筱 禾 編譯（上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032）

農(nóng)產(chǎn)品中多種農(nóng)藥殘留系統(tǒng)檢測方法的開發(fā)和推廣

筱 禾 編譯
（上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032）

隨著物流的發(fā)展，日本可以從世界各地進口各種食品。同時，根據(jù)《食品衛(wèi)生法》（1947年第233號法案）規(guī)定的農(nóng)藥最大殘留限量（MRLs），自2001年起冷凍蔬菜等進口食品中農(nóng)殘超標案例逐年增加。此外，2002年以來披露，諸如敵菌丹（captafol）和三環(huán)錫（cyhexatin）等日本國內(nèi)未登記農(nóng)藥的進口和使用，按照《農(nóng)用化學品管制法》（1948年第82號法案）該2個品種登記已過期。然而，對消費者來說，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留是關(guān)系食品安全的重中之重。為了禁止因濫用農(nóng)藥而造成的流通領(lǐng)域食品中農(nóng)藥殘留超標，日本厚生勞動?。∕HLW）于2006年5月29日根據(jù)《食品衛(wèi)生法》中的農(nóng)業(yè)化學品、飼料添加劑和獸藥（下文只討論農(nóng)用化學品）殘留物質(zhì)的相關(guān)規(guī)定，推出了“肯定列表制度”（Positive List System）。約有800種物質(zhì)以臨時限量（provisional MRLs）的形式設(shè)置了MRLs，不具有MRLs的農(nóng)用化學品則設(shè)置了統(tǒng)一限量（uniform limit）0.01 mg/L。

為了順應“肯定列表制度”的要求，除了基于連接電子捕獲檢測器（ECD）、火焰光度檢測器（FPD）和氮磷檢測器（NPD）的氣相色譜（GC）以及連接紫外檢測器（UV）和熒光檢測器（FLD）的高效液相色譜（HPLC）的單一和多殘留檢測方法，有必要建立農(nóng)藥多定量殘留分析檢測方法。一些食品安全事故的出現(xiàn)也拉響了食品安全警報，不僅僅是食品腐爛問題，還有來自農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、漁業(yè)產(chǎn)品的加工食品中意想不到的農(nóng)藥殘留。因此，建立可快速鑒定且對各種食品中常用農(nóng)藥殘留半定量分析的綜合系統(tǒng)同樣是必要的。

Eiji Ueno通過采用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法（MS/MS）結(jié)合各種樣品中多種農(nóng)藥殘留物質(zhì)的有效提取方法、無農(nóng)藥損耗消除基質(zhì)的有效凈化方法以及可靠的多元分離和檢測方法建立了一個系統(tǒng)化方法，在選定目標農(nóng)藥后對日本愛知縣農(nóng)藥殘留監(jiān)測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以確定地檢測并準確地量化農(nóng)產(chǎn)品和加工食品中組成成分復雜的多種農(nóng)藥殘留物。

Eiji Ueno概述了用于農(nóng)產(chǎn)品和加工食品中多種農(nóng)藥殘留檢測的系統(tǒng)方法，重點介紹了符合日本厚生勞動省要求、可用于甲胺磷等農(nóng)藥的新型多殘留定量檢測方法和一個不使用農(nóng)藥標準品的GC-MS（/MS）綜合色譜檢測系統(tǒng)的開發(fā)。

1 多殘留分析方法概述

1.1 目標農(nóng)藥選定

已經(jīng)建立了可進行大批量各種農(nóng)產(chǎn)品中多種農(nóng)藥殘留的定量連續(xù)分析的系統(tǒng)方法。首先，每個統(tǒng)計年選定約200種目標農(nóng)藥進行成本效益監(jiān)管監(jiān)控。這些農(nóng)藥是日本或鄰國作物保護中普遍采用的品種，和/或在過去5個統(tǒng)計年（如2001年3月至2006 年4月）在愛知縣農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)控中經(jīng)常被檢出的品種（占總調(diào)查結(jié)果98%以上）。因此，如果能夠同時分析近200種目標農(nóng)藥，即可認為是覆蓋了大部分的農(nóng)藥殘留。

