黎 慶,景 浩

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

?

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白的熱處理穩(wěn)定性的比較研究

黎 慶,景 浩*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(Ovotransferrin,OVT)和乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)經(jīng)不同溫度(50～90 ℃)處理后,通過圓二色性分析比較其二級結(jié)構(gòu)的變化,紫外吸收和表面疏水性分析比較其空間構(gòu)象的變化,SDS-PAGE分析比較其分子的聚集,溶解度分析比較其功能的變化。結(jié)果表明,50～60 ℃時,OVT和LF的理化特性均無明顯變化。70 ℃時,OVT和LF的紫外吸光值均明顯增大;80～90 ℃時,OVT的紫外吸光值不再進(jìn)一步增大,而LF的進(jìn)一步逐漸增大。70～90 ℃時,OVT和LF的表面疏水性指數(shù)均明顯增大;LF的表面疏水性指數(shù)遠(yuǎn)大于OVT的,但OVT的增大程度較LF的更大。70～90 ℃時,OVT和LF的α-螺旋含量均明顯降低,β-折疊和無規(guī)卷曲含量均明顯升高,且OVT的二級結(jié)構(gòu)組分的變化程度較LF的更大。70～90 ℃時,OVT和LF的SDS-PAGE圖譜中的主要蛋白條帶密度均明顯降低;相同溫度下,OVT的降低程度較LF的更大。70～90 ℃時,OVT和LF的溶解度均明顯降低;相同溫度下,OVT的降低程度較LF的更大?？傊?OVT和LF的結(jié)構(gòu)和功能在加熱時均發(fā)生改變,但OVT的變化程度較LF的更大。

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,乳鐵蛋白,圓二色性,紫外吸收,表面疏水性,溶解度

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(Ovotransferrin,OVT)和乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)都為轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的一種單鏈糖蛋白,它們具有相似的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)[1-2]。OVT主要存在于雞蛋清中,約占蛋清蛋白總量的12%～13%,包含686個氨基酸殘基,分子量為78 ku[3]。LF主要存在于牛乳中,約占牛乳蛋白總量的0.3%,包含700個氨基酸殘基,分子量為80 ku[4]。OVT和LF的一級結(jié)構(gòu)都由單一的多肽鏈組成,其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和β-折疊交替排列;在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步折疊形成的高級結(jié)構(gòu)是兩個極其相似且對稱的球狀葉,即N葉和C葉。兩葉進(jìn)一步分為結(jié)構(gòu)相似的兩個亞結(jié)構(gòu)域(N1、N2、C1、C2),在兩亞結(jié)構(gòu)域的縫隙間都有一個鐵離子結(jié)合位點;即每分子蛋白能夠結(jié)合兩分子的鐵離子[1-2]。

OVT和LF具有多種相似的生物活性,如抑菌性、抗氧化性、抗炎活性等[1-2]。國家衛(wèi)生部已于2012年將LF列為營養(yǎng)強(qiáng)化劑,并規(guī)定了嬰幼兒食品、發(fā)酵乳制品(風(fēng)味發(fā)酵乳)、調(diào)制乳以及乳飲料等中LF的含量不超過1.0 g/kg[5]。LF作為一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到嬰兒配方奶粉中,能有效提高非母乳喂養(yǎng)的嬰兒對鐵的吸收率和免疫調(diào)節(jié)能力[6]。也有實驗證明,嬰兒服用含OVT的奶粉后,可防止急性腸炎,并且無異源蛋白常有的過敏等不良反應(yīng)[7]。由于雞蛋清中OVT的含量遠(yuǎn)高于牛乳中LF的含量,OVT作為功能成分在食品中的應(yīng)用還有待開發(fā)[8]。

