倪博然，林龍飛，張慧，倪健

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

不同工藝白金膠囊對(duì)慢性不可預(yù)知應(yīng)激所致小鼠抑郁癥的影響

倪博然，林龍飛，張慧，倪健

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

目的 評(píng)價(jià)不同工藝制備的白金膠囊治療慢性不可預(yù)知應(yīng)激所致小鼠抑郁癥的藥效。方法 采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激制備小鼠抑郁模型。實(shí)驗(yàn)小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、陽性藥組、工藝品1（傳統(tǒng)工藝）大劑量組、工藝品1小劑量組、工藝品2（精制工藝）大劑量組、工藝品2小劑量組，各藥物組小鼠予相應(yīng)劑量灌胃給藥。通過測(cè)定小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間、懸尾不動(dòng)時(shí)間兩個(gè)行為學(xué)指標(biāo)考察白金膠囊傳統(tǒng)工藝和精制工藝的抗抑郁作用；通過測(cè)定小鼠自主活動(dòng)和體質(zhì)量考察受試藥物是否具有中樞興奮性或改變動(dòng)物機(jī)體的機(jī)能狀態(tài)的作用。結(jié)果 模型組和工藝品2大、小劑量組小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間分別為（138.27±40.70）s、（100.01±34.75）s、（88.15±30.62）s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組和工藝品2小劑量組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)分別為（668± 19）次、（705±24）次，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組和工藝品1大劑量組體質(zhì)量分別為（28.14± 1.25）g、（26.43±2.58）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和工藝品2大劑量組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間時(shí)間分別為（98.29±36.90）s、（87.54±30.05）s，工藝品2大劑量組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間有縮短趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 精制工藝白金膠囊用于治療慢性不可預(yù)知應(yīng)激所致小鼠抑郁癥的藥效優(yōu)于傳統(tǒng)工藝。

白金膠囊；傳統(tǒng)工藝；精制工藝；慢性不可預(yù)知應(yīng)激；抑郁癥；小鼠

抑郁癥是一種常見的大腦功能紊亂性疾病，為慢性反復(fù)發(fā)作的腦疾病，曾被喻為“心理疾病中的感冒”。臨床上對(duì)抑郁癥的治療模式和方法分類有很多，藥物治療是目前臨床上治療抑郁癥的重要手段，但由于抑郁癥發(fā)病的確切機(jī)制仍未完全明確，目前藥物治療僅在一定程度上有效，并不能治愈抑郁癥，而且抗抑郁藥的安全性問題目前尚無法解決，WHO已將抗抑郁藥列為21世紀(jì)最需迫切開發(fā)的藥物之一。白金膠囊藥方來自臨床經(jīng)驗(yàn)方，在臨床上被用于治療肝氣郁結(jié)所致的抑郁癥，顯示出良好的療效[1]。但傳統(tǒng)工藝制劑攜帶、服用不便，臨床順應(yīng)性較差，故將處方中各藥味分別精制，將其制成膠囊劑。本研究以ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激制備抑郁模型，以自主活動(dòng)、體質(zhì)量、懸尾不動(dòng)和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間為指標(biāo)，評(píng)價(jià)白金膠囊傳統(tǒng)工藝與精制工藝的抗抑郁藥效，為制備工藝變更提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性ICR小鼠120只，10周齡，體質(zhì)量18～22 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。置于室溫（23±1）℃，24 h晝夜循環(huán)光照條件下飼養(yǎng)，自由飲水取食。

1.2 藥物和試劑

郁金（批號(hào)20130601）、合歡花（批號(hào)20130901）、蜘蛛香（批號(hào)20130901），亳州市遠(yuǎn)光中藥飲片廠；白芍（批號(hào)201002298），北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司；姜黃素對(duì)照品（批號(hào)110823-201004）、槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)111538-200504）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736-201136）、苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)100419-201302），中國(guó)食品藥品檢定研究院；11-ethoxyviburtinal對(duì)照品，北京中醫(yī)藥大學(xué)高增平教授實(shí)驗(yàn)室提供，供含量測(cè)定用；白金膠囊工藝品1及2均為固體粉末（本實(shí)驗(yàn)室自制）配制成適宜濃度混懸液使用；陽性藥物為鹽酸氯米帕明片，天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)110703，25 mg/片。乙腈、甲醇均為色譜純（Fisher公司），蒸餾水。

1.3 儀器

安捷倫1206高效液相色譜儀，Aglient Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），TU-1810紫外可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），DZ-2BC型真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），METTLER-AE240型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗儀（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），BT125D型電子天平（賽多利斯），小鼠自主活動(dòng)儀（MV1ZDMACHI.KIKAI.EEO.ZTD，TOKYO），小動(dòng)物行為分析系統(tǒng)（Ethovision XT 9）。

