王 芳,曹錦軒,潘道東,孫楊贏,周昌瑜,徐 嬌

(寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211)

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肉桂精油對成團泛菌和腐生葡萄球菌的抑菌活性及其機理

王 芳,曹錦軒*,潘道東,孫楊贏,周昌瑜,徐 嬌

(寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211)

本文利用濾紙片法和二倍稀釋法分別測定了肉桂精油對成團泛菌及腐生葡萄球菌的抑菌圈直徑、最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)來評估肉桂精油對其的抑菌活性,通過掃描電鏡、透射電鏡探究肉桂精油對成團泛菌和腐生葡萄球菌的形態(tài)影響,以及通過測定細胞膜的通透性、細胞膜的完整性和膜電位來共同闡釋肉桂精油對兩種菌活性抑制的機理。結果表明肉桂精油對成團泛菌和腐生葡萄球菌的生長均有較強的抑制作用,且對腐生葡萄球菌的抑菌作用明顯強于成團泛菌的抑制作用;肉桂精油改變細胞的形態(tài)、增加膜的通透性、破壞了膜的完整性、并造成了細胞內容物的泄露、膜電位的降低,從而導致細菌的死亡。

肉桂精油,成團泛菌,腐生葡萄球菌,抑菌效果,抑菌機理

肉桂是樟科植物肉桂的樹皮或者桂皮,樹皮芳香,可作香料使用,主要分布在中國、印度、越南、老撾等地區(qū)[1]。肉桂精油是由桂皮、桂葉、桂枝等提取而得,一般為黃色或琥珀色液體。研究表明,肉桂油具有強烈的抑制或殺死微生物的特性,可以作為天然食品防腐保鮮劑。Oussalah等[2]研究發(fā)現(xiàn)肉桂精油對李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有很強的抑制能力,MIC均小于0.05%。此外,李京晶等[3]將肉桂精油與常見的化學防腐劑作了對比探討,采用體外抑菌實驗,結果顯示肉桂精油的MIC是0.2～1.6 mg/mL,而山梨酸鉀及苯甲酸鈉的MIC為6.4～25.6 mg/mL。李揚蘋等[4]報道了肉桂精油對香莢蘭根腐病尖鐮孢菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長有極強的抑制效果,且抑制率可達99.74%和100%。顧仁勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)肉桂精油可以有效的抑制枯草芽孢桿菌、青霉、酵母、黑曲霉和大腸桿菌的活性,抑菌圈直徑在20.6～49.6 mm之間。上述研究表明,關于肉桂精油的抑菌活性研究主要集中在李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等,而其對成團泛菌和腐生葡萄球菌的抑菌活性研究相對較少,其抑制機理尚未被明確闡述。

生物胺具有潛在的毒性,若人體內生物胺的含量積累到一定程度,就會對機體產生毒害作用,如引起血管膨脹、偏頭痛、高血壓,導致嘔吐、腹痛和腹瀉等[6]。組胺是對人類健康危害最大的生物胺,其次是酪胺。組胺中毒可引起頭暈、皮膚瘙癢、惡心和低血壓[7]。酪胺被認為是一種主要的誘變劑,可誘發(fā)呼吸衰竭、心悸、濕疹、高血壓等疾病的發(fā)生[8]。此外,多胺如腐胺、尸胺、精胺和亞精胺能與亞硝酸鹽發(fā)生作用生成亞硝胺等雜環(huán)類致癌物質從而威脅人們的健康[9]。如何控制產生物胺細菌的生長繁殖,減少食品中生物胺的含量,從而提高食品的品質及安全性顯得尤為重要。

