蒿長英，陳明霞，馬文斌，郭平，呂海波，劉曄，連增林

1.漢典集團北京紅太陽藥業(yè)有限公司，北京 100103；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100102；3.漢典集團北京漢典制藥有限公司，北京 100103；4.漢典集團北京漢典中醫(yī)研究院有限公司，北京 100103

糖網(wǎng)明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮細胞生長因子和白細胞介素-1α的影響

蒿長英1，陳明霞2，馬文斌1，郭平3，呂海波3，劉曄4，連增林4

1.漢典集團北京紅太陽藥業(yè)有限公司，北京 100103；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100102；3.漢典集團北京漢典制藥有限公司，北京 100103；4.漢典集團北京漢典中醫(yī)研究院有限公司，北京 100103

目的 探討糖網(wǎng)明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926中血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）和白細胞介素（IL）-1α基因和蛋白表達的作用機制。方法 人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926分為空白組、高糖組、全方組、部位1（苷類和黃酮類）組、部位2（有機酸類和多糖類）組和部位3（生物堿類）組。以D-葡萄糖干預細胞復制高糖模型，半定量RT-PCR檢測糖網(wǎng)明目顆粒不同提取部位對高糖誘導細胞中VEGF和IL-1α的基因表達；ELISA檢測糖網(wǎng)明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的細胞中VEGF和IL-1α的蛋白表達。結果 高糖導致EA.hy926細胞VEGF和IL-1α mRNA和蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。糖網(wǎng)明目顆粒及其不同提取部位干預細胞后，VEGF和IL-1α基因和蛋白表達顯著降低（P＜0.05），變化幅度依次為：部位1＞部位3＞部位2。結論 糖網(wǎng)明目顆粒中苷類和黃酮類、生物堿類及有機酸類和多糖類調(diào)控高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞VEGF和IL-1α表達的作用強度依次減弱。

糖網(wǎng)明目顆粒；糖尿病視網(wǎng)膜病變；人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926；血管內(nèi)皮細胞生長因子；白細胞介素-1α

糖網(wǎng)明目顆粒用于治療糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）。本課題前期研究結果表明，糖網(wǎng)明目顆粒能明顯改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管病理學狀態(tài)，降低血管生成相關因子的蛋白和基因水平[1-2]。本實驗采用血管內(nèi)皮細胞高糖模型，進一步探討糖網(wǎng)明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926中血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）和白細胞介素-1α（IL-1α）基因和蛋白表達的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞

人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy 926購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物及提取部位

糖網(wǎng)明目顆粒處方由女貞子、烏梅、黃連、密蒙花、肉桂、黃芪、益母草組成，所用飲片購于安國市萌露中藥飲片有限公司，經(jīng)北京漢典中醫(yī)研究院劉曄老師鑒定，均符合2010年版《中華人民共和國藥典》標準。糖網(wǎng)明目顆粒提取物和不同提取部位由北京漢典中醫(yī)研究院有限公司提供，采取醇提、水提相結合方法，將各飲片中的主要藥效物質(zhì)充分提取，最后經(jīng)噴霧干燥制成提取物。其中，部位1為黃芪、女貞子、密蒙花提取物，主要含苷類和黃酮類物質(zhì)；部位2為烏梅、肉桂提取物，主要含有機酸和多糖類物質(zhì)；部位3為益母草、黃連提取物，主要含生物堿類物質(zhì)。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS），Hyclone，SH30070.03；高糖DMEM培養(yǎng)液，Hyclone，SH30022.01B；0.25%胰蛋白酶，Hyclone，SH30042.01B；DMSO，Amresco，0231）；青鏈霉素混合液，Solarbio，P1400-100；C8661-25G；RT-PCR試劑盒（TaKaRa，RR019A），ELISA試劑盒（北京鑫方程生物技術有限公司）。MCO-175二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO），BDS200倒置相差顯微鏡（奧特光學），DPL-ⅡA型噴霧制粒儀（重慶精工制藥機械有限責任公司），BIOMATE型紫外可見分光光度計（Thermo），GE4852型PCR儀（杭州柏恒科技有限公司），JY600電泳儀（北京君意東方電子設備有限公司），ChampGel 5000型全自動凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司），MULTLSKAN MK3酶標儀（Thermo）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及藥物干預