1.2 多殘留系統(tǒng)分析方法的建立

選定目標農(nóng)藥之后，繼續(xù)進行可避免誤報、漏報及定量不準確問題的系統(tǒng)方法的開發(fā)。如圖1所示，裝有被連接到2個進樣口的2類毛細管柱（5%苯基-甲基系列RXI-5Sil MS和三氟甲基系列的Rtx-200 MS）的電子電離（EI）-多反應監(jiān)測模式（MRM）雙柱GC-MS/MS同時配置離子源（圖2），應用2類具有不同分離特性的核-殼色譜柱［十七烷基（C27）系列CAPCELL CORE AQ和五氟苯基系列（PFP）CAPCELL CORE PFP］的正/負離子切換電噴霧電離（ESI）-可編程MRM模式LC-MS/MS，被作為第一優(yōu)先。圖3為電噴霧電離-多反應監(jiān)測掃描（ESI-MRM）模式LC-MS/MS分析農(nóng)藥殘留示例。葡萄柚是柚和橙自然雜交產(chǎn)生，所以必須注意，LC條件時柚的測試溶液的色譜圖中抑霉唑質(zhì)子化分子產(chǎn)生的整體產(chǎn)物離子出現(xiàn)類似干擾峰。除了MS/MS系統(tǒng)，GC-MS EI-SIM/全掃描模式、GC-MS負化學電離（NCI）-SIM/全掃描模式、雙柱GC ECD/ECD，雙柱GC-FPD/NPD、配置二極管陣列檢測器（DAD）的LC-MS ESI-SIM/全掃描模式和用于N-甲基氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析的HPLC柱后FLD也適用。因此，建立了應用多元分離和檢測系統(tǒng)的系統(tǒng)化方法。

圖1 多元分離和檢測系統(tǒng)

圖2 雙柱氣相色譜-質(zhì)譜［GC-MS（/MS）］系統(tǒng)（Agilent 7000三重四級桿GC-MS）

該系統(tǒng)化方法的有效應用，改善了費時的問題，減少了GC毛細管柱更換等故障維護的幾率，克服了目標農(nóng)藥電離的抑制或促進作用，進而盡可能地減少色譜圖中出現(xiàn)干擾峰，被認為是樣品純化和稀釋必不可少的。因此，在官方多殘留檢測方法的基礎(chǔ)上，Eiji Ueno參與了方法制訂，進行了更為高效的提取和凈化方法的開發(fā)。

為了提取溶解度和穩(wěn)定性范圍廣泛的多種農(nóng)藥，必須使用親水和非質(zhì)子有機溶劑。與丙酮等相比，乙腈提取脂質(zhì)的提取率較低，雖然低極性農(nóng)藥的溶解度略低，但已證實許多農(nóng)藥以試樣量（如20 g）3倍量以上的乙腈（60 mL）制備勻漿即可確保足夠的提取率。此外，樣品萃取液通過鹽析分離為乙腈層與水層。利用乙腈的特性，開發(fā)了簡易的乙腈提取方法，此法使用具刻度筒形分液漏斗的吸濾系統(tǒng)，在中性或弱酸性條件下采用鹽析，可精確地收集乙腈層的等分試樣（圖4）。

隨后，為了防止固相萃?。⊿PE）柱穿透，并充分顯示凝膠滲透色譜（GPC）柱的性能，使鹽、糖和氨基酸等許多強極性雜質(zhì)隨水脫除，超聲波脫水之后和用乙酸乙酯和無水硫酸鈉再溶解法預凈化，開發(fā)了結(jié)合GPC和微型柱SPE的自動凈化系統(tǒng)。利用GPC去除脂質(zhì)等大分子雜質(zhì)。但含有葉綠素、類胡蘿卜素及高級脂肪酸的餾分和含農(nóng)藥殘留的餾分間的區(qū)分并不清晰。以GPC洗脫上述雜質(zhì)的早期農(nóng)藥餾分經(jīng)石墨碳-PSA（乙二胺-N-丙基甲硅烷基硅膠）-雙層微型柱等SPE微型柱被選擇性通過，此法能夠有效去除這些雜質(zhì)而不造成農(nóng)藥損失（圖5）。此外，盡可能配置一個高靈敏度且穩(wěn)定的設(shè)備建立色譜檢測系統(tǒng)，作為測定一定稀釋限度內(nèi)的測試溶液的方法。