2 方法與結(jié)果

2.1 白金膠囊傳統(tǒng)工藝制備方法

按處方比例，將郁金、合歡花、白芍、蜘蛛香以10倍量水提取3次，每次1.5 h，合并提取液，濃縮，蒸干，得白金膠囊傳統(tǒng)工藝制品（工藝品1）。采用高效液相色譜法（HPLC），以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定白金膠囊工藝品1中芍藥苷的含量為1.96%。

2.2 白金膠囊精制工藝制備方法

對(duì)處方中的各藥材分別單獨(dú)提取，繼而采用大孔樹脂技術(shù)進(jìn)行純化，并測(cè)定各提取物中指標(biāo)性成分的含量。將純化后的各藥材提取物，按處方比例混勻即得白金膠囊精制工藝制品（工藝品2）。

2.2.1 郁金提取精制工藝優(yōu)選及姜黃素含量測(cè)定 通過正交試驗(yàn)篩選出郁金提取精制工藝為：稱取郁金，加入6倍量70%乙醇溶液，回流提取2次，每次1.5 h，濾過，合并提取液，減壓濃縮至0.5 g原藥材/mL，過S-8型大孔吸附樹脂柱，上樣量為0.6 g原藥材/mL樹脂，5 BV水洗棄去，減壓回收80%乙醇洗脫液，濃縮干燥，備用。按照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）姜黃項(xiàng)下含量測(cè)定方法[2]，測(cè)定提取精制樣品中姜黃素的含量為3.63%。

2.2.2 合歡花提取精制工藝優(yōu)選及槲皮苷和總黃酮含量測(cè)定 正交試驗(yàn)篩選合歡花提取精制工藝為：稱取合歡花，加入12倍量70%乙醇溶液，回流提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至0.2 g原藥材/mL，過AB-8型大孔吸附樹脂柱，上樣量為0.4 g原藥材/mL樹脂，徑高比為1∶8，4 BV水洗棄去，4 BV 10%乙醇洗棄去，減壓回收50%乙醇洗脫液，濃縮干燥，備用[3-4]。采用HPLC，以乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定提取精制的樣品中槲皮苷含量為16.59%。采用AlCl3直接顯色法，以槲皮苷為對(duì)照品，檢測(cè)波長(zhǎng)為425 nm，測(cè)定提取精制樣品中總黃酮的含量為30.62%。

2.2.3 白芍提取精制工藝優(yōu)選及白芍總苷和芍藥苷含量測(cè)定 正交試驗(yàn)篩選白芍提取精制工藝為：稱取白芍，加入14倍量70%乙醇溶液，回流提取3次，每次1.5 h，濾過，合并提取液，減壓濃縮至0.2 g原藥材/mL，過AB-8型大孔吸附樹脂柱，上樣量為0.75 g原藥材/mL樹脂，徑高比為1∶8，5 BV水洗棄去，減壓回收50%乙醇洗脫液，濃縮干燥，備用。采用HPLC，以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定提取精制樣品中芍藥苷的含量為36.38%。采用NaOH水解法水解，采用HPLC，以甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鉀-異丙醇-冰乙酸（87∶13∶4∶4）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，測(cè)定提取精制樣品中苯甲酸的含量，根據(jù)公式白芍總苷含量（%）＝苯甲酸含量%×480.27÷ 122.12，計(jì)算提取精制樣品中白芍總苷的含量為53.11%。

2.2.4 蜘蛛香提取精制工藝優(yōu)選及11-ethoxyviburtinal含量測(cè)定 正交試驗(yàn)篩選蜘蛛香提取精制工藝為：稱取蜘蛛香，加入12倍量70%乙醇溶液，回流提取2次，每次2 h，濾過，合并提取液，減壓濃縮至0.2 g原藥材/mL，過AB-8型大孔吸附樹脂柱，上樣量為0.52 g原藥材/mL樹脂，徑高比為1∶6，2 BV 30%乙醇洗棄去，減壓回收70%乙醇洗脫液，濃縮干燥，備用。采用HPLC，以乙腈-水（40∶60）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為288 nm，流速0.95 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定提取精制樣品中11-ethoxyviburtinal的含量為0.92%。

2.3 分組

雄性ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、陽性藥組、工藝品1大劑量組（4.12 g/kg）、工藝品1小劑量組（1.37 g/kg）、工藝品2大劑量組（2.15 g/kg）、工藝品2小劑量組（0.72 g/kg）。除模型組小鼠為13只外，其余各組小鼠均為15只。

