李曉玲，王紅艷，瞿 偉，朱蓋山，劉 超

宿州學院化學化工學院，安徽宿州，234000

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鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶相互作用的光譜研究

李曉玲，王紅艷，瞿 偉，朱蓋山，劉 超

宿州學院化學化工學院，安徽宿州，234000

采用熒光光譜法、紫外吸收光譜法研究了生理酸度條件下鹽酸頭孢吡肟(cefepime hydrochloride )與胃蛋白酶(pepsin)之間的相互作用，結果表明鹽酸頭孢吡肟對胃蛋白酶具有強烈的猝滅作用。用Stern-Volmer方程處理實驗數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)鹽酸頭孢吡肟對胃蛋白酶的熒光猝滅過程主要由熒光猝滅體系完成的，且為靜態(tài)猝滅。并計算出了不同溫度下的猝滅常數(shù)、結合常數(shù)、結合位點數(shù)和相關的熱力學參數(shù)，結果表明鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間的作用力主要是氫鍵和范德華力，且ΔG<0，同時證實它們之間的作用是自發(fā)進行的。按照Forster非輻射能量轉移機理，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶結合時給體-受體之間的距離r=1.380 nm。

鹽酸頭孢吡肟;胃蛋白酶;熒光猝滅;自發(fā)

蛋白質在生命中充當著非常重要的角色[1]，它不僅是人體主要的營養(yǎng)物質，可以促進人體組織的生長、更新和修復，而且可以承擔著各種重要的生理功能等[2]。鹽酸頭孢吡肟屬于頭孢類抗生素[3],它的工人合成已取得重大的進展[4]，目前已用于多種細菌感染疾病的治療[5-7]。鹽酸頭孢吡肟屬于電中性的兩性離子，具有良好的水溶性，對β-內酰胺酶親和力較低[8]，抗菌穩(wěn)定性較強[9]。 同時病人用藥后，不影響心電圖、心率和血壓以及腸蠕動，也不改變紅細胞脆性和凝血參數(shù)[10]。

胃蛋白酶被定義為消化性蛋白酶[11]，由胃粘膜主細胞分泌，主要作用是分解蛋白質為小的肽片段讓機體更容易吸收。鹽酸頭孢吡肟具有激活胃蛋白質酶原[12]，為胃蛋白酶提供酸性環(huán)境，幫助人體消化等功能。本文采用熒光光譜、紫外吸收光譜研究胃蛋白酶和鹽酸頭孢吡肟之間的相互作用，旨為鹽酸頭孢吡肟的藥理學研究提供參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與藥品

儀器:U-3310紫外可見分光光度計(日本日立公司)；F-4500熒光分光光度計(日立高新技術公司)；HH-1恒溫水浴鍋(上海啟前電子科技有限公司)；pHS-23型精密PH計(上海尚闊有限公司)；分析天平(常州市天之平儀器設備有限公司)。

藥品:鹽酸頭孢吡肟(齊魯制藥有限公司)，使用時配制成濃度為2.0×10-4mol·L-1的溶液；胃蛋白酶(鄭州奇華頓化工產(chǎn)品有限公司)，使用時配制成濃度為2.0×10-4mol·L-1的溶液；BR緩沖溶液(pH=2.0)。

1.2 實驗方法

取10支10 mL比色管，分別加入1.0 mL 2.0×10-4mol·L-1胃蛋白酶溶液和2.0 mL pH=2.0的BR緩沖液，再依次加入0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50 mL 2.0×10-4mol·L-1的鹽酸頭孢吡肟溶液，然后加水定容至10 mL，搖勻后放置20 min。分別記錄293 K、298 K、310 K條件時，波長為300～450 nm范圍內的熒光發(fā)射光譜(設定激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，激發(fā)波長285 nm)。

2 實驗結果與討論

2.1 胃蛋白酶的熒光猝滅光譜

圖1為胃蛋白酶和鹽酸頭孢吡肟發(fā)生熒光猝滅的光譜圖。由圖1(a)可知，在溫度為293 K時，胃蛋白酶在350 nm處有熒光最大發(fā)射峰，熒光強度達到283.3；由圖1(b)可知，在溫度為298 K時，胃蛋白酶在350 nm處有熒光最大發(fā)射峰，熒光強度達到311.9；由圖1(c)可知，在溫度為310 K時，胃蛋白酶在350 nm處有熒光最大發(fā)射峰，熒光強度達到308.3。綜合圖1(a)、1(b)和1(c)可知，在同一溫度下，當胃蛋白酶保持一定濃度時，隨著鹽酸頭孢吡肟濃度的增加，熒光強度逐漸減弱，說明鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間發(fā)生猝滅作用而發(fā)出內源熒光，生成一種新型的復合物。

圖1 胃蛋白酶和鹽酸頭孢吡肟發(fā)生熒光猝滅光譜圖

2.2 熒光猝滅機理

動態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅均屬于熒光猝滅[13]。在動態(tài)猝滅過程中，猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而增大。在靜態(tài)猝滅過程中，猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而減小。為了研究鹽酸頭孢吡肟和胃蛋白酶的猝滅類型，運用Stern-Volmer方程[14]處理實驗數(shù)據(jù)，以便作出準確判斷

