劉凌平,和肖營,都立輝,沈 飛,袁 建,鞠興榮

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210046)

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傅里葉變換衰減全反射紅外光譜技術(shù)對稻谷中常見有害霉菌的快速鑒別

劉凌平,和肖營,都立輝*,沈 飛,袁 建,鞠興榮

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210046)

本研究利用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜技術(shù)(ATR-FTIR)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法,對稻谷中7種常見有害霉菌(尖孢鐮刀菌Pr、尖孢鐮刀菌Po、尖孢鐮刀菌M23、黃灰青霉Pe、擴(kuò)展青霉3.7898、灰綠曲霉3.3975和亮白曲霉)進(jìn)行了快速鑒定。結(jié)果顯示,運(yùn)用主成分分析法(PCA)能夠有效區(qū)分七種不同類別的菌株樣品。建立的線性判別分析(LDA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型,對7種不同類別菌株的留一交互驗證整體正確率分別達(dá)到87.1%和87.3%。說明運(yùn)用ATR-FTIR技術(shù)對稻谷侵染霉菌的種類實現(xiàn)快速鑒別具有一定可行性。

ATR-FTIR,稻谷,霉菌,快速鑒別

Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China)

糧食在高溫高濕條件下極易發(fā)霉變質(zhì),不僅造成經(jīng)濟(jì)損失,且多數(shù)產(chǎn)毒霉菌的次級代謝產(chǎn)物嚴(yán)重威脅人畜健康[1]。目前,糧食中霉菌種類的檢測方法主要包括:平板菌落計數(shù)法[2]、高效液相色譜法[3-4,10]、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]、PCR和免疫法[7-9]等,然而,上述方法存在操作繁瑣、靈敏性低,或成本高、耗時長等不足之處,難以實時監(jiān)測霉菌的生長狀況。因此,急需發(fā)展一種能夠快速識別糧食中產(chǎn)毒霉菌的檢測方法。

傅里葉變換衰減全反射紅外光譜(ATR-FTIR)法具有制樣簡單、無損和檢測靈敏度高等特點[11-12],是一種有效的微生物識別及鑒定手段[13]。Naumann等[14]研究表明,傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術(shù)可用于微生物的區(qū)分、歸類和識別。目前,基于FTIR技術(shù)用于微生物特性的研究備受研究者青睞。柴阿麗等[13]運(yùn)用ATR-FTIR技術(shù)結(jié)合聚類分析法對來自14個屬的17株真菌進(jìn)行鑒別,達(dá)到理想效果。Volha Shapaval等[15]運(yùn)用FTIR法分析5種菌屬的11種真菌,結(jié)果表明,曲霉、毛霉、擬青霉可依據(jù)脂肪酸、脂質(zhì)和碳水化合物的變化將其區(qū)分開來,且基于脂蛋白的差異可以區(qū)分交鏈孢霉和莖點霉。A.Lecellier等[16]通過由486種真菌的紅外光譜信息構(gòu)成的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配,達(dá)到快速鑒別霉菌的目的。然而,目前多數(shù)研究僅限于霉菌種類的區(qū)分,缺乏對糧食中霉菌的鑒別分析。

綜上,本研究將采用ATR-FTIR法對稻谷中七種常見有害霉菌進(jìn)行檢測,結(jié)合主成分分析(PCA)、線性判別分析(LDA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)建立7種霉菌的快速判別模型[17],為ATR-FTIR法實現(xiàn)谷物中霉菌的快速檢測及早期預(yù)警提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

七種稻谷中常見有害霉菌 灰綠曲霉3.3975、亮白曲霉、黃灰青霉菌Pe、擴(kuò)展青霉3.7898、尖孢鐮刀菌Po、尖孢鐮刀菌Pr、尖孢鐮刀菌M23,七種霉菌均為稻谷中分出并經(jīng)過基因鑒定;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;甘油 北京索萊寶科技有限公司。

傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司;血球計數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司;EX30生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司;載玻片 鹽城市飛舟玻塑有限公司;單人雙面超凈工作臺 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;冰箱 青島海爾股份有限公司;WH-2微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱 南京曉曉儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 霉菌的培養(yǎng) 采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。500 mL三角瓶裝入400 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,經(jīng)121 ℃滅菌20 min后,待培養(yǎng)基冷卻到55 ℃左右時,將培養(yǎng)基倒入到滅菌過的一次性的培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基凝固后,將七種霉菌分別接種到培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28 ℃。

1.2.2 孢子懸浮液的收獲與處理 將培養(yǎng)5 d后的霉菌取出,取4 mL滅菌的甘油-水(%v/v,1∶10)溶液于培養(yǎng)基表面,輕微震蕩后,移取培養(yǎng)基表面的孢子懸浮液于EP管中,置于-20 ℃保藏備用。

