徐顧榕,陳志偉,*,鐘小廷,熊 華,左曉玲,張 慶

(1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川省食品生物技術(shù)重點實驗室,四川成都 610039; 2.四川千禾味業(yè)食品股份有限公司,四川眉山 620010)

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響應(yīng)面法優(yōu)化蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)類細(xì)菌素培養(yǎng)基

徐顧榕1,陳志偉1,*,鐘小廷2,熊 華1,左曉玲1,張 慶1

(1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川省食品生物技術(shù)重點實驗室,四川成都 610039; 2.四川千禾味業(yè)食品股份有限公司,四川眉山 620010)

采用響應(yīng)面分析法對產(chǎn)類細(xì)菌素的蠟樣芽孢桿菌XH25(BacilluscereusXH25)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,以金黃色葡萄球菌為指示菌,抑菌圈直徑作為響應(yīng)值。利用Plackett-Burman設(shè)計篩選出影響抑菌圈直徑的顯著因素:pH、可溶性淀粉和(NH4)2SO4。通過最陡爬坡實驗逼近最大抑菌圈直徑區(qū)域。采用中心組合設(shè)計法及響應(yīng)面分析確定:pH6.15、可溶性淀粉15.32 g/L和(NH4)2SO46.02 g/L。從節(jié)約成本考慮,其他不顯著因素均保持低水平濃度:酵母粉5.00 g/L、蔗糖5.00 g/L、豆粕粉5.00 g/L、MgSO40.20 g/L和K2HPO42.00 g/L。在該條件下,抑菌圈直徑預(yù)測值為12.76 mm,實驗測定值為12.92 mm,實驗結(jié)果與模型預(yù)測值吻合,說明所建模型是切實可行的,優(yōu)化后抑菌活力比優(yōu)化前(10.62 mm)提高了21.66%,為BacilluscereusXH25大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)類細(xì)菌素奠定一定基礎(chǔ)。

類細(xì)菌素,蠟樣芽孢桿菌,培養(yǎng)基,響應(yīng)面分析法

近年來,細(xì)菌耐藥性的增加趨勢使得在全世界范圍內(nèi)掀起了一股開發(fā)新型抗菌劑的熱潮,其中天然抗菌物質(zhì)作為潛在的新型生防資源已經(jīng)成為了開發(fā)熱點[1-2]。在這些潛在的天然抗菌物質(zhì)中,細(xì)菌素和類細(xì)菌素是其中最重要和最有效的防止細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)之一[3-5]。

細(xì)菌素和類細(xì)菌素是自然界普遍存在的蛋白類抗菌物質(zhì),具有高效、廣譜、安全、無耐藥性等特點[6-7],被認(rèn)為是食品添加劑、化妝品、皮膚保健、抑制病原菌和調(diào)節(jié)腸道菌群的優(yōu)選材料[8-10]。目前,國內(nèi)外對細(xì)菌素和類細(xì)菌素的研究在乳酸菌中較為深入,對芽孢桿菌屬的研究主要集中在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌當(dāng)中,但研究不深入[11-12]。與乳酸菌相比,芽孢桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素或類細(xì)菌素種類豐富,具有更廣的抗菌譜和更高的穩(wěn)定性,在開發(fā)潛力方面優(yōu)勢明顯[7,13-14]。

蠟樣芽孢桿菌XH25菌株(BacilluscereusXH25)分離于中國傳統(tǒng)中草藥,對多種致病菌和食品腐敗菌具有一定的拮抗作用。前期研究表明:該菌株拮抗作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是類細(xì)菌素,不產(chǎn)生溶血性腸毒素HBL、非溶血性腸毒素Nhe、細(xì)胞毒素K和嘔吐毒素[15]。因此,B.cereusXH25菌株作為產(chǎn)類細(xì)菌素的候選菌株具有良好的開發(fā)潛力?；诖?本研究采用響應(yīng)面分析法對B.cereusXH25菌株產(chǎn)類細(xì)菌素的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,旨在為B.cereusXH25類細(xì)菌素的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株:蠟樣芽孢桿菌(BacilluscereusXH25)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 9144) 西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏。