F0/F=1+Kq0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中，F(xiàn)0為不加鹽酸頭孢吡肟情況下系統(tǒng)中熒光強度的值，F(xiàn)為加入鹽酸頭孢吡肟情況下系統(tǒng)中熒光強度的值,KSV為猝滅常數(shù)，[Q]為鹽酸頭孢吡肟濃度，Kq為動態(tài)猝滅常數(shù)，τ0(10-8s-1)為胃蛋白酶的平均熒光壽命。實驗中，分別在293、298和310 K條件，用F0/F對[Q]作圖，如圖2所示。

圖2 鹽酸頭孢吡肟-胃蛋白酶體系中F0/F對[Q]所作的線性關系圖

由圖2可知，固定濃度梯度的鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶相互反應的Stern-Volmer曲線在一定溫度下表現(xiàn)出一定的線性關系。Stern-Volmer為猝滅常數(shù)，Ksv是直線斜率。由猝滅常數(shù)公式Ksv=Kqτ0可以得到Kq=Κsv/τ0,從而求出猝滅過程中速率常數(shù)Kq的值。實驗數(shù)據(jù)列于表1中，由表1可知，猝滅常數(shù)Ksv的大小隨溫度的升高而逐漸降低，因為速率常數(shù)Kq值要遠遠大于最大擴散碰撞速率常數(shù)的值(2.0×1010L·mol-1·s-1)，由此可以推出鹽酸頭孢吡肟對胃蛋白酶的猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

表1 不同溫度下鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶相互作用的猝滅常數(shù)

2.3 鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶結合常數(shù)與結合位點數(shù)的測定

運用(2)式可以計算出靜態(tài)猝滅過程中鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間作用的結合常數(shù)Ka。

(2)

式中，n是結合位點數(shù)，Ka為鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶的結合常數(shù)[15]。以log[(F0-F/F)]為Y軸，以log[Q]為X軸作log[(F0-F/F)]對log[Q]的直線圖，如圖3所示。由圖3可知,結合常數(shù)n和結合位點數(shù)Ka的值，即運用(2)式可求出鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶系統(tǒng)在不同溫度下的Ka與n值。

根據(jù)圖3并結合常數(shù)公式可以看出，通過直線截距可以得到鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間的結合常數(shù)Ka,由直線的斜率可得出鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶的結合位點數(shù)n。在293、298、310K三個溫度下所得的結合常數(shù)、結合位點數(shù)和熱力學參數(shù)見表2。由表2可以看出，溫度逐漸升高，Ka的值逐漸減小，即溫度提高，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶結合的作用力減弱；鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶作用時，結合位點數(shù)為1個。同時還可以看出，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶間結合位點數(shù)n是下降的，這也說明隨著溫度的提高，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶間的結合能力減弱。由此可以證明鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間的猝滅類型是靜態(tài)猝滅。

圖3 log[(F0-F/F)]對log[Q]所作的線性圖

表2 鹽酸頭孢吡肟和胃蛋白酶在不同溫度下的結合常數(shù)、結合位點數(shù)和熱力學參數(shù)

2.4 反應熱力學參數(shù)計算與作用力類型的判定

在一定的溫度條件下，一個化學反應的焓變ΔH可以看作是一個常數(shù)，并由下式(3)算出它的值，吉布斯自由能變(ΔG)和熵變(ΔS)可由式(4)和(5)求得。

ln(K2/K1)=-ΔH/R(1/T2-1/T1)

(3)

lnK=-ΔH/(KT)+ΔS/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

式中，R是摩爾氣體常數(shù)，K是結合常數(shù)，求得的熵變ΔS、吉布斯自由能變ΔG、焓變ΔH見表2。結合作用力[16]和熱力學參數(shù)之間關系(表3)，根據(jù)熱力學規(guī)律，ΔH<0、ΔS<0時，反應結合力類型為氫鍵和范德華力;ΔH≤0、ΔS>0 時，反應結合力類型是靜電引力；ΔH>0、ΔS>0時，反應結合力類型是疏水作用力;根據(jù)表2，ΔG<0，表明鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶的反應是一系列自發(fā)過程。在溫度293、298與310 K時，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶反應中的ΔH<0，ΔS<0，故其間的作用力是氫鍵與范德華力。

表3 結合作用力和熱力學參數(shù)之間的關系

2.5 結合位置計算

根據(jù)Forster轉移理論[17]，當供體的熒光光譜與受體的紫外光譜部分重疊時，說明受體和供體間產(chǎn)生了非輻射能量的轉移[18]，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶間的距離非常小，當最大距離R≤7nm時，說明鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間產(chǎn)生了非輻射能量轉移。

在溫度為298K,pH=2.0時，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶的濃度均為2.0×10-5mol·L-1，在濃度比為1∶1的條件下，胃蛋白酶的熒光光譜和鹽酸頭孢吡肟的紫外-可見吸收光譜有一部分發(fā)生重疊，如圖4所示。

2016-08-26

安徽省教育廳自然科學研究重點項目“含氮/氧芳香雜環(huán)后過渡金屬配合物的組裝及催化C-C、C-N鍵形成反應研究”(KJ2016A772)；宿州學院一般科研項目“頭孢類藥物及納米材料與蛋白質相互作用的研究”(2014yyb09)。

李曉玲(1980-)，女，安徽宿州人，碩士，助教，主要研究方向：藥物分析與化學分析。

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.11.033

R285.0

A

1673-2006(2016)11-0124-04