因此,本研究以生鮮豬肉香腸中產生物胺的成團泛菌和腐生葡萄球菌為研究對象,通過測定抑菌圈直徑、最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)來評估肉桂精油對其的抑菌活性,然后通過掃描電鏡、透射電鏡來探究肉桂精油對成團泛菌和腐生葡萄球菌的形態(tài)影響,以及通過測定細胞膜的通透性、細胞膜的完整性和膜電位來共同闡釋肉桂精油對兩種菌活性抑制的機理。本研究為提高食品安全性以及開發(fā)天然的抗菌劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成團泛菌(Pantoeaagglomeransstrain GS 1)及腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticusstrain CIFT MFB 5247(7)) 浙江省動物蛋白精深加工技術重點實驗室分離,生工生物工程技術(上海)股份有限公司鑒定出來的產生物胺菌;100%純度肉桂單方精油,萃取部位(蒸餾樹皮) 上海卓典食品香料有限公司;羅丹明123 上海碧云天生物技術有限公司;吐溫80 國藥集團化學試劑有限公司;LB培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司;其他試劑均為分析純 國藥集團。

H-2050R臺式高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;S-3400N掃描電鏡 Hitachi公司;JEM-1230透射電鏡 日本JEOL公司;YXQ-LS-50A高壓滅菌鍋 西安常儀儀器設備有限公司;Infinite 200酶標儀 瑞士TECAN公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;HSW型智能恒溫恒濕箱 寧波江南儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備方法 甘油保藏的成團泛菌和腐生葡萄球菌在LB液體培養(yǎng)基中活化2～3代后,吸取1 mL菌液接種到盛有100 mL已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中,將含有成團泛菌的LB液體培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中(120 r/min)培養(yǎng)24 h;將含有腐生葡萄球菌的LB液體培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中(120 r/min)培養(yǎng)24 h,然后分別于4 ℃ 8000 r/min離心20 min后,收集菌體,用0.1 mol/L,pH為7.2的磷酸鹽(PBS)緩沖液清洗三次,然后用0.85%無菌生理鹽水洗滌三次后離心,將菌體重新懸浮于0.85%無菌生理鹽水中,用平板菌落記數(shù)的方法制備成107cfu/mL的菌懸液,備用。

1.2.2 抑菌圈(DIZ)的測定 參考Tepe等[10],用濾紙片法來測定抑菌圈的大小。吸取100 μL的菌懸液然后均勻地涂布于有固體LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿表面,無菌鑷子夾取一個直徑為7 mm的已滅菌的圓形濾紙片,置于每個培養(yǎng)基的中央,將10 μL肉桂精油滴加到濾紙片表面,將含有成團泛菌的LB液體培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;將含有腐生葡萄球菌的LB液體培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后用游標卡尺來測定抑菌圈的直徑大小,每種細菌做三個重復。以常用的抗生素(1.35 mg/mL的注射用硫酸鏈霉素溶液)為細菌抑菌實驗的陽性對照。抑菌圈實驗判定標準參考黃曉冬等[11]。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)的測定 參考閆紹悅等[12]的方法略作修改,采用試管雙倍稀釋法,將肉桂精油用1%吐溫80稀釋成16、8、4、2、1、0.5 μL/mL的肉桂精油溶液,然后分別加入事先裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的小試管中,使其最終濃度為8、4、2、1、0.5、0.25 μL/mL。再向各個試管中加50 μL的菌懸液,充分混勻,將含有成團泛菌的LB液體培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;將含有腐生葡萄球菌的LB液體培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)試管中液體的渾濁程度來判定精油的MIC值(液體澄清,無細菌生長),以1%的吐溫80做對照實驗。在MIC值的基礎之上,取50 μL的混合菌懸液涂布于LB固體培養(yǎng)基上,將含有成團泛菌的LB液體培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;將含有腐生葡萄球菌的LB液體培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,無菌落生長的精油濃度即為MBC值。

