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        不同工藝白金膠囊對慢性不可預知應激所致小鼠抑郁癥的影響

        2016-12-19 08:23:52倪博然林龍飛張慧倪健
        中國中醫(yī)藥信息雜志 2016年1期
        關鍵詞:懸尾白金工藝品

        倪博然,林龍飛,張慧,倪健

        北京中醫(yī)藥大學,北京 100029

        不同工藝白金膠囊對慢性不可預知應激所致小鼠抑郁癥的影響

        倪博然,林龍飛,張慧,倪健

        北京中醫(yī)藥大學,北京 100029

        目的 評價不同工藝制備的白金膠囊治療慢性不可預知應激所致小鼠抑郁癥的藥效。方法 采用慢性不可預知應激制備小鼠抑郁模型。實驗小鼠按體質(zhì)量隨機分為模型組、陽性藥組、工藝品1(傳統(tǒng)工藝)大劑量組、工藝品1小劑量組、工藝品2(精制工藝)大劑量組、工藝品2小劑量組,各藥物組小鼠予相應劑量灌胃給藥。通過測定小鼠游泳不動時間、懸尾不動時間兩個行為學指標考察白金膠囊傳統(tǒng)工藝和精制工藝的抗抑郁作用;通過測定小鼠自主活動和體質(zhì)量考察受試藥物是否具有中樞興奮性或改變動物機體的機能狀態(tài)的作用。結果 模型組和工藝品2大、小劑量組小鼠游泳不動時間分別為(138.27±40.70)s、(100.01±34.75)s、(88.15±30.62)s,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);模型組和工藝品2小劑量組小鼠自主活動次數(shù)分別為(668± 19)次、(705±24)次,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);模型組和工藝品1大劑量組體質(zhì)量分別為(28.14± 1.25)g、(26.43±2.58)g,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組和工藝品2大劑量組小鼠懸尾不動時間時間分別為(98.29±36.90)s、(87.54±30.05)s,工藝品2大劑量組小鼠懸尾不動時間有縮短趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義。結論 精制工藝白金膠囊用于治療慢性不可預知應激所致小鼠抑郁癥的藥效優(yōu)于傳統(tǒng)工藝。

        白金膠囊;傳統(tǒng)工藝;精制工藝;慢性不可預知應激;抑郁癥;小鼠

        抑郁癥是一種常見的大腦功能紊亂性疾病,為慢性反復發(fā)作的腦疾病,曾被喻為“心理疾病中的感冒”。臨床上對抑郁癥的治療模式和方法分類有很多,藥物治療是目前臨床上治療抑郁癥的重要手段,但由于抑郁癥發(fā)病的確切機制仍未完全明確,目前藥物治療僅在一定程度上有效,并不能治愈抑郁癥,而且抗抑郁藥的安全性問題目前尚無法解決,WHO已將抗抑郁藥列為21世紀最需迫切開發(fā)的藥物之一。白金膠囊藥方來自臨床經(jīng)驗方,在臨床上被用于治療肝氣郁結所致的抑郁癥,顯示出良好的療效[1]。但傳統(tǒng)工藝制劑攜帶、服用不便,臨床順應性較差,故將處方中各藥味分別精制,將其制成膠囊劑。本研究以ICR小鼠為實驗對象,采用慢性不可預知應激制備抑郁模型,以自主活動、體質(zhì)量、懸尾不動和強迫游泳不動時間為指標,評價白金膠囊傳統(tǒng)工藝與精制工藝的抗抑郁藥效,為制備工藝變更提供實驗依據(jù)。

        1 實驗材料

        1.1 動物

        雄性ICR小鼠120只,10周齡,體質(zhì)量18~22 g,北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號SCXK(京)2012-0001。置于室溫(23±1)℃,24 h晝夜循環(huán)光照條件下飼養(yǎng),自由飲水取食。