EA.hy926細胞第3代經(jīng)胰酶消化，用普通培養(yǎng)液（含10%FBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L硫酸鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液）稀釋成2.5×104/mL的細胞懸液，將3×106個細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，普通培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后空白組換用普通培養(yǎng)液、高糖組換用D-葡萄糖培養(yǎng)液體外模擬EA.hy926細胞高糖模型，全方組換用D-葡萄糖＋糖網(wǎng)明目顆粒培養(yǎng)液，部位1組換用D-葡萄糖＋部位1培養(yǎng)液，部位2組換用D-葡萄糖＋部位2培養(yǎng)液，部位3組換用D-葡萄糖＋部位3培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取總RNA。

糖網(wǎng)明目顆粒培養(yǎng)液制備：精密稱定糖網(wǎng)明目顆粒提取物0.444 4 g至50 mL離心管中，于超凈臺內(nèi)加無血清高糖DMEM培養(yǎng)液至40 mL，渦旋震蕩使藥物溶解，靜置30 min后混勻，5000 r/min離心20 min，吸取上清液，用0.45 μm濾器無菌條件下過濾，加入4.44 mL FBS，混勻制成貯存液，封口，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩４藭r，貯存液含糖網(wǎng)明目顆粒提取物濃度為10 mg/mL，含10%FBS。臨用時將貯存液梯度稀釋至所需濃度2.5 mg/mL。其中，各提取部位按照其所占處方比例、提取率折算，相當于全方劑量，工作液配制方法同糖網(wǎng)明目顆粒全方。

D-葡萄糖培養(yǎng)液的制備：精密稱定D-葡萄糖0.459 0 g至36 mL高糖DMEM培養(yǎng)液中，混勻溶解，過濾，加4 mL FBS，混勻，4 ℃封口保存。此時含葡萄糖100 mmol/L，10%FBS。臨用時用相應液體稀釋至40 mmol/L，混勻，進行細胞干預。

2.2 高糖細胞相關基因表達檢測

細胞分組及藥物干預同“2.1”項。藥物干預24 h后，按照試劑盒說明書提取總RNA，以紫外分光光度法測定其濃度，檢測其質(zhì)量。按照試劑盒說明書進行反轉錄PCR反應，條件為：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，35個循環(huán)后轉為4 ℃保存。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測上述反應產(chǎn)物，用Lane ID凝膠圖像分析軟件對PCR產(chǎn)物進行半定量分析測定，基因表達水平以β-actin為參比。PCR引物由北京賽百盛公司合成，詳見表1。

表1 基因引物序列

2.3 高糖細胞相關蛋白表達檢測

細胞分組及藥物干預同“2.1”項。藥物干預24 h后，吸取細胞上清液至預冷的1.5 mL無菌EP管中，同組混勻，封口，-80 ℃保存?zhèn)溆?。標準品按照說明書稀釋好5個梯度，各梯度每孔加樣量均為50 μL。分別設空白孔、待測樣品孔，每組3個復孔。向待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL，混勻。封板膜封板后于37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液重復洗5次，拍干。每孔加入酶標試劑50 μL。封板膜封板后37 ℃溫育30 min，如前法重復洗5次，拍干。每孔先加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應。于450 nm波長處依序測各孔吸光度值（OD值）。以標準物濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，計算直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1 糖網(wǎng)明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮細胞生長因子基因表達的影響

實驗結果顯示，血管內(nèi)皮細胞高糖誘導24 h后，VEGF基因表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；經(jīng)藥物干預24 h后，糖網(wǎng)明目顆粒全方組、部位1組和部位3組VEGF基因表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05），作用強弱順序為：部位1組＞全方組＞部位3組；而部位2組顯著上調(diào)（P＜0.05）。提示在抑制因高糖導致的血管內(nèi)皮細胞VEGF基因表達上調(diào)方面，糖網(wǎng)明目顆粒中部位1與部位3發(fā)揮了主要作用，而部位2未發(fā)揮與糖網(wǎng)明目顆粒全方相同的抑制作用。結果見圖1。