1.2.4 掃描電鏡觀察肉桂精油對細菌細胞形態(tài)的影響 參考Kumar等[13]的方法略作修改。向已制備好的107cfu/mL的菌懸液中分別加入不同濃度的肉桂精油(0 MIC、1 MIC和1 MBC),充分混勻后,成團泛菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用3 h;腐生葡萄球菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用3 h,8000 r/min離心15 min,棄去上清液,用0.1 mol/L,pH為7.2的PBS緩沖液漂洗三次,每次10 min,依次用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液進行脫水,每次10 min,然后用無水乙醇洗兩次,每次10 min。接著依次用3∶1,1∶1以及1∶3的無水乙醇和叔丁醇的混合溶液來逐級脫水10 min,最后用100%的純叔丁醇來脫水兩次,每次10 min,加少量純叔丁醇來覆蓋樣品,放在4 ℃冰箱里,冷凍干燥,樣品噴金,用掃描電鏡(S-3400N,Hitachi)來觀察。

1.2.5 透射電鏡觀察肉桂精油對細菌細胞形態(tài)的影響 參照Yi,S.M[14]的方法并稍作修改。

固定:向已制備好的107cfu/mL的菌懸液中分別加入不同濃度的肉桂精油(0 MIC、1 MIC和1 MBC),充分混勻后,成團泛菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用3 h;腐生葡萄球菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用3 h,8000 r/min離心15 min,棄掉上清液,然后將沉淀的菌體轉移到1.5 mL的離心管中,再次離心15 min后,將沉淀菌體在3%的戊二醛中固定2 h,用0.1 mol/L,pH7.2的PBS緩沖液漂洗15 min,重復三次,離心棄去上清,再用1%的鋨酸固定2 h,離心棄去上清,用0.1 mol/L,pH7.2的PBS緩沖液漂洗15 min,重復三次。

脫水:依次用30%、50%、70%、90%的乙醇溶液脫水15 min,離心丟棄上清后,用90%的丙酮溶液處理15 min。

浸透:用無水丙酮浸泡15 min,重復三次。然后用1∶1的包埋劑與丙酮的混合液,室溫浸泡l h,再用2∶1的包埋劑與丙酮的混合液,室溫浸透24 h,最后使用純包埋劑處理1 h。

包埋:將樣品放在包埋塊兒的槽子前部,加過包埋劑后,在37 ℃恒溫箱內放24 h。然后取出來包埋塊,于45 ℃恒溫箱里聚合14 h,再轉移到60 ℃恒溫箱里聚合24 h。

表1 肉桂精油對成團泛菌及腐生葡萄球菌的DIZ、MIC和MBC的影響

Table 1 Effects of diameter of inhibition zone(DIZ),minimum inhibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC)of cinnamon essential oil againstPantoeaagglomeransandStaphylococcussaprophyticus

切片:用超薄的切片機割成70 nm的超薄片,銅網撈片之后要自然晾干。

染色:用鉛染液與醋酸鈾枸緣酸來雙染色。

電鏡觀察:用日本的JEM-1230透射電鏡來觀察并挑選典型的樣品拍片。

1.2.6 細菌細胞膜通透率的測定 參考Kong 等[15]的方法略作修改,將已制備好的107cfu/mL的菌懸液在5000 r/min離心15 min,棄去上清液,然后用5%的葡萄糖(C6H12O6)溶液來清洗菌懸液,使得菌懸液的相對電導率幾乎和5%的C6H12O6一樣為止,此時的菌懸液為等滲菌液。接著向5%的C6H12O6里加肉桂精油(0 MIC、1 MIC和1 MBC),充分混勻后,立即測其相對電導率,記為L1;成團泛菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用4 h;腐生葡萄球菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用4 h,每2 h取出來測其相對電導率,記作L2。最后將在5%的C6H12O6中懸浮的菌液在沸水浴中加熱5 min后冷卻,測其相對電導率記作L0。相對電導率計算公式如下:

相對電導率(%)=100×(L2-L1)/L0

1.2.7 細菌細胞膜完整性的影響 參考Du等[16]的方法,將制備好的菌懸液在5000 r/min下離心10 min,棄上清液,菌體用0.1 mol/L,pH為7.2的PBS緩沖液沖洗3次后重新懸浮于此磷酸鹽緩沖液中,加入不同濃度的肉桂精油(0 MIC、1 MIC和1 MBC),成團泛菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用4 h;腐生葡萄球菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用4 h后,8000 r/min離心5 min,取上清液于石英酶標板中,在波長260 nm處測定其吸光度[17]。蛋白質含量及還原糖含量的測定參考Xu 等[18]的方法進行。