        1.2 藥物和試劑

        郁金(批號20130601)、合歡花(批號20130901)、蜘蛛香(批號20130901),亳州市遠光中藥飲片廠;白芍(批號201002298),北京同仁堂飲片有限責任公司;姜黃素對照品(批號110823-201004)、槲皮苷對照品(批號111538-200504)、芍藥苷對照品(批號110736-201136)、苯甲酸對照品(批號100419-201302),中國食品藥品檢定研究院;11-ethoxyviburtinal對照品,北京中醫(yī)藥大學高增平教授實驗室提供,供含量測定用;白金膠囊工藝品1及2均為固體粉末(本實驗室自制)配制成適宜濃度混懸液使用;陽性藥物為鹽酸氯米帕明片,天津藥物研究院藥業(yè)有限責任公司,批號110703,25 mg/片。乙腈、甲醇均為色譜純(Fisher公司),蒸餾水。

        1.3 儀器

        安捷倫1206高效液相色譜儀,Aglient Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),TU-1810紫外可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司),DZ-2BC型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司),METTLER-AE240型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗儀(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司),BT125D型電子天平(賽多利斯),小鼠自主活動儀(MV1ZDMACHI.KIKAI.EEO.ZTD,TOKYO),小動物行為分析系統(tǒng)(Ethovision XT 9)。

        2 方法與結果

        2.1 白金膠囊傳統(tǒng)工藝制備方法

        按處方比例,將郁金、合歡花、白芍、蜘蛛香以10倍量水提取3次,每次1.5 h,合并提取液,濃縮,蒸干,得白金膠囊傳統(tǒng)工藝制品(工藝品1)。采用高效液相色譜法(HPLC),以乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)為流動相,檢測波長為230 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量10 μL,測定白金膠囊工藝品1中芍藥苷的含量為1.96%。

        2.2 白金膠囊精制工藝制備方法

        對處方中的各藥材分別單獨提取,繼而采用大孔樹脂技術進行純化,并測定各提取物中指標性成分的含量。將純化后的各藥材提取物,按處方比例混勻即得白金膠囊精制工藝制品(工藝品2)。

        2.2.1 郁金提取精制工藝優(yōu)選及姜黃素含量測定 通過正交試驗篩選出郁金提取精制工藝為:稱取郁金,加入6倍量70%乙醇溶液,回流提取2次,每次1.5 h,濾過,合并提取液,減壓濃縮至0.5 g原藥材/mL,過S-8型大孔吸附樹脂柱,上樣量為0.6 g原藥材/mL樹脂,5 BV水洗棄去,減壓回收80%乙醇洗脫液,濃縮干燥,備用。按照2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)姜黃項下含量測定方法[2],測定提取精制樣品中姜黃素的含量為3.63%。

        2.2.2 合歡花提取精制工藝優(yōu)選及槲皮苷和總黃酮含量測定 正交試驗篩選合歡花提取精制工藝為:稱取合歡花,加入12倍量70%乙醇溶液,回流提取2次,每次2 h,濾過,合并濾液,減壓濃縮至0.2 g原藥材/mL,過AB-8型大孔吸附樹脂柱,上樣量為0.4 g原藥材/mL樹脂,徑高比為1∶8,4 BV水洗棄去,4 BV 10%乙醇洗棄去,減壓回收50%乙醇洗脫液,濃縮干燥,備用[3-4]。采用HPLC,以乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80)為流動相,檢測波長為256 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量10 μL,測定提取精制的樣品中槲皮苷含量為16.59%。采用AlCl3直接顯色法,以槲皮苷為對照品,檢測波長為425 nm,測定提取精制樣品中總黃酮的含量為30.62%。