近來有報道,經(jīng)不同溫度(55～100 ℃,5～60 min)加熱后,OVT的食物致敏性增強(qiáng),抑菌性降低[9-10]。OVT生物活性的改變均與其分子結(jié)構(gòu)的改變相關(guān)[11]。Marie等報道,超高壓滅菌(500 MPa)可致LF變性且抑菌性喪失,而巴氏殺菌(63 ℃,30 min)則對LF的抑菌性無明顯影響[12]。Celia等發(fā)現(xiàn)85 ℃下加熱10 min,LF的抑菌性沒有明顯降低[13]。閆旭東等對LF進(jìn)行不同熱處理(63 ℃,30 min;72 ℃,15 s;85 ℃,15 s;85 ℃,10 min;95 ℃,5 min;138 ℃,4 s)后發(fā)現(xiàn),隨著熱處理強(qiáng)度增加,LF的鐵結(jié)合能力和抑菌性均降低等[14]。OVT和LF的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)極其相似,而關(guān)于熱處理對它們的結(jié)構(gòu)和功能影響的比較還未見報道。本研究中,OVT和LF經(jīng)不同溫度(50～90 ℃)處理后,通過圓二色性分析其二級結(jié)構(gòu)的變化,紫外吸收和表面疏水性分析其空間構(gòu)象的變化,SDS-PAGE分析其分子的聚集,溶解度分析其功能的變化,以此比較OVT和LF的熱處理穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

OVT(Ovotransferrin,OVT,Product Code:45BG-99) 由加拿大Neova公司Alex Yousif博士饋贈(Abbotsford B C,Canada);LF(Lactoferrin,LF,純度≥95%) 由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院任發(fā)政教授饋贈;牛血清白蛋白第V組分(Bovine serum albumin fraction V,BSA,純度≥98%,分子量67.2 ku,Cat. No. 0332) 美國Amresco公司;蛋白質(zhì)染色液(Dye reagent concentrate,DRC) 美國Bio-Rad公司;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(含6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白,低分子量從大到小依次為:兔磷酸化酶B 97.4 ku、牛血清白蛋白66.2 ku、兔肌動蛋白43 ku、牛碳酸酐酶31 ku、人生長激素22 ku,批號 201205) 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所;β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)、8-苯胺基-1-萘磺酸鎂鹽(ANS-Mg2+) Sigma公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純;實驗用水為去離子水(dH2O,18 Ω)。

CU-420型恒溫水箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;XB 220A型電子天平 Precisa Gravimetrics AG公司;HJ-1型磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;pHS-3C+型酸度計 成都世紀(jì)方舟科技有限公司;QL-901型漩渦震蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司;DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠;DK-8AXX型電熱恒溫水槽 上海—恒科技有限公司;TGL-16B臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;F-7000型熒光光度計 日本Hitachi公司;UV-1200型紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司;Pistarn-180型圓二色譜儀 英國應(yīng)用光物理公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)鐵蛋白樣品的熱處理 將OVT和LF用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered saline,PBS;pH7.4)溶解,配制濃度為20 mg/mL的OVT和LF儲備液,置于-20 ℃冰柜中保存,使用前置于37 ℃水浴解凍。將OVT和LF的儲備液用PBS分別稀釋成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、2 mg/mL的OVT和LF工作液。取3 mL濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的OVT和LF溶液于15 mL離心管中;取1 mL濃度分別為0.2、0.5、2 mL的OVT和LF溶液于1.5 mL離心管中。將各離心管置于50～90 ℃水浴中加熱5 min,然后取出立即放于冰水浴中冷卻待測。

1.2.2 紫外吸收特性分析 取熱處理后的OVT和LF工作液(0.5 mg/mL)1 mL,移入石英比色皿(光程10 mm)中。采用UV-1200型紫外分光光度計進(jìn)行掃描,掃描的波長范圍為220～320 nm,掃描速度為100 nm/min。

1.2.3 表面疏水性分析 參考董學(xué)艷等的方法[15],取熱處理后的OVT和LF工作液(濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)3 mL,加入40 μL濃度為8 mmol/L的8-苯胺基-1-萘磺酸鎂鹽(ANS-Mg2+)溶液(用PBS配制)作為熒光探針并于室溫條件下避光放置15 min。采用F-7000型熒光分光光度計,固定380 nm處的激發(fā)波長,在450～500 nm發(fā)射波長范圍內(nèi)(狹縫5 nm)掃描蛋白樣品的熒光強(qiáng)度。相同溫度下,以450～500 nm發(fā)射波長范圍內(nèi)的最大熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),蛋白濃度為橫坐標(biāo)作曲線,曲線斜率S0即為該加熱溫度下蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)。