1.2.8 細菌膜電位的測定 參考Novo等[19]的實驗方法并稍作修改,在備好的107cfu/mL的菌懸液中分別加入不同濃度的肉桂精油(0 MIC、1 MIC和1 MBC),150 r/min振搖3 h后5000 r/min離心10 min棄上清液,菌體用0.1 mol/L,pH7.2的PBS緩沖液沖洗3次。用乙醇將羅丹明123粉末配成濃度為1 mg/mL的母液,分別加到菌懸液中,使其最終濃度為5 μg/mL,避光孵育45 min后,10000 r/min離心5 min,用0.1 mol/L,pH7.2的PBS緩沖液沖洗兩次后重新懸浮,然后用流式細胞儀通過激光通道FL1進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行差異性分析(p<0.05),并用Origin 8.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 抑菌圈直徑、MIC和MBC

肉桂精油對成團泛菌和腐生葡萄球菌的抑菌圈直徑大小、最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定結果見表1。由表可知,肉桂精油作用于成團泛菌和腐生葡萄球菌的抑菌圈直徑大小分別為20.78 mm以及28.16 mm,MIC均為0.5 μL/mL,MBC分別為2 μL/mL和1 μL/mL。

抑菌圈大小、MIC和MBC是評價精油抑菌效果的常用指標[20]。Zhang等[20]報道了肉桂精油對常見的食品腐敗菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有很好的抑菌效果,抑菌圈直徑分別為19.2 mm和28.7 mm,MIC均為1.0 mg/mL,MBC分別為4.0 mg/mL和2.0 mg/mL。肉桂醛是肉桂精油的主要成分[21],Prabuseenivasan等[22]研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛有抑菌、防腐及抗氧化的特性。本研究結果顯示,肉桂精油對成團泛菌和腐生葡萄球菌都有很強的抑菌作用,很可能是肉桂精油中的肉桂醛抑制了這兩種菌的活性;本研究還發(fā)現(xiàn)肉桂精油對腐生葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)的抑菌效果明顯好于成團泛菌(革蘭氏陰性菌),這與Bagamboula等[23]的結果類似,這可能是由于革蘭氏陰性細菌存在的高脂多糖含量的雙層膜結構,革蘭氏陽性菌的單層膜結構使得肉桂精油更容易侵入。

2.2 掃描電鏡觀察肉桂精油對細菌壁膜的影響

肉桂精油對細菌壁膜影響的掃描電鏡結果如圖1所示,由圖1A可知,未經肉桂精油處理的成團泛菌(A1)呈現(xiàn)典型的短桿狀,菌體表面平整光滑,形態(tài)完好。添加1 MIC肉桂精油處理3 h后(A2),一部分細胞形態(tài)遭到破壞,菌體發(fā)生了扭曲變形,部分菌體的表面出現(xiàn)了明顯的凹陷褶皺或孔洞。添加1 MBC肉桂精油作用3 h后(A3),菌體細胞壁膜的破壞程度更嚴重,出現(xiàn)明顯凹陷褶皺或孔洞的菌體數(shù)量明顯增多。由圖1B可知,無肉桂精油添加的腐生葡萄球菌(B1)細胞表面光滑、平整,外觀呈飽滿的圓球狀,菌體形態(tài)完好,折光性好。添加1 MIC肉桂精油處理3 h(B2)后,菌體表面不平整,形態(tài)也遭到了破損,添加1 MBC肉桂精油作用3 h后(B3),菌體的形態(tài)破損更加嚴重。由此可知,肉桂精油對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的細胞都有破壞作用。掃描電鏡圖可以從形態(tài)學方面來表明肉桂精油的抑菌機制。