        2.2.3 白芍提取精制工藝優(yōu)選及白芍總苷和芍藥苷含量測定 正交試驗篩選白芍提取精制工藝為:稱取白芍,加入14倍量70%乙醇溶液,回流提取3次,每次1.5 h,濾過,合并提取液,減壓濃縮至0.2 g原藥材/mL,過AB-8型大孔吸附樹脂柱,上樣量為0.75 g原藥材/mL樹脂,徑高比為1∶8,5 BV水洗棄去,減壓回收50%乙醇洗脫液,濃縮干燥,備用。采用HPLC,以乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)為流動相,檢測波長為230 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量10 μL,測定提取精制樣品中芍藥苷的含量為36.38%。采用NaOH水解法水解,采用HPLC,以甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鉀-異丙醇-冰乙酸(87∶13∶4∶4)為流動相,檢測波長為230 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,測定提取精制樣品中苯甲酸的含量,根據(jù)公式白芍總苷含量(%)=苯甲酸含量%×480.27÷ 122.12,計算提取精制樣品中白芍總苷的含量為53.11%。

        2.2.4 蜘蛛香提取精制工藝優(yōu)選及11-ethoxyviburtinal含量測定 正交試驗篩選蜘蛛香提取精制工藝為:稱取蜘蛛香,加入12倍量70%乙醇溶液,回流提取2次,每次2 h,濾過,合并提取液,減壓濃縮至0.2 g原藥材/mL,過AB-8型大孔吸附樹脂柱,上樣量為0.52 g原藥材/mL樹脂,徑高比為1∶6,2 BV 30%乙醇洗棄去,減壓回收70%乙醇洗脫液,濃縮干燥,備用。采用HPLC,以乙腈-水(40∶60)為流動相,檢測波長為288 nm,流速0.95 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量10 μL,測定提取精制樣品中11-ethoxyviburtinal的含量為0.92%。

        2.3 分組

        雄性ICR小鼠適應性飼養(yǎng)3 d,按體質(zhì)量隨機分為模型組、陽性藥組、工藝品1大劑量組(4.12 g/kg)、工藝品1小劑量組(1.37 g/kg)、工藝品2大劑量組(2.15 g/kg)、工藝品2小劑量組(0.72 g/kg)。除模型組小鼠為13只外,其余各組小鼠均為15只。

        2.4 造模

        采用慢性不可預知應激制備小鼠抑郁模型。應激小鼠每日隨機接受2種不同的刺激并在造模過程中保持孤養(yǎng)狀態(tài),共21 d。實驗中采取的刺激方法包括:束縛2 h,45°傾斜飼養(yǎng)籠12 h,晝夜顛倒,禁水12 h,禁食12 h,夾尾刺激1 min,潮濕墊料12 h (每200 g墊料加100 mL水),搖晃鼠籠5 min。

        2.5 給藥

        將臨床等效劑量作為各工藝品的小劑量組(含原藥材7.38 g/kg),將小劑量組的3倍量作為各工藝品大劑量組(含原藥材22.14 g/kg)。分別精密稱取上述2種白金膠囊工藝品粉末適量,置研缽中,精密加入蒸餾水研磨均勻,制成濃度分別為0.068 5、0.206 0 g/mL工藝品1混懸液,0.036 0、0.107 5 g/mL工藝品2混懸液。取鹽酸氯米帕明片3片,精密加入蒸餾水75 mL于研缽中研磨,超聲分散20 min,制成含原藥材濃度為1 mg/mL的混懸液,4 ℃保存。各藥物組小鼠按相應劑量灌胃,給藥體積為0.2 mL/10 g,每日1次,模型組小鼠灌胃等量蒸餾水。各組均在上午9:00-10:00灌胃給藥,連續(xù)7 d。

        2.6 統(tǒng)計學方法

        2.7 觀察指標及測定結果

        2.7.1 不同工藝白金膠囊對小鼠強迫游泳不動時間的影響 于最后1次給藥后1 h,將小鼠單個放于高24 cm、直徑12 cm燒杯中,水深10 cm,溫度(21± 2)℃,每2只小鼠間用擋板隔開動物視線,防止相互干擾,初放入杯內(nèi)時,小鼠拼命游泳并試圖爬上燒杯壁,一段時間后,因失望而活動減弱,表現(xiàn)為身體微曲,鼻孔露出水面,呈漂浮狀態(tài),用Ethovision XT 9軟件記錄小鼠6 min內(nèi)后4 min的累計不動時間(不動指標為動物除呼吸外,所有肢體均不動)。全程錄像拍攝。