4.2 糖網(wǎng)明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮細胞生長因子蛋白表達的影響

實驗結果顯示，血管內(nèi)皮細胞高糖誘導24 h后，VEGF蛋白表達水平顯著增高（P＜0.05）；經(jīng)藥物干預24 h后，糖網(wǎng)明目顆粒全方組、部位1組和部位3組VEGF蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），作用強弱為：部位1組＞全方組＞部位3組；而部位2組顯著上調(diào)（P＜0.05）。提示在抑制因高糖導致的血管內(nèi)皮細胞VEGF蛋白表達方面，糖網(wǎng)明目顆粒中部位1和部位3發(fā)揮了主要作用，而部位2則未發(fā)揮與糖網(wǎng)明目顆粒全方相同的抑制作用。結果見圖2。

圖1 各組血管內(nèi)皮細胞VEGF基因表達（±s，n＝3）

4.3 糖網(wǎng)明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞中白細胞介素-1α基因表達的影響

實驗結果顯示，血管內(nèi)皮細胞高糖誘導24 h后，IL-1α基因表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；經(jīng)藥物干預24 h后，糖網(wǎng)明目顆粒全方組及各部位組IL-1α基因表達水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），作用強弱為：部位1組＞部位3組＞部位2組＞全方組。提示在抑制由于高糖導致的血管內(nèi)皮細胞IL-1α基因表達方面，糖網(wǎng)明目顆粒各部位作用強度為：部位1＞部位3＞部位2。結果見圖3。

圖2 各組血管內(nèi)皮細胞VEGF蛋白表達（±s，n＝3）

圖3 各組血管內(nèi)皮細胞IL-1α基因表達（±s，n＝3）

4.4 糖網(wǎng)明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞中白細胞介素-1α蛋白表達的影響

實驗結果顯示，血管內(nèi)皮細胞高糖誘導24 h后，IL-1α蛋白表達水平升高（P＜0.05）；經(jīng)藥物干預24 h后，糖網(wǎng)明目顆粒全方組及各部位組IL-1α蛋白表達水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），作用強弱為：全方組＞部位1組＞部位3組＞部位2組。提示，在抑制由于高糖導致的血管內(nèi)皮細胞IL-1α蛋白升高方面，糖網(wǎng)明目顆粒各部位的作用強度為：部位1＞部位3＞部位2。結果見圖4。

圖4 各組血管內(nèi)皮細胞IL-1α蛋白表達（s，n＝3）

5 討論

DR是糖尿病微血管病變中主要的眼部并發(fā)癥，其致盲的主要原因是由于新生血管引起反復的玻璃體出血和最終的牽引性視網(wǎng)膜脫離等一系列并發(fā)癥[3]。高血糖是糖尿病最基本的病生理狀態(tài)，亦是導致內(nèi)皮功能紊亂的根本原因。糖尿病血管內(nèi)皮細胞功能紊亂被認為是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的起始步驟[4]。研究表明，高血糖通過氧化應激導致血管內(nèi)皮細胞損傷和循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞數(shù)目下降且功能障礙，從而導致糖尿病傷口難以愈合、缺血心肌冠脈側枝形成不良[5]。而VEGF是目前所知最強的內(nèi)皮細胞選擇性促有絲分裂肽和血管生成因子，與受體結合后，可刺激血管內(nèi)皮細胞增殖及移行、細胞外基質(zhì)變性，誘導新生血管的形成。其病理改變在本質(zhì)上均是體內(nèi)動態(tài)平衡的失調(diào)，血管刺激因素增強和／或抑制因素減少使兩者平衡失調(diào)，最終引起新生血管生成?？凳系萚6]臨床觀察顯示，DR程度與血清VEGF含量直接正相關，提示血清VEGF含量測定可作為判定DR病變程度的參考指標。IL-1可能是視網(wǎng)膜炎癥引起血視網(wǎng)膜屏障損害的重要因子，其可引起多核細胞和單核細胞向視網(wǎng)膜血管外遷移，血清蛋白向玻璃體內(nèi)彌散及紅細胞向玻璃體內(nèi)滲漏等，造成視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞間出現(xiàn)許多大裂隙，使血-視網(wǎng)膜屏障出現(xiàn)缺損，導致局部水腫、滲出、出血和細胞浸潤，其對腫瘤壞死因子-α促進新生血管形成的效應也具有協(xié)同作用[7-8]。