圖1 成團泛菌(A1、A2、A3)和腐生葡萄球菌(B1、B2、B3)的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microphotographs of Pantoea agglomerans(A1、A2、A3) and Staphylococcus saprophyticus(B1、B2、B3)注:A1、B1:對照組;A2、B2:1 MIC肉桂精油處理3 h;A3、B3:1 MBC肉桂精油處理3 h，圖2同。

2.3 透射電鏡觀察肉桂精油對細菌壁膜的影響

肉桂精油對細菌壁膜影響的透射電鏡結果如圖2所示,由圖可知,未經肉桂精油處理的成團泛菌(A1)細胞形態(tài)完好,細胞膜完整,細胞壁結構緊密,細胞質均勻。添加1 MIC肉桂精油處理3 h后(A2),細胞質分布開始出現(xiàn)不均勻,細胞壁和細胞膜破損,細胞內出現(xiàn)低密度空白區(qū)。繼續(xù)加大肉桂精油濃度為1 MBC作用3 h后(A3),菌體細胞壁膜的破損非常嚴重,細胞內出現(xiàn)大面積的低密度空白區(qū)。無肉桂精油添加的對照組(B1)腐生葡萄球菌的細胞質均勻,細胞壁結構緊密,細胞膜完整,清晰可見。添加1 MIC肉桂精油處理3 h后(B2),菌體表面出現(xiàn)了皺縮,細胞內物質分布不均勻,出現(xiàn)了低電子密度區(qū),當1 MBC精油濃度作用3 h后(B3),細胞壁與細胞膜開始出現(xiàn)模糊不清,細胞內有大面積的低電子密度空白區(qū)。結果表明,肉桂精油對細菌有很強的破壞作用,且作用效果與精油的濃度有關,這與掃描電鏡的變化相呼應。

圖2 成團泛菌(A1、A2、A3)和腐生葡萄球菌(B1、B2、B3)的透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron microphotographs of Pantoea agglomerans(A1、A2、A3) and Staphylococcus saprophyticus(B1、B2、B3)

2.4 肉桂精油對細菌細胞膜通透性的影響

肉桂精油對細菌細胞膜通透性的影響結果如圖3所示。隨著肉桂精油濃度的增大,成團泛菌和腐生葡萄球菌菌懸液的相對電導率顯著增加(p<0.05);隨著肉桂精油作用時間的延長,成團泛菌和腐生葡萄球菌菌懸液的相對電導率顯著增加(p<0.05)。由圖3A可知,從0～4 h,未經肉桂精油處理(Control)的成團泛菌菌懸液的相對電導率由0.2%增加至4.77%,其增加幅度較小。而分別加入1 MIC、1 MBC濃度的精油后,成團泛菌和腐生葡萄球菌菌懸液的相對電導率分別增加至41.2%和56.63%。由圖3B可知,當分別加入1 MIC、1 MBC濃度的精油后,成團泛菌和腐生葡萄球菌菌懸液的相對電導率分別增加至65.67%和75.66%。

Diao等[24]研究指出正常的細菌結構選擇性透過H+、K+、Na+等小分子物質,此作用使得細菌生存于穩(wěn)定的H+、K+、Na+等離子濃度環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn),成團泛菌和腐生葡萄球菌菌懸液的相對電導率隨著肉桂精油濃度的增大而增加,這與Zhang等[20]研究結果類似。這種現(xiàn)象很可能是肉桂精油作用于細胞膜,使得電解質大量泄漏影響細菌的正常代謝,最終導致細菌死亡。

圖3 肉桂精油對成團泛菌(A)及腐生葡萄球菌(B)細胞膜通透性的影響Fig.3 Effects of cinnamon essential oil on the permeability of cell membrane of Pantoea agglomerans(A) and Staphylococcus saprophyticus(B)注:大寫字母代表不同處理組之間的差異性,字母不同表示差異顯著(p<0.05);小寫字母代表不同時間點之間的差異性,字母不同表示差異顯著(p<0.05)，圖4同。