2 甲胺磷等農(nóng)藥多殘留新穎分析方法

2.1 傳統(tǒng)農(nóng)藥多殘留分析方法存在的問題

日本厚生勞動省關(guān)注了利用GC-MS和LC-MS（/MS）進行農(nóng)產(chǎn)品多殘留分析的方法。該法總結(jié)如下：⑴ 用乙腈從樣品中提取農(nóng)藥；⑵ 中性條件下鹽析后，將提取物用無水硫酸鈉脫水；⑶ 水果和蔬菜的提取物用石墨化碳（graphitized carbon）-氨基（氨基丙基甲硅烷基硅膠）2-層微型柱SPE凈化；谷物、豆類、堅果和種子的提取物先用C18（十八烷基甲硅烷硅膠）微型柱SPE凈化，隨后用石墨化碳-氨基雙層微型柱SPE凈化；⑷ 用GC/MS或LC-MS（/MS）進行測定和確定。然而，不同農(nóng)藥的物理化學行為不同，某些農(nóng)藥在分析過程中必然有一部分隨基質(zhì)流失。例如，甲胺磷是一種水溶性農(nóng)藥［在水中的溶解度大于200 g/L，KOWlog P=-0.8 （20 ℃）］。在鹽析步驟中，極性強的農(nóng)藥傾向于進入水層，在凈化步驟中吸附于石墨化碳-氨基吸附劑上，由于GC的基質(zhì)效應峰強度出現(xiàn)極值，之后這些峰趨于拖尾。另外，甲胺磷與常用C18LC柱的親合力低，LC-MS（/MS）對其的靈敏度相對較低，基質(zhì)并存時經(jīng)常發(fā)現(xiàn)抑制或促進電離。因此，表明了定量性表述的一些問題。應當指出的是，在測定方法建立過程中，脂肪不溶解于乙腈，不能在動物和水產(chǎn)品脂肪組織之間進行有效分配，故而存在不能從樣品中充分提取農(nóng)藥的可能性。從原理上來看，應以脂溶性的正己烷和丙酮等作為萃取劑。

圖3 LC-MS/MS電噴霧電離-多反應監(jiān)測掃描（ESI-MRM）模式檢測農(nóng)藥殘留示例

圖4 使用筒形分液漏斗的吸濾系統(tǒng)

另一方面，動物和水產(chǎn)品農(nóng)藥多殘留測定方法總結(jié)如下：⑴ 除牛奶、蛋類和蜂蜜等液體樣品外，以丙酮-正己烷（1︰2）提取樣品中的農(nóng)藥；⑵ 提取物用無水硫酸鈉脫水后，GPC和PSA微型柱SPE凈化；⑶ 用GC/MS或LC-MS（/MS）進行測定和確定。丙酮-正己烷（1︰2）對動物和水產(chǎn)品脂肪組織具有很強的溶解性。然而，本提取方法，棄去通過離心分離的水層，收集所得的有機層（主要是正己烷），適用于弱極性農(nóng)藥（KOWlog P＞1，如樂果）。由此表明，這個日本法定多殘留分析方法并不適用于瘦肉等固體樣品中的強極性農(nóng)藥。因此，應厚生勞動省的要求，Eiji Ueno等著手開發(fā)一種可精確地測定各種食品中眾多農(nóng)藥的新型多殘留分析方法。