本實驗結果顯示，糖網(wǎng)明目顆粒不同提取部位能不同程度地抑制高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞中VEGF和IL-1α基因和蛋白表達，其中以部位1作用最明顯，部位3次之，部位2無此作用或作用不明顯，這與DR發(fā)病機制和糖網(wǎng)明目顆粒組方規(guī)律一致。DR病機是氣陰兩虛，方中黃芪補氣，女貞子補肝腎明目，密蒙花清熱養(yǎng)肝、明目退翳，這3味藥在方中比例較大，補氣益肝腎，從根本上調(diào)理DR病程中之氣陰兩虛狀態(tài)。另外，氣虛致氣血瘀滯；陰虛生熱，煎熬津液，精虧液少，血黏不暢。方中益母草活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫，黃連清熱燥濕、瀉火解毒，而此2味藥所含有的生物堿類物質(zhì)如黃連素又有一定的抗炎作用，兩者共用，能調(diào)理DR病程中陰虛夾熱之瘀滯狀態(tài)，改善DR病程中炎癥反應。烏梅收斂生津止血，與黃芪配伍補氣養(yǎng)血；肉桂補火助陽活血，與黃連配伍，水火既濟，安神寧血，二者若單獨使用，從本實驗結果看藥效不明顯。

綜上，在調(diào)控因高糖導致的血管內(nèi)皮細胞VEGF和IL-1α基因和蛋白表達升高方面，糖網(wǎng)明目顆粒各部位作用強度為：部位1（苷類和黃酮類）＞部位3（生物堿類）＞部位2（有機酸和多糖類）。提示糖網(wǎng)明目顆粒及其不同提取物通過調(diào)控高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細胞的VEGF和IL-1α基因和蛋白表達，從而抑制視網(wǎng)膜新生血管形成和改善視網(wǎng)膜局部水腫、滲出、出血和細胞浸潤狀態(tài)，進而達到防治DR的目的。

[1] 蒿長英,陳明霞,郭平,等.糖網(wǎng)明目顆粒對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的防治作用及機制研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2015,22(1)：62-66.

[2] 蒿長英,陳明霞,郭平,等.糖網(wǎng)明目顆粒提取物對缺氧/高糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細胞腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1α表達的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2015,22(8)：58-62.

[3] 朱洪麗.血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)與增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變相關性的研究[D].沈陽：中國醫(yī)科大學,2008.

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Effects of Different Extracts of Tangwang Mingmu Granules on High Glucose Induced VEGF and IL-1α Expressions in Vascular Endothelial Cells

HAO Chang-ying1, CHEN Ming-xia2,

MA Wen-bin1, GUO Ping3, LV Hai-bo3, LIU Ye4, LIAN Zeng-lin4(1. Beijing Red Sun Pharmaceutical Co., Ltd., Handian Group, Beijing 100103, China; 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 3. Beijing Handian Pharmaceutical Co., Ltd, Handian Group, Beijing 100103, China; 4. Beijing Handian Academy of Chinese Medicine, Handian Group, Beijing 100103, China)

Objective To observe the mechanism of action of different extracts of Tangwang Mingmu Granules on high glucose induced VEGF and IL-1α gene and protein expressions in vascular endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cells EA.hy926 were divided into six groups: blank, high glucose, Tangwang Mingmu Granules, extract 1 (glycoside and flavonoid), extract 2 (organic acid and polysaccharides) and extract 3 (alkaloids) groups. High concentration glucose was used to establish the high glucose model in EA.hy926 cells. The expressions of VEGF and IL-1α mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR. The contents of VEGF and IL-1α protein were tested by ELISA. Results The gene expression and protein levels of VEGF and IL-1α were significantly up-regulated under the high glucose condition (P<0.05). However, the above indicators were significantly reduced after the treatment of Tangwang Mingmu Granules. The activity of different parts of Tangwang Mingmu Granules was as follows: extract 1> extract 3> extract 2. Conclusion The action intensity of glycosides and flavonoids, alkaloids, organic acids and polysaccharides on VEGF and IL-1α expression in Tangwang Mingmu Granules weakens in sequence.

Tangwang Mingmu Granules; diabetic retinopathy; human umbilical vein endothelial cells EA.hy926; VEGF; IL-1α

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.013

R285.5

A

1005-5304(2016)01-0056-04

2015-04-14)

(

2015-10-21；編輯：華強)

北京市科技計劃“十病十藥”研發(fā)項目（Z121102001112007）

連增林，E-mail：zenglinlian@aliyun.com