2.5 肉桂精油對細菌膜完整性的影響

表2 肉桂精油對成團泛菌及腐生葡萄球菌的內容物釋放的影響Table 2 Effects of cinnamon essential oil on cell constituents’ release of tested Pantoea agglomerans and Staphylococcus saprophyticus

注:同一列的字母不同代表差異顯著(p<0.05)。不同濃度的肉桂精油對成團泛菌及腐生葡萄球菌的細胞膜完整性的影響結果見表2。由表可知,隨著精油濃度的增大,成團泛菌及腐生葡萄球菌菌液的OD260 nm、蛋白質和還原糖的含量顯著增加(p<0.05)。與對照組相比,當添加1 MIC肉桂精油時,成團泛菌菌液中的OD260 nm、蛋白質和還原糖分別增加至6.30、4.31和3.61倍;而當肉桂精油濃度為1 MBC時,成團泛菌菌液中的OD260 nm、蛋白質和還原糖分別增加至14.62、9.75和5.12倍。與成團泛菌類似,未經肉桂精油處理(Control)的腐生葡萄球菌,OD260 nm吸光度值較低,蛋白質以及還原糖的含量也不高,當添加1 MIC肉桂精油時,腐生葡萄球菌菌懸液中的OD260 nm、蛋白質和還原糖分別增加至7.68、4.23和4.04倍,然而當添加1 MBC肉桂精油后,腐生葡萄球菌菌懸液中的OD260 nm、蛋白質和還原糖分別增加至14.08、6.76和5.24倍。

細胞內蛋白質的含量和OD260 nm吸光度值可以反映細胞內容物的泄露情況,進而推測細菌細胞膜的完整性[25]。細菌細胞內的大分子物質包括蛋白質和核酸,它們是細胞的重要結構組分。本研究結果顯示,肉桂精油破壞了成團泛菌和腐生葡萄球菌的細胞膜完整性,可能是由于肉桂精油造成了細胞膜的不可逆損傷,引起細胞內蛋白質、核酸及還原糖物質的釋放,進而可致細胞死亡,這與Diao等[24]的研究一致。

2.6 肉桂精油對細菌膜電位的影響

圖4 肉桂精油對成團泛菌及腐生葡萄球菌膜電位的影響Fig.4 Effects of cinnamon essential oil on the membrane potential of Pantoea agglomerans and Staphylococcus saprophyticus

從圖4可知,隨著肉桂精油濃度的增大,成團泛菌和腐生葡萄球菌的平均熒光強度顯著降低(p<0.05);腐生葡萄球菌的平均熒光強度顯著低于成團泛菌的平均熒光強度(p<0.05)。其中,未經肉桂精油處理(Control)的成團泛菌和腐生葡萄球菌的平均熒光強度分別為34.15 AU和19.44 AU。當添加1 MIC肉桂精油時,成團泛菌和腐生葡萄球菌的菌懸液的平均熒光強度分別下降了55.64%和56.12%,而當肉桂精油濃度為1 MBC時,成團泛菌和腐生葡萄球菌的平均熒光強度分別下降了91.41%和86.38%。

膜電位指的是生物膜內外的電勢差,它作為一個質子動力元件,可參與ATP的形成[26]。膜電位在細菌的生理活動中發(fā)揮著重要的作用[27],例如細菌膜電位的改變可以引起細胞代謝活動的變化。本研究結果顯示,添加肉桂精油可以顯著降低成團泛菌和腐生葡萄球的平均熒光強度,這與張赟彬等[28]的發(fā)現(xiàn)相符,平均熒光強度的降低表明細胞膜產生去極化,干擾了細菌的正常代謝,從而使細菌死亡。

3 結論

本研究顯示肉桂精油對成團泛菌和腐生葡萄球菌均有明顯的抑菌作用,且抑菌效果:腐生葡萄球菌>成團泛菌;肉桂精油改變了成團泛菌和腐生葡萄球菌的細菌細胞形態(tài),破壞了細胞壁和細胞膜的完整性,增加了細胞膜的通透性,使得細胞膜電位降低,導致細胞內小分子物質如蛋白質、核酸和還原糖發(fā)生了泄漏,影響了細菌的正常代謝活動,導致其死亡。本研究為開發(fā)天然、高效的成團泛菌和腐生葡萄球菌的抑制劑,提高食品安全性提供了理論依據(jù)。

[1]Wang R,Wang R,Yang B. Extraction of essential oils from five cinnamon leaves and identification of their volatile compound compositions[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2009,10(2):289-292.