2.2 新型農(nóng)藥多殘留分析方法的建立

如上所述，一般認為乙腈無法充分提取脂肪類食品中的某些農(nóng)藥殘留。因此，在動物和漁業(yè)產(chǎn)品法定多殘留檢測方法的基礎(chǔ)上開發(fā)了一個可靠的多殘留檢測方法。為了穩(wěn)定有效地提取包括水溶性農(nóng)藥在內(nèi)的許多農(nóng)藥（KOWlog P＞1，如樂果），如圖6所示，將樣品用乙酸水溶液制備勻漿，以丙酮-正己烷（2︰3）提取，于弱酸性條件下熔化脂肪組織，然后離心。將包括水層的上清液合并過濾，濃縮合并濾液后，將NaCl飽和殘留物水溶液上樣于大孔硅藻土柱，用乙酸乙酯洗脫。共同提取物（co-extractives）經(jīng)GPC自動凈化（圖7），然后再過SAX/PSA雙層微型柱SPE。將凈化后的樣品提取物進行GC-MS（/MS）和LC-MS/MS分析。

圖5 GPC（GL Sciences G-Prep GPC 8100）后的石墨化碳/PSA二層疊式SPE凈化系統(tǒng)

糖（KOWlog P=?5～?2）和氨基酸（KOWlog P=?5～?1，取決于pH值）等大多數(shù)水溶性雜質(zhì)可過裝有大孔硅藻土柱的液-液分配色譜柱，用水有效洗脫。磷脂和甘油等大多數(shù)脂質(zhì)可過填充苯乙烯二乙烯基苯共聚物柱（12 mm i.d. ×16 μm）GPC（圖7）有效洗脫，還縮短了制備時間，溶劑的用量也顯著減少。試驗證明受有機酸等雜質(zhì)的影響，部分脂肪酸過PSA微型柱會被洗脫，故該法采用填充強陰離子交換系列SAX（三甲丙基甲硅烷基硅膠）和PSA的雙層微型柱。在新型多殘留檢測方法開發(fā)過程中，不易堵塞的大孔硅藻土柱（GL Sciences InertSep K-solute），GPC/SPE凈化系統(tǒng)（GL Sciences G-Prep GPC 8050和8100），SAX/PSA的雙層微型柱（GL Sciences InertSep SAX/PS）和GPC柱（Shodex CLNpak EV2000 12F和CLNpak EV-G 12C）已投放市場。

已按照2012年日本厚生勞動省制定的《日本食品中農(nóng)業(yè)化學品殘留指南》對新的多殘留檢測方法進行了驗證，2015年2月26日作為日本官方農(nóng)藥多殘留LC-MS II（動物和水產(chǎn)品）檢測方法（圖6）。

3 GC-MS半定量綜合系統(tǒng)

為了處理緊急事件，也需要有可用于大多數(shù)農(nóng)藥包括非預期的農(nóng)藥的快速鑒定和半定量綜合系統(tǒng)。因此，Eiji Ueno等評估了GC-MS EI掃描模式聯(lián)用相對保留時間、質(zhì)譜和校準曲線3種數(shù)據(jù)庫的檢測農(nóng)藥等環(huán)境污染物的同步測定方法，并報道了方法的有效性。也就是說，常規(guī)校準曲線數(shù)據(jù)庫以氘化穩(wěn)定的萘-d8、菲-d10和熒蒽-d10等多環(huán)芳香烴作為內(nèi)標，根據(jù)相對保留時間分配。一般認為，常規(guī)數(shù)據(jù)庫可用于篩選相對穩(wěn)定的環(huán)境污染物，但不適用于檢測具有各種物理化學行為的農(nóng)藥，如不穩(wěn)定的農(nóng)藥會在GC進樣口分解，由于基質(zhì)效應，回收率出現(xiàn)極值，比如大于200%（圖8-A）。

圖6 日本官方農(nóng)藥多殘留LC-MS II（動物和水產(chǎn)品）檢測方法基礎(chǔ)流程圖

圖7 填充苯乙烯二乙烯基苯共聚物（Shodex CLNpak EV2000柱: 12 mm i.d.×300 mm×6 μm, CLNpak EV-G gard柱: 12 mm i.d.×100 mm×16 μm, 流動相：丙酮-環(huán)己烷（3 : 17）,流速：3 mL/min）的GPC柱凈化