MgSO4、(NH4)2SO4和K2HPO4成都市科龍化工試劑廠;可溶性淀粉和蔗糖 阿拉丁公司;酵母粉 美國OXOID公司;豆粕粉 山東萬得福實業(yè)集團(tuán)有限公司。

種子培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基);指示菌培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基);優(yōu)化前發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0、可溶性淀粉12.50 g/L、(NH4)2SO46.50 g/L、酵母5.00 g/L、蔗糖5.00 g/L、豆粕粉5.00 g/L、MgSO40.20 g/L和K2HPO42.00 g/L)。

TB-214電子天平 美國丹佛儀器公司;HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;3-18K冷凍離心機(jī) Sigma公司;HZO-R恒溫?fù)u床 東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;pHS-3C數(shù)字酸度計 上海雷韻實驗儀器制造有限公司;H97恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 類細(xì)菌素的制備 將B.cereusXH25接種于NB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min,培養(yǎng)18 h后,按1.00%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中(40 mL/200 mL),37 ℃、200 r/min,發(fā)酵72 h。發(fā)酵液調(diào)pH至7.20,8000 r/min、4 ℃離心15 min,0.45 μm濾膜過濾上清液,濾液備用[4]。

1.2.2 抑菌活性測定 以金黃色葡萄球菌作指示菌,采用雙層平板打孔法測定濾液中類細(xì)菌素的抑菌活性[16]。

1.2.3 實驗設(shè)計和統(tǒng)計分析

1.2.3.1 Plackett-Burman(PB)設(shè)計 以類細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌的抑制圈直徑為響應(yīng)值,用Design-Expert 7.0軟件[17-18]對影響XH25菌株產(chǎn)類細(xì)菌素培養(yǎng)基的8個變量:可溶性淀粉(X1)、酵母粉(X2)、蔗糖(X3)、豆粕粉(X4)、MgSO4(X5)、(NH4)2SO4(X6)、K2HPO4(X7)和pH(X8)進(jìn)行設(shè)計。其中,各變量的低水平和高水平分別編碼為-1和+1,其值如表1。

表1 Plackett-Burman實驗分析變量與水平

Table 1 Levels of the variables tested in the Plackett-Burman design

變量水平-1+1X1可溶性淀粉(g/L)5002000X2酵母粉(g/L)5001500X3蔗糖(g/L)5001500X4豆粕粉(g/L)5002000X5MgSO4(g/L)020030X6(NH4)2SO4(g/L)3001000X7K2HPO4(g/L)200600X8pH500800

1.2.3.2 最陡爬坡實驗設(shè)計 根據(jù)PB實驗結(jié)果設(shè)計最陡爬坡實驗,以變量的偏回歸系數(shù)設(shè)定顯著因素的步長和變化方向,加速響應(yīng)值逼近最大響應(yīng)區(qū)間。

1.2.3.3 中心組合設(shè)計與模型驗證 根據(jù)PB和最陡爬坡實驗的結(jié)果,對顯著因素作進(jìn)一步優(yōu)化。選擇中心點實驗次數(shù)為6、星號臂長為1.682的中心組合設(shè)計法進(jìn)行實驗,以實驗數(shù)據(jù)為依據(jù)構(gòu)建響應(yīng)面模型,確定最佳培養(yǎng)基配方,并驗證模型的有效性。

表2 中心組合變量水平設(shè)計表

Table 2 Levels of the variables tested in the central composite design

變量變量水平168210-1-1682X1(g/L)19201750150012501080X6(g/L)698650580510462X8684650600550516

1.2.3.4 統(tǒng)計分析 每個實驗重復(fù)3次,取其平均值(相對誤差小于5.00%),采用Design-Expert 7.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 變量的響應(yīng)效應(yīng)分析