1.2.4 圓二色性分析 參考董學(xué)艷等的方法[15],取熱處理后的OVT和LF工作液(0.2 mg/mL)0.2 mL,移入光徑為1 mm的石英池中。采用Pistarn-180型圓二色譜儀在波長為190～250 nm間范圍對蛋白樣品進(jìn)行掃描,每點掃描時間為2.5 μs,狹縫寬1 nm,室溫下進(jìn)行,重復(fù)掃描3次取平均值,所得的數(shù)據(jù)用平均摩爾橢圓率=[-]表示,其單位為deg·cm2/dmoL。OVT和LF的二級結(jié)構(gòu)中各組分的相對含量根據(jù)系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行計算。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE) 參考劉建壘等的方法[16],依次在凝膠板中加入7 mL的12 g/100 mL的分離膠和2 mL的5 g/100 mL的濃縮膠,插入15孔的電泳梳子,凝膠厚度為1 mm。取熱處理后的OVT和LF工作液(2 mg/mL)20 μL,與20 μL上樣緩沖液(含2 g/100 mL SDS和2%(v/v)β-ME,40%(v/v)甘油,0.02 g/100 mL溴酚藍(lán)的Tris-HCl緩沖溶液,pH6.8)混勻,沸水加熱5 min。樣品未離心,每個上樣孔內(nèi)加樣量為9 μL。將電壓設(shè)為120 V,當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑跑到距膠底部5 mm時(約1.5 h),停止電泳。輕柔剝離膠片后,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3 h,用脫色液脫色至條帶清晰可見,用相機(jī)拍照,分析。在非還原性SDS-PAGE中的上樣緩沖液中不加β-ME,其他步驟同上。

表1 不同溫度所致OVT和LF的表面疏水性指數(shù)的變化

Table 1 Changes of surface hydrophobic index of OVT and LF at different temperatures

轉(zhuǎn)鐵蛋白表面疏水性指數(shù)255060708090(℃)OVT230±281a268±39a374±28a4800±339b5398±313bc6100±608cLF886±88a891±36a947±171a5587±463b7915±570c10146±277d

注:OVT和LF的濃度分別為0.1～0.5 mg/mL,25 ℃(室溫)表示OVT和LF未經(jīng)熱處理,上標(biāo)小寫字母a～d表示同一行不同均數(shù)間差異顯著(p<0.05)。

1.2.6 溶解度測定 參考劉建壘等的方法[16],取熱處理后的OVT和LF工作液(2 mg/mL)1 mL,經(jīng)6313×g離心10 min后,傾倒出上清液于另一1.5 mL離心管中,去除沉淀。蛋白質(zhì)含量用Bradford方法測定。吸取未離心的蛋白溶液和上清液各100 μL于96孔板中,加入100 μL的DRC染色液,在室溫下充分混勻,靜置5 min,用酶標(biāo)儀在595 nm下進(jìn)行比色測定,用PBS作為空白對照。溶解度計算公式:溶解度(%)=Ps/Pt×100 Ps:離心后的上清液中可溶性蛋白的含量(Soluble protein content,Ps),Pt:原液總蛋白質(zhì)含量(Total protein content,Pt)。

1.2.7 統(tǒng)計分析 所有實驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,實驗數(shù)據(jù)采用Minitab 17.1.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one way analysis of variance,one-way ANOVA),進(jìn)一步用Tukey多重比較確定各組均值間的顯著性差異,顯著水平設(shè)為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度所致OVT和LF的紫外吸收光譜的變化

與未經(jīng)熱處理的相比,OVT的吸光值在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時顯著增大,80～90 ℃時不再進(jìn)一步增大。LF的吸光值在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時顯著增大,80～90 ℃時則進(jìn)一步增大。OVT的最大紫外吸收峰值在70 ℃時出現(xiàn)藍(lán)移(280 nm→274 nm),80～90 ℃時無明顯變化;LF的最大紫外吸收峰值在70～90 ℃時逐漸出現(xiàn)藍(lán)移(280 nm→276 nm)?？傊?經(jīng)較低溫度(50～60 ℃)處理后,OVT和LF的吸光值均無明顯變化,70 ℃時均明顯增大;80～90 ℃時,OVT的不再進(jìn)一步增大,而LF的則進(jìn)一步逐漸增大。