圖8 兩類校準曲線數(shù)據(jù)庫定量精度的差異

因此，為了提高校準曲線數(shù)據(jù)庫的精度和可重復性，選擇乙酰甲胺磷-d6、西維因-d7、毒死蜱-d10、抑霉唑-d5、馬拉硫磷-d10和es-氰戊菊酯-d7等19個以上穩(wěn)定同位素標記的農(nóng)藥［替代物（surrogates）］作為GC-MS分析的合適內(nèi)標，此成本低廉且能穩(wěn)定供給的替代物混合物已商品化。Eiji Ueno等發(fā)明的“色譜法多定量分析”技術(shù)，可根據(jù)經(jīng)試驗獲得的物理化學性質(zhì)數(shù)據(jù)，將這些替代物精準地分配至數(shù)以百計的農(nóng)藥（圖8-B）。順便提一下，4,4-滴滴涕-d8（p,p'-DDT-d8）和α-六六六-d6（α-HCH-d6）等受《日本化學物質(zhì)審查法》（1973年第117號法案）嚴格監(jiān)管，沒有從現(xiàn)有替代物中選擇。

最后，2013年11月宣布推出不使用農(nóng)藥標準品的GC-MS綜合色譜檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用EI-SIM/掃描切換模式GC-MS，雙柱確證命名為島津Twin Line MS系統(tǒng)（圖2），半定量數(shù)據(jù)庫命名為島津Quick DB。Quick DB數(shù)據(jù)庫包括450多種農(nóng)藥替代物創(chuàng)建的保留指數(shù)、質(zhì)譜和校準曲線?？紤]檢測頻率和靈敏度的同時，約160種多類優(yōu)先農(nóng)藥（priority pesticides）選擇SIM模式，添加農(nóng)藥（additional pesticides）選擇掃描模式，同時根據(jù)上述技術(shù)將19種替代物分配至這些農(nóng)藥。該系統(tǒng)適用于奶酪、黃油和味噌（日本傳統(tǒng)的調(diào)味料，由發(fā)酵大豆生成）等高脂肪食品日常分析使用。一些食品的色譜圖中出現(xiàn)了相當多的干擾峰，在某些情況下，無法利用替代目標離子色譜（SIM離子）消除這些干擾峰。為了解決這一難題，GC-MS配置了2個不同的色譜柱。因此，由于干擾和/或保留時間而不能被第一個色譜檢測出農(nóng)藥被轉(zhuǎn)到后方，受基質(zhì)影響可由第二色譜檢測和定量。當意識到有基質(zhì)存在時，掃描模式有助于確認化合物特性。這個新系統(tǒng)具有快速鑒定和半定量檢測各種食品中多種ppb級（如0.01 mg/kg）農(nóng)藥殘留的性能，符合日本“肯定列表制度”的要求。

最近，因為應用MRM模式的高選擇性導致檢出限較低，GC-MS/MS已被普遍用于農(nóng)藥殘留分析。GC-MS/MS EI-MRM模式的島津Quick DB也同時商品化。

4 結(jié) 論

在日本，隨著“肯定列表制度”的推行和最新MS（/MS）性能的改進，GC-MS（/MS）和LC-MS/MS已成為分離和檢測設(shè)備的首選。尤其是MS/MS能夠選擇性地獲得MRM色譜圖和產(chǎn)物離子掃描光譜，因此或可簡化樣品的制備方法。但在電離過程中，一些基質(zhì)對MS（/MS）具有很大的影響。最新選擇性檢測GC和HPLC的性能也有所改善。因此，當需要精確定量時，必要時應將樣品適當凈化后再由GC 和HPLC確認。突發(fā)的食品安全事故不僅是對進口食品的示警，同樣也是對日本國內(nèi)食品安全的示警。結(jié)合上述全面色譜檢測方法的MS（/MS）系統(tǒng)不僅在緊急事件中有望使用，也可在農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)管監(jiān)控及各種食品裝運前的檢驗中使用。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2016.02.06

TQ450

A

1009-6485（2016）02-021-05

筱禾，女，碩士，工程師，Tel: 021-64387891-201。

2016-03-30。