2.4 造模

采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激制備小鼠抑郁模型。應(yīng)激小鼠每日隨機(jī)接受2種不同的刺激并在造模過程中保持孤養(yǎng)狀態(tài)，共21 d。實(shí)驗(yàn)中采取的刺激方法包括：束縛2 h，45°傾斜飼養(yǎng)籠12 h，晝夜顛倒，禁水12 h，禁食12 h，夾尾刺激1 min，潮濕墊料12 h （每200 g墊料加100 mL水），搖晃鼠籠5 min。

2.5 給藥

將臨床等效劑量作為各工藝品的小劑量組（含原藥材7.38 g/kg），將小劑量組的3倍量作為各工藝品大劑量組（含原藥材22.14 g/kg）。分別精密稱取上述2種白金膠囊工藝品粉末適量，置研缽中，精密加入蒸餾水研磨均勻，制成濃度分別為0.068 5、0.206 0 g/mL工藝品1混懸液，0.036 0、0.107 5 g/mL工藝品2混懸液。取鹽酸氯米帕明片3片，精密加入蒸餾水75 mL于研缽中研磨，超聲分散20 min，制成含原藥材濃度為1 mg/mL的混懸液，4 ℃保存。各藥物組小鼠按相應(yīng)劑量灌胃，給藥體積為0.2 mL/10 g，每日1次，模型組小鼠灌胃等量蒸餾水。各組均在上午9:00－10:00灌胃給藥，連續(xù)7 d。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.7 觀察指標(biāo)及測(cè)定結(jié)果

2.7.1 不同工藝白金膠囊對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響 于最后1次給藥后1 h，將小鼠單個(gè)放于高24 cm、直徑12 cm燒杯中，水深10 cm，溫度（21± 2）℃，每2只小鼠間用擋板隔開動(dòng)物視線，防止相互干擾，初放入杯內(nèi)時(shí)，小鼠拼命游泳并試圖爬上燒杯壁，一段時(shí)間后，因失望而活動(dòng)減弱，表現(xiàn)為身體微曲，鼻孔露出水面，呈漂浮狀態(tài)，用Ethovision XT 9軟件記錄小鼠6 min內(nèi)后4 min的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間（不動(dòng)指標(biāo)為動(dòng)物除呼吸外，所有肢體均不動(dòng)）。全程錄像拍攝。

小鼠在掙扎一段時(shí)間之后便進(jìn)入一種不動(dòng)的狀態(tài)，說明動(dòng)物處于絕望狀態(tài)，不動(dòng)時(shí)間縮短體現(xiàn)藥物的抗抑郁作用。在觀測(cè)的4 min內(nèi)，與模型組比較，陽性藥組、工藝品1各劑量組小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間均未出現(xiàn)明顯差異，但工藝品2各劑量組游泳不動(dòng)時(shí)間均都明顯縮短（P＜0.01），且小劑量組較大劑量組縮短更加明顯。結(jié)果見表1。

2.7.2 不同工藝白金膠囊對(duì)小鼠自主活動(dòng)時(shí)間和體質(zhì)量的影響 于最后1次給藥后1 h，用小鼠自主活動(dòng)儀測(cè)定小鼠5 min內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)，并稱重。與模型組比較，工藝品2小劑量組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)多于模型組（P＜0.01），其余各劑量組小鼠自主活動(dòng)未見明顯差異，見表2。小鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后與模型組比較，工藝品1大劑量組低于模型組（P＜0.05），見表3。

表1 各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

表1 各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01

組別 只數(shù) 游泳不動(dòng)時(shí)間/s模型組 13 138.27±40.70陽性藥組 15 135.58±43.73工藝品1大劑量組 15 156.31±30.75工藝品1小劑量組 15 144.59±53.50工藝品2大劑量組 15 100.01±34.75**工藝品2小劑量組 15 88.15±30.62**

注：與模型組比較，**P＜0.01

表3 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s）

表3 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05

組別 只數(shù) 體質(zhì)量/g模型組 13 28.14±1.25陽性藥組 15 27.15±1.87工藝品1大劑量組 15 26.43±2.58*工藝品1小劑量組 15 27.27±1.26工藝品2大劑量組 15 28.10±2.60工藝品2小劑量組 15 27.95±2.28

2.7.3 不同工藝白金膠囊對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間的影響 于最后1次給藥后1 h，用膠帶在距離小鼠尾尖20 mm處將之固定于鐵架臺(tái)上，用Ethovision XT 9軟件記錄小鼠掙扎和不動(dòng)狀態(tài)共6 min，通過軟件累計(jì)后4 min的不動(dòng)時(shí)間，全程錄像拍攝。小鼠在掙扎一段時(shí)間后便進(jìn)入一種不動(dòng)的狀態(tài)，說明小鼠處于絕望狀態(tài)，不動(dòng)時(shí)間縮短體現(xiàn)藥物的抗抑郁作用。在觀測(cè)的4 min內(nèi)，與模型組比較，各藥物組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間未見明顯差異，但是工藝品2大劑量組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間有縮短趨勢(shì)。結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