1.2.3 霉菌孢子的計數(shù) 將孢子懸浮液置于微型旋渦混合儀上震蕩10 s,取50 μL孢子懸浮液于血球計數(shù)板上,在EX 30生物顯微鏡下觀察并計數(shù),為驗證ATR-FTIR對霉菌光譜的特異性以及不同孢子懸浮液濃度的影響,分別對以上樣品稀釋10倍和20倍,共計得到62份樣品,進(jìn)行檢測分析。

1.2.4 ATR-FTIR光譜采集 利用德國布魯克公司的FTIR儀,結(jié)合ATR附件(Pike公司,美國)采集不同濃度的7種霉菌孢子懸浮液的光譜信息。先掃描背景(空氣),然后,移取4 μL的樣品于ZnSe晶體上進(jìn)行檢測,掃描32次,分辨率為4 cm-1,測量范圍4000～800 cm-1,每個樣品檢測3次,取平均光譜建模。不同樣品間需用無水乙醇擦拭平臺以避免交叉污染。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 16.0軟件,TQ analyst 6.0和Matlab 7.0 軟件對樣品光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。運(yùn)用主成分分析法(PCA)對樣品聚類趨勢進(jìn)行分析,線性判別分析(LDA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA),并運(yùn)用留一交互驗證法對模型性能進(jìn)行驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 霉菌孢子計數(shù)結(jié)果

顯微鏡計數(shù)結(jié)果顯示,七種霉菌懸浮液樣品的濃度分別為:擴(kuò)展青霉3.7898:5.5×106個/mL,黃灰青霉Pe:5.4×106個/mL,尖孢鐮刀菌Pr:1.9×107個/mL,尖孢鐮刀菌Po:1.425×107個/mL,尖孢鐮刀菌M23:6.9375×106個/mL,灰綠曲霉3.4.5×106個/mL,亮白曲霉:1.02×107個/mL,七種霉菌孢子懸浮液的孢子數(shù)均在一個數(shù)量級或在相近的數(shù)量級,即它們的孢子濃度相近。

2.2 ATR-FTIR光譜圖

圖1為7種霉菌孢子懸浮液在4000～800 cm-1的紅外光譜圖。由于7種霉菌孢子懸浮液的化學(xué)成分相似,導(dǎo)致樣品紅外光譜圖的整體趨勢及出峰位置一致,難以直觀判別不同樣品。對光譜圖分析可知,在3700～2996 cm-1處與O-H、N-H伸縮振動有關(guān)的吸收[18],1800～1450 cm-1處關(guān)于蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的吸收[19],1185～900 cm-1處為C-O-C和C-O-P的伸縮振動帶[20-21]。仔細(xì)觀察可知,不同霉菌樣品的光譜曲線在1000～900 cm-1區(qū)域存在明顯差異,表明其內(nèi)部成分存在細(xì)微差異。鑒于不同霉菌樣品懸浮液的紅外光譜圖無明顯差異,下一步需對光譜信息進(jìn)一步分析。

圖1 7種霉菌孢子懸浮液樣品的ATR-FTIR光譜圖Fig.1 ATR-FTIR spectra of spore suspensions from seven kinds of fungal strains

2.3 PCA結(jié)果

圖2為7種不同濃度的霉菌孢子懸浮液光譜信息的主成分得分圖。由圖2可知,從菌屬來看,尖孢鐮刀菌屬、青霉屬和曲霉屬3種菌屬樣品有大致分離趨勢,說明三種菌屬樣品之間的差異較為明顯,曲霉類樣品可完全區(qū)分于其他2類。除了個別來自青霉菌屬的樣品與其他類別混在一起之外,大部分樣品能夠被很好的區(qū)分。進(jìn)一步觀察7類霉菌樣品的聚類趨勢可知,除了3種尖孢鐮刀菌樣品及黃灰青霉Pe樣品間存在部分重疊之外,其余3種霉菌可區(qū)分良好。結(jié)果表明,不同霉菌樣品懸浮液的紅外光譜吸收強(qiáng)度存在區(qū)別,PCA可以提取不同樣品間的差異信息,采用ATR-FTIR法識別稻谷中的不同霉菌具有可行性。下一步將利用從光譜中提取的前10個主成分建立不同菌屬的判別分析模型。

表1 7種霉菌孢子懸浮液樣品的LDA模型留一交互驗證結(jié)果

Table 1 Discrimination results of cross-validation LDA of spore suspensions from seven kinds of fungal strains

類別預(yù)測類別尖孢鐮刀菌Pr尖孢鐮刀菌Po尖孢鐮刀菌M23黃灰青霉Pe擴(kuò)展青霉37898灰綠曲霉33975亮白曲霉正確率(%)尖孢鐮刀菌Pr100000001000尖孢鐮刀菌Po2800000800尖孢鐮刀菌M233060000667黃灰青霉Pe00090001000擴(kuò)展青霉378980001500833灰綠曲霉339750000081889亮白曲霉0000018889總計871

表2 7類霉菌樣品的留一交互驗證PLS-DA模型判別結(jié)果

Table 2 Discrimination results of cross-validation PLS-DA of seven fungal species