以變量的低水平和高水平值進(jìn)行PB實驗(N=12),PB設(shè)計與實驗結(jié)果見表3。以表2實驗值為響應(yīng)值分析變量的影響效應(yīng)(表4),結(jié)果表明:可溶性淀粉(X1)、酵母粉(X2)、豆粕粉(X4)和K2HPO4(X7)對抑菌圈值呈正效應(yīng);MgSO4(X5)、(NH4)2SO4(X6)和 pH(X8)對抑菌圈值呈負(fù)效應(yīng);蔗糖(X3)對抑菌圈值無影響。其中,可溶性淀粉(p=0.0016)、(NH4)2SO4(p=0.0087)和pH(p=0.0031)的p值均小于0.01,影響極顯著,說明三者量的變化對菌株XH25產(chǎn)類細(xì)菌素的影響極大。因此,這三個變量作為極顯著因素進(jìn)行后續(xù)的最陡爬坡實驗和響應(yīng)面分析。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計方案與實驗值

Table 3 The matrix of Plackett-Burman design and the observed values

實驗次數(shù)X1X2X3X4X5X6X7X8實驗值(mm)11111-1-11-111522-11-111-1-1184831-11-111-1-19424-111111-1-18525-1-1-11-111-18776-1-11-11-11179271-1-111111848811-1-1-11-11913911-1-11-11-1111410-111-1-1-111817111-111-11-1193212-1-1-1-1-1-1-1-1877

表4 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

Table 4 Partial regression coefficients and analyses of their significance

變量效應(yīng)系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差F值p值X113706800621200700016??X20700350062315000112?X3000000006200010000X4010005006206404813X5-030-015006257900954X6-077-0380062377900087??X70400200062102900491?X8-110-0550062777900031??

注:R2=0.9895;*:差異顯著,即p<0.05;**:差異極顯著,即p<0.01。

2.2 最大逼近區(qū)域探尋

依據(jù)PB對變量的評估結(jié)果,沿可溶性淀粉增加方向、(NH4)2SO4減少和pH降低方向探尋爬坡步長。在X1、X6和X8的爬坡新步長分別為2.50、-0.70和-0.50下,設(shè)計最陡爬坡實驗(表5)。在可溶性淀粉15.00 g/L、(NH4)2SO45.80 g/L和pH6.00條件下,抑菌圈直徑達(dá)最大值,為12.23 mm,表明:爬坡實驗3是菌株XH25產(chǎn)類細(xì)菌素最佳培養(yǎng)基中三個極顯著變量的最大逼近區(qū)域。

表5 最陡爬坡實驗設(shè)計和結(jié)果

Table 5 Experimental design and response value of path of steepest ascent

項目X1X6X8實驗值(mm)(1)PB設(shè)計基點1250650650(2)原始步長750350150(3)坡度068-038-055(4)響應(yīng)范圍=(2)×(3)510-133-083(5)爬坡步長=(4)×05a255-0665-0413(6)不大于取十分位的爬坡新步長250-070-050爬坡實驗11000720700972爬坡實驗212506506501018爬坡實驗315005806001223爬坡實驗41750510550957爬坡實驗52000440500922

注:0.5a:依據(jù)PB實驗結(jié)果利用最陡爬坡分析所得經(jīng)驗值。2.3 響應(yīng)面模型構(gòu)建

根據(jù)PB和最陡爬坡實驗確定的因素和水平,以抑菌圈直徑為響應(yīng)值(Y),可溶性淀粉15.00 g/L、(NH4)2SO45.80 g/L、pH6.00為中心點,設(shè)計三因素五水平的變量值表(表2),在此基礎(chǔ)上進(jìn)行中心組合實驗(表6),其中實驗1～14是析因?qū)嶒?實驗15～20是中心實驗。20個實驗點分為析因點和零點,其中析因點為自變量取值在X1、X6、X8所構(gòu)成的三圍頂點,零點為區(qū)域的中心點,零點實驗重復(fù)6次,用以估計實驗誤差。通過表6實驗值的二次多元回歸擬合,得到抑菌圈直徑(Y)響應(yīng)三變量的二次多項式模型:

Y=12.63+0.15X1+0.27X6+0.52X8-0.19X1X6+0.41X1X8+0.36X6X8-0.87X12-0.57X62-1.08X82

表6 中心組合實驗設(shè)計與實驗結(jié)果

Table 6 Experimental design and results of the central composite design

實驗號X1X6X8抑菌圈直徑(mm)實驗值預(yù)測值1-1-1-198097721-1-19589633-11-1972995411-18819065-1-1194892661-11110210777-111108710898111116211659-1682009919921016820010501044110-168201028105912016820118011481300-16829048711400168210221046150001276126316000125812631700012821263180001239126319000125212632000012731263

表7 中心組合實驗結(jié)果的回歸分析

Table 7 Regression results from the data of central composite designed experiments

參數(shù)估計系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差F值p值模型126301105419<00001??X1015007345300592X60270073133600044??X805200735159<00001??X1X6-019009539100762X1X80410095189300014??X6X80360095146200034??X12-087007115039<00001??X62-05700716415<00001??X82-108007123306<00001??

依據(jù)回歸方程,利用Design-Expert 7.0軟件繪制響應(yīng)曲面和等高線圖(圖1～圖3)。等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強(qiáng)弱,圓形表示交互作用不顯著,橢圓形表示交互作用顯著。圖1中可溶性淀粉和(NH4)2SO4交互作用的等高線近似圓形,表明兩者交互作用不顯著;可溶性淀粉和pH(圖2)、(NH4)2SO4和pH(圖3)交互作用的等高線形狀都是橢圓,則說明它們之間的交互作用顯著,與表7分析結(jié)果一致。對模型方程求導(dǎo)得到最大預(yù)測響應(yīng)值為12.76 mm,此時對應(yīng)變量的最佳值:可溶性淀粉濃度為15.32 g/L,(NH4)2SO4濃度為6.02 g/L,培養(yǎng)基pH為6.15。

圖1 可溶性淀粉和(NH4)2SO4的交互作用對抑菌活力影響的響應(yīng)曲面(a)和等高線圖(b)Fig.1 Response surface and contour plots of mutual-influence for soluble starch and ammonium sulphate on the inhibition zone

圖2 可溶性淀粉和pH的交互作用對抑菌活力影響的響應(yīng)曲面(a)和等高線圖(b)Fig.2 Response surface and contour plots of mutual-influence for soluble starch and pH on the inhibition zone

圖3 (NH4)2SO4和pH的交互作用對抑菌活力影響的響應(yīng)曲面(a)和等高線圖(b)Fig.3 Response surface and contour plots of mutual-influence for ammonium sulphate and pH on the inhibition zone

2.4 實驗驗證

為了驗證預(yù)測值的真實性,按照響應(yīng)面分析法得到的優(yōu)化組合,并根據(jù)實際應(yīng)用情況,以pH6.20、可溶性淀粉15.32 g/L、(NH4)2SO46.02 g/L,酵母粉、蔗糖、豆粕粉、MgSO4和K2HPO4保持低水平濃度分別為5.00、5.00、5.00、0.20和2.00 g/L進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為12.92 mm,該實驗值與模型的預(yù)測值12.76 mm接近,從而驗證了預(yù)測值的準(zhǔn)確性,說明優(yōu)化模型可靠。同時,與優(yōu)化前(培養(yǎng)基:pH7.00、可溶性淀粉12.50 g/L、(NH4)2SO46.50 g/L、酵母5.00 g/L、蔗糖5.00 g/L、豆粕粉5.00 g/L、MgSO40.20 g/L和K2HPO42.00 g/L,抑菌圈直徑10.62 mm)相比,抑菌圈直徑提高了21.66%。安俊瑩等[19]利用響應(yīng)面法優(yōu)化B.amyloliquefaciensZJHD-06 產(chǎn)類細(xì)菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基,優(yōu)化后得到的類細(xì)菌素對單核增生李斯特菌的抑菌圈直徑增加了27.82%。Dominguez A P M等[4]利用響應(yīng)面法優(yōu)化B.cereus產(chǎn)類細(xì)菌素的培養(yǎng)基,提高了18.72%的產(chǎn)量(對金黃色葡萄菌抑菌圈直徑的大小)。這些結(jié)果表明:響應(yīng)面法優(yōu)化所獲的培養(yǎng)基能夠明顯提高目標(biāo)菌株產(chǎn)類細(xì)菌素的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化B.cereusXH25產(chǎn)類細(xì)菌素的培養(yǎng)基。PB實驗對pH、可溶性淀粉、(NH4)2SO4、酵母粉、蔗糖、豆粕粉、MgSO4和K2HPO4進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉、(NH4)2SO4和pH對菌株XH25產(chǎn)類細(xì)菌素有顯著影響;最陡爬坡實驗進(jìn)一步表明:菌株XH25產(chǎn)類細(xì)菌素最佳培養(yǎng)基的最大逼近區(qū)域在可溶性淀粉15.00 g/L、(NH4)2SO45.80 g/L和pH6.00附近。在此基礎(chǔ)上,中心組合實驗構(gòu)建的二次多項式模型。優(yōu)化實驗確定培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為:培養(yǎng)基pH6.15、可溶性淀粉15.32 g/L、(NH4)2SO46.02 g/L,酵母粉、蔗糖、豆粕粉、MgSO4和K2HPO4濃度分別為5.00、5.00、5.00、0.20、2.00 g/L。在該條件下,實驗值12.92 mm,與模型預(yù)測值12.76 mm接近,說明了優(yōu)化模型可靠。同時,與優(yōu)化前相比,發(fā)酵液的抑菌活力提高了21.66%,表明優(yōu)化方案能明顯提高XH25菌株產(chǎn)類細(xì)菌素的產(chǎn)量,為B.cereusXH25類細(xì)菌素的開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation medium ofBacilluscereusfor bacteriocin-like substance by response surface methodology