表4 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

組別 只數(shù) 懸尾不動(dòng)時(shí)間/s模型組 13 98.29±36.90陽性藥組 15 71.91±38.06工藝品1大劑量組 15 93.87±45.26工藝品1小劑量組 15 95.01±41.48工藝品2大劑量組 15 87.54±30.05工藝品2小劑量組 15 101.54±39.20

3 討論

中醫(yī)學(xué)中雖無“抑郁癥”病名，但對(duì)其認(rèn)識(shí)有著悠久的歷史，其應(yīng)屬中醫(yī)“郁癥”“臟燥”“百合病”等范疇，在治療上也有許多相關(guān)記載。有研究表明，中醫(yī)藥治療抑郁癥療效穩(wěn)定、作用持久、不良反應(yīng)少、復(fù)發(fā)率低、身心整體調(diào)治、適合長(zhǎng)期服用[5]。

在行為絕望動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，藥物對(duì)動(dòng)物行為所產(chǎn)生的影響，不僅說明藥物具有抗抑郁作用，有可能藥物具有中樞興奮性或改變動(dòng)物的機(jī)體狀態(tài)。所以，檢測(cè)小鼠自主活動(dòng)及其體質(zhì)量，主要用來檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)藥物是否具有中樞興奮性或改變動(dòng)物機(jī)體狀態(tài)的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激成功制備抑郁小鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白金膠精制工藝對(duì)小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間有縮短的趨勢(shì)，且各劑量組均能明顯縮短小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間（P＜0.01），且小劑量組較大劑量組更加明顯；同時(shí)，工藝品2小劑量組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)也高于模型組、工藝品2大劑量組。結(jié)果表明，精制工藝白金膠囊用于治療慢性不可預(yù)知應(yīng)激所致的小鼠抑郁癥藥效優(yōu)于傳統(tǒng)工藝。

[1] 楊培,李雪春,林龍飛,等.基于代謝組學(xué)技術(shù)的白金膠囊治療抑郁癥的研究[J].世界中醫(yī)藥,2014,10(9)：1341-1345.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：247-248.

[3] 張慧,林龍飛,楊培,等.合歡花總黃酮的分離純化工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(18)：27-29.

[4] 張慧,張晉,齊娟娟,等.正交試驗(yàn)法優(yōu)化白金膠囊中合歡花的提取工藝[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(3)：78-80.

[5] 蔣美瓊,苗明三.中醫(yī)藥治療抑郁癥特點(diǎn)分析[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2013, 28(12)：1881-1883.

Effects of Different Processes of Baijin Capsule on Treatment of Mice with Chronic Unpredictable Stress-induced Depression

NI Bo-ran, LIN Long-fei, ZHANG Hui, NI Jian (Beijing

University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Objective To evaluate the efficacy of different processes of Baijin Capsule to treatment of mice with chronic unpredictable stress-induced depression. Methods Chronic unpredictable stress was used to establish depression mice models. Experimental mice were divided into the following groups according to body mass: model group, positive medicine group, artware one (traditional process) high-dose and low-dose groups, and artware (refining process) two high-dose and low-dose groups. All medication groups were given relevant medicine for gavage. By detecting the two behavior indexes, immobility time of swimming and tail suspension of mice, the anti-depression effects of traditional process and refining process of Baijin Capsule were investigated. By detecting autonomic activities and body mass, tested medicine was examined for function state of central excitation and changing animal body. Results The times for automatic activities of Baijin Capsule in the model and artware (refining process) two high-dose and low-dose groups were (138.27±40.70)s, (100.01±34.75)s and (88.15±30.62)s, respectively, with statistical significance (P<0.01); the mice swimming immobility times in the model and artware (refining process) two low-dose groups were 668±19 and 705±24, respectively, with statistical significance (P<0.01); the mice tail suspension immobility times in model and artware (traditional process) one high-dose groups group were (28.14±1.25)g and (26.43±2.58)g, respectively, with statistical significance (P<0.05); the mice tail suspension immobility times in model and artware (refining process) two high-dose groups were (98.29±36.90)s and (87.54±30.05)s. Mice tail suspension immobility time in artware (refining process) two high-dose group decreased,without statistical significance. Conclusion Refining process of Baijin Capsule can effectively be used to treat mice with chronic unpredictable stress-induced depression, and the efficacy is superior to the traditional process.

Baijin Capsule; traditional process; refining process; chronic unpredictable stress; depression; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.015

R285.5

A

1005-5304(2016)01-0065-04

2015-03-29)

(

2015-04-21；編輯：華強(qiáng))

倪健,E-mail：njtcm@263.net