        小鼠在掙扎一段時間之后便進入一種不動的狀態(tài),說明動物處于絕望狀態(tài),不動時間縮短體現(xiàn)藥物的抗抑郁作用。在觀測的4 min內(nèi),與模型組比較,陽性藥組、工藝品1各劑量組小鼠游泳不動時間均未出現(xiàn)明顯差異,但工藝品2各劑量組游泳不動時間均都明顯縮短(P<0.01),且小劑量組較大劑量組縮短更加明顯。結果見表1。

        2.7.2 不同工藝白金膠囊對小鼠自主活動時間和體質(zhì)量的影響 于最后1次給藥后1 h,用小鼠自主活動儀測定小鼠5 min內(nèi)的自主活動次數(shù),并稱重。與模型組比較,工藝品2小劑量組小鼠自主活動次數(shù)多于模型組(P<0.01),其余各劑量組小鼠自主活動未見明顯差異,見表2。小鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時間延長逐漸增長,實驗結束后與模型組比較,工藝品1大劑量組低于模型組(P<0.05),見表3。

        表1 各組小鼠強迫游泳不動時間比較(±s)

        表1 各組小鼠強迫游泳不動時間比較(±s)

        注:與模型組比較,**P<0.01

        組別 只數(shù) 游泳不動時間/s模型組 13 138.27±40.70陽性藥組 15 135.58±43.73工藝品1大劑量組 15 156.31±30.75工藝品1小劑量組 15 144.59±53.50工藝品2大劑量組 15 100.01±34.75**工藝品2小劑量組 15 88.15±30.62**

        注:與模型組比較,**P<0.01

        表3 各組小鼠體質(zhì)量比較(±s)

        表3 各組小鼠體質(zhì)量比較(±s)

        注:與模型組比較,*P<0.05

        組別 只數(shù) 體質(zhì)量/g模型組 13 28.14±1.25陽性藥組 15 27.15±1.87工藝品1大劑量組 15 26.43±2.58*工藝品1小劑量組 15 27.27±1.26工藝品2大劑量組 15 28.10±2.60工藝品2小劑量組 15 27.95±2.28

        2.7.3 不同工藝白金膠囊對小鼠懸尾不動時間的影響 于最后1次給藥后1 h,用膠帶在距離小鼠尾尖20 mm處將之固定于鐵架臺上,用Ethovision XT 9軟件記錄小鼠掙扎和不動狀態(tài)共6 min,通過軟件累計后4 min的不動時間,全程錄像拍攝。小鼠在掙扎一段時間后便進入一種不動的狀態(tài),說明小鼠處于絕望狀態(tài),不動時間縮短體現(xiàn)藥物的抗抑郁作用。在觀測的4 min內(nèi),與模型組比較,各藥物組小鼠懸尾不動時間未見明顯差異,但是工藝品2大劑量組小鼠懸尾不動時間有縮短趨勢。結果見表4。

        表4 各組小鼠懸尾不動時間比較(±s)

        表4 各組小鼠懸尾不動時間比較(±s)

        組別 只數(shù) 懸尾不動時間/s模型組 13 98.29±36.90陽性藥組 15 71.91±38.06工藝品1大劑量組 15 93.87±45.26工藝品1小劑量組 15 95.01±41.48工藝品2大劑量組 15 87.54±30.05工藝品2小劑量組 15 101.54±39.20

        3 討論

        中醫(yī)學中雖無“抑郁癥”病名,但對其認識有著悠久的歷史,其應屬中醫(yī)“郁癥”“臟燥”“百合病”等范疇,在治療上也有許多相關記載。有研究表明,中醫(yī)藥治療抑郁癥療效穩(wěn)定、作用持久、不良反應少、復發(fā)率低、身心整體調(diào)治、適合長期服用[5]。