圖1 不同溫度所致OVT和LF的紫外吸收光譜的變化Fig.1 Changes of UV spectra of OVT and LF at different temperatures 注:OVT和LF的濃度為0.5 mg/mL,25 ℃(室溫)表示OVT和LF未經(jīng)熱處理。

蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸殘基在220～320 nm內(nèi)有吸收,且其最大吸收峰在280 nm附近(芳香族氨基酸中苯環(huán)共軛雙鍵的吸收峰)[17]。佟平等報道,OVT經(jīng)70 ℃加熱5 min后,其紫外吸光值也明顯增大,這與本研究的結(jié)果相似[9]。OVT和LF的最大紫外吸光值明顯增大,表明經(jīng)熱處理后,蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)已展開,芳香族氨基酸殘基暴露在蛋白質(zhì)分子表面,增大了對紫外光的吸收[9]。OVT和LF的最大紫外吸收峰值都出現(xiàn)藍(lán)移,說明色氨酸和酪氨酸殘基等所處微環(huán)境的極性發(fā)生了變化[9]。

2.2 不同溫度所致OVT和LF的表面疏水性指數(shù)的變化

與未經(jīng)熱處理的相比,OVT的表面疏水性指數(shù)在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時顯著增大,80～90 ℃時進(jìn)一步顯著增大,90 ℃時增大了25.5倍。LF的表面疏水性指數(shù)在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時也顯著增大,80～90 ℃時進(jìn)一步顯著增大,90 ℃時增大了10.5倍。總之,經(jīng)較低溫度(50～60 ℃)處理后,OVT和LF的表面疏水性指數(shù)均無明顯變化,70 ℃時均顯著增大,80～90 ℃時均進(jìn)一步顯著增大。相同溫度下,LF的表面疏水性指數(shù)遠(yuǎn)大于OVT的,但OVT的增大程度較LF的更大。

表2 不同溫度所致OVT和LF的各二級結(jié)構(gòu)百分率的變化

Table 2 Percentage changes of secondary structures of OVT and LF at different temperatures

轉(zhuǎn)鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)組分的相對含量(%)255060708090(℃)OVT：α-螺旋280028252875140812931252β-折疊209320782049303332023310β-轉(zhuǎn)角171517091648160916171628無規(guī)則卷曲339133883436394238883818LF：α-螺旋238324722453199614081250β-折疊241123582386284334363781β-轉(zhuǎn)角173517331742154514471548無規(guī)則卷曲347134383419362538183912

注:OVT和LF的濃度為0.2 mg/mL,25 ℃(室溫)表示OVT和LF未經(jīng)熱處理。

蛋白質(zhì)表面疏水性的變化能較好地反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化,檢測蛋白質(zhì)表面疏水性最常用的方法是ANS熒光探針法。ANS通過與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域非共價結(jié)合,其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),且其熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)表面暴露的疏水基團(tuán)呈正相關(guān)[18]。劉楓等報道,OVT經(jīng)65 ℃加熱5 min后,其表面疏水性指數(shù)明顯增大[10]。閆旭東等報道,LF經(jīng)60 ℃加熱30 min后,其表面疏水性指數(shù)也明顯增大[14]。他們的研究結(jié)果均與本研究的結(jié)果相似。OVT和LF的表面疏水性指數(shù)都顯著增大,即熱處理破壞了轉(zhuǎn)鐵蛋白氨基酸殘基之間的非共價鍵,導(dǎo)致分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來;并且隨著溫度升高,暴露出的疏水性基團(tuán)也就越多,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)進(jìn)一步增大[10]。