XU Gu-rong1,CHEN Zhi-wei1，*,ZHONG Xiao-ting2,XIONG Hua1,ZUO Xiao-ling1,ZHANG Qing1

(1.College of Food and Bioengineering,Xihua University,Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan,Chengdu 610039,China； 2.Sichuan Qianhe Condiment and Food Co,Ltd,Meishan 620010,China)

Responsesurfacemethodologywasemployedtooptimizemediumcompositionfortheproductionofbacteriocin-likesubstancebyBacillus cereusXH25.ThePlackett-Burmendesignwasusedtoevaluatetheeffectsofdifferentcomponentsintheculturemedium.TheinitialpHofmedium,solublestarchand(NH4)2SO4werefoundtosignificantlyinfluencethebacteriocin-likesubstanceproduction.Thesteepestascentmethodwasundertakentoaccesstheoptimalregionoftheabovethreesignificantfactors,andthentheirconcentrationswereoptimizedbythecentralcompositedesignandtheresponsesurfacemethodology.TheresultsindicatedthattheoptimizedmediumwasinitialpHof6.15,solublestarchof15.32g/Land(NH4)2SO4of6.02g/L,andunderthiscondition.Consideringthecost,otherinsignificantfactorsweremaintainedatlowlevels:yeastpowderof5.00g/L,sucroseof5.00g/L,soybeanmealof5.00g/L,MgSO4of0.20g/LandK2HPO4of2.00g/LThepredictedvalue12.76mmwasverifiedsubsequentlybyvalidationexperimentsvalue12.92mm.Theexcellentcorrelationbetweenpredictedandobservedvaluesfurtherconfirmedtheadequacyandaccuracyofthemodelobtained.AndtheantibacterialactivityagainstStaphylococcus aureusATCC9144wasincreasedby21.66%comparedwiththeoriginalmedium,whichprovidedabasisforfurtherstudyonthelargescalebatchfermentationofproductionofbacteriocin-likesubstancebyB. cereusXH25.

bacteriocin-likesubstance;Bacillus cereus;fermentationmedium;responsesurfacemethodology

2016-04-21

徐顧榕(1992-)，女， 碩士研究生，研究方向:食品微生物分子生態(tài)，E-mail:xuluffy@sina.com。

*通訊作者:陳志偉(1973-)，男，碩士，高級實驗師，研究方向:食品科學(xué)與工程, E-mail:19127720@qq.com。

糧油工程與食品安全四川省高校重點實驗室開放基金(SZJJ2014-001)；西華大學(xué)重點科研基金項目(YCJJ2016146)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)19-0212-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.033