        在行為絕望動物模型實驗中,藥物對動物行為所產(chǎn)生的影響,不僅說明藥物具有抗抑郁作用,有可能藥物具有中樞興奮性或改變動物的機體狀態(tài)。所以,檢測小鼠自主活動及其體質(zhì)量,主要用來檢驗實驗藥物是否具有中樞興奮性或改變動物機體狀態(tài)的作用。

        本實驗采用慢性不可預知應激成功制備抑郁小鼠模型。實驗結果顯示,白金膠精制工藝對小鼠的懸尾不動時間有縮短的趨勢,且各劑量組均能明顯縮短小鼠游泳不動時間(P<0.01),且小劑量組較大劑量組更加明顯;同時,工藝品2小劑量組小鼠自主活動次數(shù)也高于模型組、工藝品2大劑量組。結果表明,精制工藝白金膠囊用于治療慢性不可預知應激所致的小鼠抑郁癥藥效優(yōu)于傳統(tǒng)工藝。

        [1] 楊培,李雪春,林龍飛,等.基于代謝組學技術的白金膠囊治療抑郁癥的研究[J].世界中醫(yī)藥,2014,10(9):1341-1345.

        [2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:247-248.

        [3] 張慧,林龍飛,楊培,等.合歡花總黃酮的分離純化工藝[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(18):27-29.

        [4] 張慧,張晉,齊娟娟,等.正交試驗法優(yōu)化白金膠囊中合歡花的提取工藝[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(3):78-80.

        [5] 蔣美瓊,苗明三.中醫(yī)藥治療抑郁癥特點分析[J].中醫(yī)學報,2013, 28(12):1881-1883.

        Effects of Different Processes of Baijin Capsule on Treatment of Mice with Chronic Unpredictable Stress-induced Depression

        NI Bo-ran, LIN Long-fei, ZHANG Hui, NI Jian (Beijing

        University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

        Objective To evaluate the efficacy of different processes of Baijin Capsule to treatment of mice with chronic unpredictable stress-induced depression. Methods Chronic unpredictable stress was used to establish depression mice models. Experimental mice were divided into the following groups according to body mass: model group, positive medicine group, artware one (traditional process) high-dose and low-dose groups, and artware (refining process) two high-dose and low-dose groups. All medication groups were given relevant medicine for gavage. By detecting the two behavior indexes, immobility time of swimming and tail suspension of mice, the anti-depression effects of traditional process and refining process of Baijin Capsule were investigated. By detecting autonomic activities and body mass, tested medicine was examined for function state of central excitation and changing animal body. Results The times for automatic activities of Baijin Capsule in the model and artware (refining process) two high-dose and low-dose groups were (138.27±40.70)s, (100.01±34.75)s and (88.15±30.62)s, respectively, with statistical significance (P<0.01); the mice swimming immobility times in the model and artware (refining process) two low-dose groups were 668±19 and 705±24, respectively, with statistical significance (P<0.01); the mice tail suspension immobility times in model and artware (traditional process) one high-dose groups group were (28.14±1.25)g and (26.43±2.58)g, respectively, with statistical significance (P<0.05); the mice tail suspension immobility times in model and artware (refining process) two high-dose groups were (98.29±36.90)s and (87.54±30.05)s. Mice tail suspension immobility time in artware (refining process) two high-dose group decreased,without statistical significance. Conclusion Refining process of Baijin Capsule can effectively be used to treat mice with chronic unpredictable stress-induced depression, and the efficacy is superior to the traditional process.

        Baijin Capsule; traditional process; refining process; chronic unpredictable stress; depression; mice

        10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.015

        R285.5

        A

        1005-5304(2016)01-0065-04

        2015-03-29)

        (

        2015-04-21;編輯:華強)

        倪健,E-mail:njtcm@263.net

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