2.3 不同溫度所致OVT和LF的二級結(jié)構(gòu)的變化

與未經(jīng)熱處理的相比,OVT的α-螺旋含量在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時明顯降低,80～90 ℃時進(jìn)一步降低,90 ℃時降低了55.3%;OVT的β-折疊含量在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時明顯升高,80～90 ℃時進(jìn)一步升高,90 ℃時升高了58.1%;OVT的無規(guī)卷曲含量在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時明顯升高,80～90 ℃時無明顯升高,90 ℃時升高了12.6%。LF的α-螺旋含量在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時明顯降低,80～90 ℃時進(jìn)一步降低,90 ℃時降低了47.5%;LF的β-折疊含量在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時明顯升高,80～90 ℃時進(jìn)一步升高,90 ℃時升高了56.8%;LF的無規(guī)則卷曲含量在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時明顯升高,80～90 ℃時進(jìn)一步升高,90 ℃時升高了12.7%?？傊?經(jīng)較低溫度(50～60 ℃)處理后,OVT和LF的二級結(jié)構(gòu)組分的相對含量均無明顯變化。70 ℃時,OVT和LF的α-螺旋含量均明顯降低,β-折疊和無規(guī)卷曲含量均明顯升高;80～90 ℃時,OVT和LF的二級結(jié)構(gòu)組分的相對含量均進(jìn)一步發(fā)生變化,且OVT的變化程度較LF的更大。

經(jīng)較高溫度(70～90 ℃)處理后,OVT和LF分子中α-螺旋含量逐漸降低,可能原因是熱處理導(dǎo)致了蛋白質(zhì)形成絮狀物,α-螺旋逐漸展開,使其含量明顯下降;同時蛋白分子中其它二級結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊和無規(guī)卷曲,使其含量逐漸升高[19]。熱處理導(dǎo)致OVT和LF分子中的α-螺旋含量降低,分子結(jié)構(gòu)的有序性降低,形成了以β-折疊和無規(guī)卷曲為主的二級結(jié)構(gòu),分子結(jié)構(gòu)逐步伸展而變得松散無序[8]。劉猛等報道,LF經(jīng)95 ℃加熱10 min后,其二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量降低,β-折疊含量升高,這與本研究的結(jié)果相似[8]。Kato等發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)與分子中α-螺旋的含量呈負(fù)相關(guān),即蛋白質(zhì)分子中α-螺旋的含量降低,導(dǎo)致疏水區(qū)域的暴露程度增大,從而其表面疏水性指數(shù)也逐漸增大[20]。

2.4 不同溫度所致OVT和LF的SDS-PAGE圖譜變化

OVT主要在66.2～97.4 ku區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)一條傾斜的密度較高的寬大條帶,在較低分子量區(qū)域(43～66.2 ku)還出現(xiàn)了密度較低的拖尾條帶。與未經(jīng)熱處理的相比,OVT主要蛋白條帶的密度在50～60 ℃時無明顯變化;70 ℃時出現(xiàn)明顯降低,相對應(yīng)的條帶有部分聚集在濃縮膠頂端;80～90 ℃時,OVT主要蛋白條帶的密度進(jìn)一步逐漸降低,濃縮膠頂端的條帶密度逐漸增高。LF主要在66.2～97.4 ku區(qū)域內(nèi)有一條密度較高的寬大條帶。LF主要蛋白條帶的密度在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時出現(xiàn)明顯降低,相對應(yīng)的條帶有部分聚集在濃縮膠頂端;80～90 ℃時,LF主要蛋白條帶密度進(jìn)一步逐漸降低,濃縮膠頂端的條帶密度也逐漸增高。總之,經(jīng)較低溫度(50～60 ℃)處理后,OVT和LF的主要蛋白條帶的密度均無明顯變化,70 ℃時均明顯降低,80～90 ℃時均進(jìn)一步逐漸降低;相同溫度下,OVT的降低程度較LF的更大。

圖2 不同溫度所致OVT和LF的SDS-PAGE圖譜的變化Fig.2 Changes of SDS-PAGE patterns of OVT and LF at different temperatures注:OVT和LF的濃度為2 mg/mL,25 ℃(室溫)表示OVT和LF未經(jīng)熱處理。M:低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker;A:-β-ME)(上樣緩沖液中不添加β-ME);B:+β-ME(上樣緩沖液中添加β-ME)。

