)”.Total 162 Polymorphic fragments were detected with an average of 3.53 alleles for each SSR primer.Each of the 45 SSR primers are amplified more than 2 alleles respectively，theirPIC(polymeric index content) values ranged from 0.07 to 0.80，and the average PIC value is 0.46.Result from cluster analysis showed that genetics similarities among the 27 lines ranged from 0.593 to 0.944，which reflected basically the genetic relatives based on the pedigree analysis.Varietal genetic files were developed based on the established fingerprinting profiles and molecular identity cards，and found that it performed well in intellectual property rights protection，varietal identification and purity testing.

rice；core parental lines；SSR markers；fingerprinting；molecular identity cards

2016-04-20

曾曉珊(1977-)，女，副研究員，博士，主要研究方向?yàn)榉肿虞o助育種，mail：zengxiaoshan@lpht.com.cn。*通信作者：劉愛民，Email：lam@lpht.com.cn。

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科技專項(xiàng)(201303005)。

S511.032

A

1001-5280(2016)05-0481-06

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.05.01