項目尖孢鐮刀菌Pr尖孢鐮刀菌Po尖孢鐮刀菌M23黃灰青霉Pe擴(kuò)展青霉37898灰綠曲霉33975亮白曲霉樣品量(個)101099699正確率(%)991894792888796955796敏感性(%)100827904887981982925特異性(%)981788885887925911925

圖2 7種霉菌孢子懸浮液樣品的PCA得分圖Fig.2 PCA scores plot of spore suspensions from seven kinds of fungal strains

2.4 LDA結(jié)果

7種霉菌孢子紅外光譜信息的LDA函數(shù)得分圖如圖3所示。結(jié)果顯示,不同類別霉菌樣品在水平方向的位置相距較遠(yuǎn),差異明顯,除青霉菌屬間和曲霉菌屬間出現(xiàn)部分重疊外,其余樣品均能被完全區(qū)分,其結(jié)果優(yōu)于PCA。留一交互驗證結(jié)果如表1所示,整體判別正確率為87.1%,其中僅尖孢鐮刀菌M23的判別正確率偏低,3個樣誤判為尖孢鐮刀菌Pr,其余結(jié)果均大于或等于80%。尖孢鐮刀菌Pr和黃灰青霉Pe的判別正確率最高,均為100%。另外,仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn),誤判均發(fā)生在不同菌屬內(nèi),3類菌屬間的判別正確率同為100%。

圖3 7種霉菌孢子懸浮液樣品紅外光譜信息的LDA得分圖Fig.3 LDA score map of the infrared spectra of spore suspensions from seven kinds of fungal strains

2.5 PLS-DA結(jié)果

為比較不同化學(xué)計量學(xué)方法對模型精度的影響,進(jìn)一步運(yùn)用主成分得分建立PLS-DA判別分析模型[22],結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示,模型對尖孢鐮刀菌Pr和灰綠曲霉3.3975類樣品的判別精度最佳,對尖孢鐮刀菌M23、擴(kuò)展青霉3.7898和亮白曲霉的精度稍差。7類樣品的判別正確率為79.2%～99.1%之間,整體平均判別正確率為87.3%,與LDA方法所得整體判別正確率值類似。表明ATR-FTIR技術(shù),結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法,在霉菌菌屬鑒別上取得了良好的效果。進(jìn)一步的研究,應(yīng)該擴(kuò)大樣本量,運(yùn)用多種特征提取方法,以進(jìn)一步提高模型的精度、適用性和穩(wěn)健性。

3 結(jié)論

本文利用ATR-FTIR技術(shù)對稻谷中7種常見有害霉菌進(jìn)行了快速檢測分析。PCA結(jié)果顯示不同類別的霉菌樣品可被良好區(qū)分,且樣品孢子懸浮液濃度對結(jié)果影響不明顯,建立的LDA和PLS-DA模型對7種霉菌的留一交互驗證結(jié)果的整體判別正確率分別為87.1%和87.3%,且尖孢鐮刀菌屬、青霉菌屬和曲霉菌屬間的判別正確率高達(dá)100%。結(jié)果表明,ATR-FTIR技術(shù)可用于谷物中霉菌不同屬間的快速鑒別,尤其對不同菌屬的霉菌具有良好的判別效果。

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Application of attenuated total reflection-fourier transform infrared spectroscopy for rapid identification of fungi strains on grain

LIU Ling-ping,HE Xiao-ying,DU Li-hui*,SHEN Fei,YUAN Jian,JU Xing-rong

(College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing,

Attenuatedtotalreflection-Fouriertransforminfraredspectroscopy(ATR-FTIR)wasusedincombinationwithchemomoetricsinthisstudyforrapididentificationofsevenstrainsoffungithatusuallycauseseriouslyeconomicdamagetopaddyrice(Fusarium oxysporumPr,Fusarium oxysporumPo,Fusarium oxysporumM23,Penicillium aurantiogriseumPe,Penicillim expansum 3.7898,Aspergillus glaucus 3.3975andAspergillus candidus).Theresultsindicatedthat,principalcomponentanalysis(PCA)couldeffectivelydistinguishthesevenfungistrains.Theoverallcorrectclassificationinleaves-one-outcross-validationfordifferentkindsofstrainsobtainedbylineardiscriminantanalysis(LDA)andpartialleast-squaresdiscriminantanalysis(PLS-DA)modelwas87.1%and87.3%,respectively.TheresultsverifiedthattheuseofATR-FTIRtechnologymightbefeasibleforrapididentificationofthespeciesoffungicontaminationonpaddyrice.

ATR-FTIR;grain;fungi;strains;rapididentification

2016-03-21

劉凌平(1989-),女,碩士研究生,研究方向:糧食儲藏過程中的霉菌預(yù)警及其控制，E-mail:1091624063@qq.com。

*通訊作者:都立輝(1981-),男,博士生,副教授,研究方向:糧食儲藏過程中的霉菌預(yù)警及其控制，E-mail:ddabc_2000@163.com。

糧食公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費(fèi)資助(201313002-01)以及江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(PAPD)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)19-0298-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.049