未經(jīng)熱處理的OVT的主要蛋白條帶出現(xiàn)傾斜,可能是標(biāo)準(zhǔn)蛋白中β-ME對未加β-ME的OVT產(chǎn)生了干擾。OVT在較低分子量區(qū)域出現(xiàn)了拖尾條帶,可能是OVT中混有的低分子量雜蛋白導(dǎo)致條帶拖尾。經(jīng)較高溫度(70～90 ℃)處理后,OVT和LF分子均發(fā)生交聯(lián)和聚集,相對分子質(zhì)量增大,且聚集體不能通過濃縮膠;但在還原性電泳圖譜中,濃縮膠頂端無聚集條帶,是因為加入的β-ME能將產(chǎn)生的交聯(lián)蛋白中的二硫鍵還原。又因為OVT和LF都不含游離的巰基,因此OVT和LF可能通過分子間二硫鍵的互換形成交聯(lián)或聚集[21-22]。在還原性電泳圖譜中,經(jīng)較高溫度(80～90 ℃)處理后,OVT和LF在較高分子量區(qū)域(97.4 ku以上)都出現(xiàn)了新條帶,表明部分OVT和LF分子也形成了不被β-ME破壞的高分子聚合物,這種聚合物可能通過非二硫鍵的共價鍵或以疏水相互作用和靜電相互作用為主的非共價鍵作用形成[21]。

表4 不同溫度所致OVT和LF的溶解度的變化

Table 4 Changes of solubility of OVT and LF at different temperatures

轉(zhuǎn)鐵蛋白溶解度(%)255060708090(℃)OVT980±07a974±09a956±13ab148±07c117±08d102±05dLF976±06a964±05a964±05a220±14b175±02c158±06d

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD),上標(biāo)小寫字母a～d表示同一行不同均數(shù)間差異顯著(p<0.05)。經(jīng)熱處理后,OVT和LF的分子間的二硫鍵發(fā)生重排,埋藏在疏水內(nèi)核中的非極性基團(tuán)暴露出來,促進(jìn)了分子間的相互作用,導(dǎo)致分子間發(fā)生聚集[23-24]。

2.5 不同溫度所致OVT和LF的渾濁度和溶解度的變化

肉眼觀察可見,OVT溶液在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時出現(xiàn)絮狀物但無明顯渾濁,80～90 ℃時絮狀物進(jìn)一步增多。LF溶液在50～60 ℃無明顯變化,70 ℃時出現(xiàn)渾濁但無明顯絮狀物出現(xiàn),80～90 ℃時渾濁度進(jìn)一步增大,同時有少量絮狀物出現(xiàn)?？傊?經(jīng)較低溫度(50～60 ℃)處理后,OVT和LF溶液均無明顯變化;70 ℃時,OVT出現(xiàn)絮狀物,而LF出現(xiàn)渾濁;80～90 ℃時,OVT和LF的渾濁度均明顯增大,絮狀物也明顯增多。隨著熱處理時間的延長(由5 min到10 min),70～90 ℃時,OVT的彌漫性絮狀物增多;LF的渾濁度增大,絮狀物也逐漸增多。

圖3 不同熱處理時間和溫度所致OVT和LF的渾濁度變化Fig.3 Changes of turbidity of OVT and LF at different heating times and heating temperatures注:OVT和LF的濃度為2 mg/mL,25 ℃(室溫)表示OVT和LF未經(jīng)熱處理,加熱結(jié)束后立即取出置于冰水浴中冷卻。

表3 不同熱處理時間和溫度所致OVT和LF溶液的渾濁度的變化

Table 3 Changes of turbidity of OVT and LF at different heating times and heating temperatures

轉(zhuǎn)鐵蛋白渾濁度255060708090(℃)OVT：5min---+?+++??++???10min---+??++???++????LF：5min---+++?+++??10min---+++++??++++???