[2]Oussalah M,Caillet S,Saucier L,et al. Inhibitory effects of selected plant essential oils on the growth of four pathogenic bacteria:E. coli O157∶H7,Salmonella typhimurium,Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes[J]. Food control,2007,18(5):414-420.

[3]李京晶,籍保平,周峰,等. 丁香和肉桂揮發(fā)油的提取,主要成分測定及其抗菌活性研究[J]. 食品科學,2006,27(8):64-68.

[4]李揚蘋,何霞紅,朱有勇,等. 7 種精油對香莢蘭根腐病尖鐮孢菌抑菌作用的初步研究[J]. 西北農林科技大學學報:自然科學版,2004,32(10):89-93.

[5]顧仁勇,傅偉昌,李佑稷,等. 肉桂精油抑菌及抗氧化作用的研究[J]. 食品研究與開發(fā),2008,29(10):29-32.

[6]González-Fernández C,Santos E M,Jaime I,et al. Influence of starter cultures and sugar concentrations on biogenic amine contents in chorizo dry sausage[J]. Food Microbiology,2003,20(3):275-284.

[7]Bodmer S,Imark C,Kneubühl M. Biogenic amines in foods:histamine and food processing[J]. Inflammation research,1999,48(6):296-300.

[8]Joosten H. The biogenic amine contents of Dutch cheese and their toxicological significance[J]. Netherlands Milk and Dairy Journal(Netherlands),1988,42(1):,25-42.

[9]Scanlan R A. Formation and occurrence of nitrosamines in food[J]. Cancer research,1983,(43)2435-2440.

[10]Tepe B,Daferera D,Sokmen A,et al. Antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and various extracts of Salvia tomentosa Miller(Lamiaceae). Food chemistry,(2005),90(3),333-340.

[11]黃曉冬,黃曉昆,張嫻,等.天竺桂葉精油的含量動態(tài),化學成分及體外抗菌活性[J]. 中國農學通報,(2010),26(4),182-188.

[12]閆紹悅,林樹乾,傅劍,等.五味子提取液抑菌活性研究[J]. 中國實驗方劑學雜志,2014,20(10):142-146.

[13]Kumar P P N V,Shameem U,Kollu P,et al. Green Synthesis of Copper Oxide Nanoparticles Using Aloe vera Leaf Extract and Its Antibacterial Activity Against Fish Bacterial Pathogens[J]. BioNanoScience,2015,5(3):135-139.

[14]Yi S,Zhu J,Fu L,et al. Tea polyphenols inhibit Pseudomonas aeruginosa through damage to the cell membrane[J]. International Journal of Food Microbiology,2010,144(1):111-117.

[15]Kong M,Chen X G,Liu C S,et al. Antibacterial mechanism of chitosan microspheres in a solid dispersing system against E. coli[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2008,65(2):197-202.

[16]Du W,Sun C,Liang Z,et al. Antibacterial activity of hypocrellin A against Staphylococcus aureus[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,28(11):3151-3157.

[17]Aronsson K,R?nner U,Borch E. Inactivation of Escherichia coli,Listeria innocua and Saccharomyces cerevisiae in relation to membrane permeabilization and subsequent leakage of intracellular compounds due to pulsed electric field processing[J]. International Journal of Food Microbiology,2005,99(1):19-32.

[18]Xu J,Hu Q,Wang X,et al. Changes in the main nutrients,phytochemicals,and antioxidant activity in yellow corn grain during maturation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(9):5751-5756.

