王貴平，李君佩，王亞楠，羅廣，胡仕鳳，李曉云

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128）

豬肺炎支原體和豬鼻支原體在屠宰豬呼吸道與血液中的分布

王貴平，李君佩，王亞楠，羅廣，胡仕鳳，李曉云

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128）

用PCR方法對(duì)從湖南省長沙市515頭屠宰豬收集的1 204份樣品（120份豬鼻拭子、254份豬支氣管拭子、515份豬支氣管肺泡灌洗液和235份豬肺、80份血液）進(jìn)行了豬肺炎支原體和豬鼻支原體檢測，并對(duì)部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體在豬支氣管灌洗液中檢出率最高（23.3%，120/515），豬鼻拭子和血液中檢出率最低（0）；豬鼻支原體在豬鼻拭子中檢出率最高（24.3%，125/515），在豬支氣管拭子中檢出率最低（2.5%，3/120）。序列分析表明：試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物與國內(nèi)已出版的相關(guān)序列有97%～100%的同源性。試驗(yàn)探明了豬肺炎支原體和豬鼻支原體在豬呼吸道與血液中的分布情況，為這兩種支原體的分離鑒定提供了依據(jù)。

豬肺炎支原體；豬鼻支原體；豬呼吸道；分布

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是豬喘氣病的主要病原。Mhp黏附于豬呼吸道纖毛上皮細(xì)胞，使纖毛的清除功能受損，繼而引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)及高傳染性的慢性呼吸道疾病，對(duì)世界范圍的養(yǎng)豬生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。豬喘氣病之所以長期存在而難以防控，原因之一是Mhp在豬體內(nèi)一般呈慢性或隱性感染而臨床癥狀不明顯，豬長期帶菌成為傳染源[3-4]。豬肺炎支原體通常被認(rèn)為是該病的病原，但是最新研究表明豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis,Mhr）也能引起典型的豬支原體肺炎病變[5]。Mhp和Mhr常從沒有感染其他微生物的豬肺中進(jìn)行分離鑒定。但是隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；l(fā)展，符合要求的豬肺日益難以獲得。本試驗(yàn)探明了Mhp和Mhr在豬體內(nèi)的分布情況，為探索新的分離鑒定方法（如從灌洗液中分離Mhp）奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

2015年1月，從湖南省某屠宰場采集1 204份豬樣品。樣品采集收送湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院檢測。豬鼻拭子和豬支氣管拭子：用無菌的棉簽分別在屠宰豬鼻孔和氣管管壁中來回涂擦3次，然后在含有1.5 mL KM2液體培養(yǎng)基的EP管中劇烈攪動(dòng)，棄去棉簽；豬支氣管肺泡灌洗液：將50 mL無菌的PBS（pH 7.8）灌入豬支氣管中，來回顛倒3次后收集液體（約10～30 mL）。豬肺樣品：在豬肺尖葉切割一小塊肺臟；豬血液樣品：在豬屠宰放血時(shí)用無菌離心管收集20～30 mL。

1.2 試劑

KM2液體培養(yǎng)基：購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。PCR引物：根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5]，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成（表1）。

表1 本試驗(yàn)所用的引物

1.3 PCR模板制備和PCR擴(kuò)增

按相關(guān)文獻(xiàn)[6]制備和進(jìn)行。

1.4 序列分析和呈送GenBank

將2份Mhp 16S rRNA基因擴(kuò)增的產(chǎn)物和1份Mhr P37基因擴(kuò)增的產(chǎn)物送華大基因武漢中心測序，并用BLAST軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PAGETYPE）和國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表的序列進(jìn)行同源性比較。將測得的序列用Bankit方法呈送至NCBI基因庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

從陽性樣品中分別擴(kuò)增出大小約649 bp和346 bp特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 PCR鑒定結(jié)果