注:“-”表示用肉眼觀察蛋白溶液呈澄清狀態(tài),“+”表示蛋白溶液的渾濁度,“*”表示蛋白溶液中出現(xiàn)絮狀物的程度。 與未經(jīng)熱處理的相比,OVT的溶解度在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時顯著降低,80 ℃時進(jìn)一步顯著降低,90 ℃時再無顯著降低,90 ℃時降低了89.6%。LF的溶解度在50～60 ℃時無明顯變化,70 ℃時顯著降低,80～90 ℃時進(jìn)一步顯著降低,90 ℃時降低了83.8%?？傊?經(jīng)較低溫度(50～60 ℃)處理后,OVT和LF的溶解度均無明顯變化,70 ℃時均顯著降低,80～90 ℃時均進(jìn)一步逐漸降低;相同溫度下,OVT的降低程度較LF的更大。

3 結(jié)論

經(jīng)較低溫度(50～60 ℃)處理后,OVT和LF的結(jié)構(gòu)(紫外吸光值、表面疏水性指數(shù)、二級結(jié)構(gòu)組分的相對含量、SDS-PAGE圖譜)和功能(溶解度)均無明顯變化。經(jīng)較高溫度(70～90 ℃)處理后,OVT和LF的紫外吸光值和表面疏水性指數(shù)均明顯增大,且其二級結(jié)構(gòu)組分的相對含量均發(fā)生明顯變化;蛋白分子發(fā)生聚集并伴隨溶解度的明顯降低。相同溫度下,OVT的變化程度均較LF的更大?？傊?OVT和LF的結(jié)構(gòu)和功能在加熱時均發(fā)生改變,但OVT的變化程度較LF的更大。本研究結(jié)果對于評價在熱加工中OVT和LF的結(jié)構(gòu)和功能變化提供了一定的理論參考。

[1]Giansanti F,Leboffe L,Pitari G,et al. Physiological roles of ovotransferrin[J]. Biochimica et Biophysica Acta,2012,1820:218-225.

[2]Garcia-Montoya I A,Cendon T S,Arevalo-Gallegos S,et al. Lactoferrin a multiple bioactive protein:an overview[J]. Biochimica et Biophysica Acta,2012,1820:226-236.

[3]Wu J,Acero-Lopez A. Ovotransferrin:structure,bioactivities,and preparation[J]. Food Research International,2012,46:480-487.

[4]Gonzalez-Chavez S A,Arevalo-Gallegos S,Rascon C Q. Lactoferrin:structure,function and applications[J]. International Journal of Antimicrobial Agents,2009,33:301.e1-301.e8.

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB14880-2012食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012.

[6]張艷杰. 乳鐵蛋白的功能特性及其在嬰兒配方奶粉中的應(yīng)用[J]. 中國乳品工業(yè),2005,33(2):33-36.

[7]Corda R,Biddau P,Corrias A,et al. Conalbumin in the treatment of acute enteritis in the infant[J]. International Journal of Tissue Reactions,1983,5(1):117-123.

[8]劉猛,杜明,孔瑩瑩,等. 牛乳乳鐵蛋白的純化及熱處理對其分子特性的影響[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報,2013,31(2):26-30.

[9]佟平,陳紅兵. 雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白線性表位定位及熱加工對其結(jié)構(gòu)與過敏原性的影響[D]. 南昌:南昌大學(xué),2011,12.

[10]劉楓,楊嚴(yán)峻. 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的磁法分離及熱穩(wěn)定性研究[D]. 無錫:江南大學(xué),2015,6.

[11]仉旭,吳子健,呂瑜峰. 雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2015,27:1118-1123.

[12]Marie A P,Ulla S,Kishore A R,et al. Thermal behavior of bovine lactoferrin in water and its relation to bacterial interaction and antibacterial activity[J]. Dairy Science,1993,76:3711-3720.

[13]Celia C,Carmen R G,Eduarodo C,et al. Effect of heat treatment on the antibacterial activity of bovine lactoferrin against three food borne pathogens[J]. International Journal of Dairy Technology,2010,63(2):209-215.

[14]閆旭東,王彩云,云戰(zhàn)友. 乳鐵蛋白熱穩(wěn)定性研究[J]. 中國乳品工業(yè),2014,42(4):18-20.