[19]Novo D,Perlmutter N G,Hunt R H,et al. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique[J]. Cytometry,1999,35(1):55-63.

[20]Zhang Y,Liu X,Wang Y,et al. Antibacterial activity and mechanism of cinnamon essential oil against Escherichia coli and Staphylococcus aureus[J]. Food Control,2016,(59):282-289.

[21]Mallavarapu G R,Ramesh S,Chandrasekhara R S,et al. Investigation of the essential oil of cinnamon leaf grown at Bangalore and Hyderabad[J]. Flavour and Fragrance Journal,1995,10(4):239-242.

[22]Prabuseenivasan S,Jayakumar M,Ignacimuthu S.Invitroantibacterial activity of some plant essential oils[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine,2006,6(1):1-8.

[23]Bagamboula C,Uyttendaele M,Debevere J. Inhibitory effect of thyme and basil essential oils,carvacrol,thymol,estragol,linalool and p-cymene towards Shigella sonnei and S. flexneri[J]. Food Microbiology,2004,21(1),33-42.

[24]Diao W R,Hu Q P,Zhang H,et al. Chemical composition,antibacterial activity and mechanism of action of essential oil from seeds of fennel(FoeniculumvulgareMill.)[J]. Food Control,2014,35(1):109-116.

[25]Bajpai V K,Sharma A,Baek K H. Antibacterial mode of action of Cudrania tricuspidata fruit essential oil,affecting membrane permeability and surface characteristics of food-borne pathogens[J]. Food Control,2013,32(2):582-590.

[26]Dimroth P,Kaim G,Matthey U. Crucial role of the membrane potential for ATP synthesis by F1F0 ATP synthases[J]. The Journal of Experimental Biology,2000(1),203,51-59.

[27]Borges,A.,Ferreira,C.,Saavedra,M. J.,& Simoes,M. Antibacterial activity and mode of action of ferulic and gallic acids against pathogenic bacteria[J]. Microbial Drug Resistance,2013,19(4),256-265.

[28]張赟彬,劉笑宇,姜萍萍,等. 肉桂醛對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用及抑菌機理研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2015,31(5):31-35.

Bacteriostatic activity and mechanism of cinnamon essential oil againstPantoeaagglomeransandStaphylococcussaprophyticus

WANG Fang,CAO Jin-xuan*,PAN Dao-dong,SUN Yang-ying,ZHOU Chang-yu,XU Jiao

(Ocean University,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Bacteriostaticactivitywasevaluatedbymeansoftheinhibitionzonediameterswithfilterpaperandminimuminhibitoryconcentration(MIC)andminimumbactericidalconcentration(MBC)bythedoubledilutionmethod.Inaddition,theantibacterialmechanismaccordingtoscanningelectronmicroscopy,transmissionelectronmicroscopy,cellmembranepermeabilityandintegrityandmembranepotentialwerediscussed.Resultsindicatedthatcinnamonessentialoilexhibitedsignificantinhibitionoftwotestedstrains,andStaphylococcus saprophyticuswasmoreeffectivethanPantoea agglomerans.Furthermore,cinnamonessentialoilcouldcauseseveredamagetocellmicrostructure,cellwallandcellmembrane,enhancingthemembranepermeability,leadingtotheleakageofcellularmaterials,resultinginbacterialdeath.

cinnamonessentialoil;Pantoea agglomevans;Staphylococcus saprophyticus;bacteriostaticactivity;antibacterialmechanism

2016-03-01

王芳(1989-)，女，碩士研究生，主要從事畜產品加工與質量控制研究，E-mail：15728046548@163.com。

*通訊作者:曹錦軒(1982-)，男，博士，副研究員，主要從事畜產品加工與質量控制研究，E-mail：caojinxuan@nbu.edu.cn。

寧波市創(chuàng)新團隊(2012B82017);國家農業(yè)科技成果轉化資金項目(2013GB2C200191);國家自然科學基金資助項目(31471681)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)19-0075-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.006