2.2 測序與同源性分析

測序結(jié)果已經(jīng)成功呈送至GenBank，序列號(hào)分別是GU569848、GU569849（Mhp 16S rRNA基因）和GU722587（Mhr P37基因）。同源性分析表明與國內(nèi)外相關(guān)序列有97%～100%的同源性。

2.3 Mhp在豬呼吸道和血液中的分布

從表2可以看出，Mhp總陽性率是24.6%（127/ 515）。冬季陽性率最高（79.2%，95/120），夏季最低（0）。在不同的樣品中，支氣管肺泡灌洗液檢出率最高（23.3%，120/515），鼻拭子和血液檢出率最低（0）。

2.4 Mhr在豬呼吸道和血液中的分布

從表3可以看出，Mhr總陽性率是25.8%（133/ 515）。冬季陽性率最高（82.5%，99/120），秋季最低（0）。在不同的樣品中，鼻拭子檢出率最高（24.3%，125/515），支氣管拭子檢出率最低（2.5%，3/120）。

表2 豬肺炎支原體在豬呼道和血液中的檢出率

表3 豬鼻支原體在豬呼吸道和血液中的檢出率

3 討論

（1）本試驗(yàn)首次就Mhp和Mhr在屠宰豬呼吸道與血液中的分布進(jìn)行了探究。豬肺炎支原體在豬上呼吸道（鼻拭子）檢出率為0。隨著呼吸道深入，Mhp的檢出率逐漸升高（支氣管拭子，7.1%），在支氣管處檢出率升至最高（支氣管肺泡灌洗液，23.3%），然后逐步降低（肺，18.7%）。Mhr在上呼吸道檢出率最高（鼻拭子，24.3%），而在中呼吸道逐漸降低（支氣管拭子，2.5%），然后逐步升高（支氣管肺泡灌洗液，6.7%；肺，17.8%）。

（2）從季節(jié)分布看Mhp和Mhr在冬季的檢出率明顯高出其他季節(jié)，這和豬喘氣病的流行病學(xué)是一致的。建議從冬季的鼻拭子中檢測和分離Mhr，從冬季的支氣管肺泡灌洗液和豬肺中檢測和分離Mhp。

（3）Mhr是豬喘氣病最常見的繼發(fā)菌，可以伴發(fā)豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎。本試驗(yàn)首次從血液中檢出了Mhr，為證實(shí)Mhr從血液中循環(huán)到關(guān)節(jié)提供了堅(jiān)實(shí)的依據(jù)。

[1]李彥偉，劉茂軍，武昱孜，等.豬肺炎支原體致病機(jī)理研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（8）：84-88.

[2]Moitinho-Silva L,Heineck B L,Reolon L A,et al.Mycoplasma hyopneumoniae typeⅠsignal peptidase：expression and evaluation of its diagnosetic potential[J].Vet Microbiol,2012,154(3/4)：282-291.

[3]Vangroenweghe F A,Labarque G G,Piepers S,et al.Mycoplasma hyopneumoniae infections in peri-weaned and postweaned pigs in belgium and the netherlands：prevalence and associations with climatic conditions[J].Vet J,2015,205(1)：93-97.

[4]Caron J,Ouardani M,Dea S.Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes[J].J Clin Microbiol,2000,38(4)：1390-1396.

[5]Lin J H,Chen S P,Yeh K S,et al.Mycoplasma hyorhinis in Taiwan：diagnosis and isolation of swine pneumonia pathogen[J].Vet Microbiol,2006,115(1-3)：111-116.

[6]王貴平，胡仕鳳，鄧治邦.豬胸膜肺炎放線桿菌和豬肺炎支原體混合感染的診治[J].養(yǎng)豬，2009（6）：57-59.

（編輯：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2016)01-0119-02

2015-12-31

湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金資助科研項(xiàng)目（13B050）

王貴平（1973-），男，湖北咸寧人，副教授，博士，研究方向?yàn)樨i細(xì)菌性傳染病.E-mail：wanggp003@163.com