[15]董學(xué)艷,景浩. 牛血清白蛋白與槲皮素或萊菔硫烷相互作用模式及納米顆粒形成的比較研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2014,4.

[16]劉建壘,景浩. Fenton體系的優(yōu)化及其對酪蛋白的氧化作用[J]. 食品科學(xué),2014,35(13):74-79.

[17]曹書霞,趙玉芬. 分子吸收光譜在生物大分子研究中的應(yīng)用[J]. 光譜學(xué)與光譜學(xué)分析,2004,24(10):1197-1201.

[18]王守業(yè),徐小龍,劉清亮,等. 熒光光譜在蛋白質(zhì)分子構(gòu)象研究中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)進(jìn)展,2001,4:257-260.

[19]Ngarize S,Adams A,Howell N K. Studies on egg albumen and whey protein interactions by FT-Raman spectroscopy and rheology[J]. Food Hydrocolloids,2004,18(1):49-59.

[20]Kato A,Tsutsui N,Matsudomi N,et al. Effects of partial denaturation on surface properties of ovalbumin and lysozyme[J]. Agricultural and Biological Chemistry,1981,45(12):2755-2760.

[21]Matsudomi N,Oka H,Sonoda M. Inhibition against heat coagulation of ovotransferrin by ovalbumin in relation to its molecular structure[J]. Food Research International,2002,35:821-827.

[22]Christ D,Takeuchi P K,Cunha L R. Effect of sucrose addition and heat treatment on egg albumen protein gelation[J]. Journal of Food Science,2005,70(3):230-238.

[23]Van Der Plancken I,Van Loey A,Hendrickx M E. Kinetic study on the combined effect of high pressure and temperature on the physicochemical properties of egg white proteins[J]. Journal of Food Engineering,2007,78:206-216.

[24]Mazurier J,Metz-Boutigue M H,Jolles J,et al. Human lactotransferrin:Molecular,functional and evolutionary comparisons with human serum transferrin and hen ovotransferrin[J]. Experientia,1983,39:135-141.

Comparison of thermal stability of ovotransferrin and lactoferrin

LI Qing,JING Hao*

(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

OVTandLFwereheatedatdifferenttemperaturesof50～90 ℃,andchangesoftheirsecondarystructures,spatialconformation,andsolubilitywereanalyzedbycirculardichroism(CD),UVabsorbance,surfacehydrophobicity,andturbidity/solubilitytests,respectively.ProteinaggregationwasassessedbySDS-PAGE.ResultsshowedthatnochangewasobservedforphysicochemicalpropertiesofOVTandLFat50～60 ℃.SignificantincreaseofUVabsorbancewasobservedforbothLFandOVTat70 ℃;furtherincreasewasobservedforLFbutnotforOVTat80～90 ℃.SignificantincreaseofsurfacehydrophobicityindexwasobservedforLFandOVTat70～90 ℃.ThesurfacehydrophobicityindexofLFwashigherthanthatofOVT,whiletheextentsofincreasewerehigherforOVTthanLF.Decreasedpercentagesofα-helixandincreasedpercentagesofβ-sheetandrandomcoilwereobservedforbothLFandOVTat70～90 ℃,buttheextentsofchangewerehigherforOVTthanLF.ThebanddensitiesandsolubilityofOVTandLFweredecreasedat70～90 ℃,buttheextentsofdecreasewerehigherforOVTthanLFatthesametemperatures.Inconclusion,changeswereobservedofstructuresandfunctionalcharacteristicforOVTandLFafterheatingtreatment,whiletheextentsofchangewerehigherforOVTthanLF.

ovotransferrin;lactoferrin;thermalstability;UVabsorbance;surfacehydrophobicity;solubility

2016-04-08

黎慶(1991-),女,碩士研究生,研究方向:蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析,E-mail:m13011824370@163.com。

*通訊作者:景浩(1957-),男，博士,教授,研究方向:蛋白質(zhì)與小分子的相互作用,E-mail:haojing@cau.edu.cn。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題子課題《蛋制品加工技術(shù)研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化示范》(2012BAD28B08)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)19-0101-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.011