王紅寶，郭雪麗，李紅麗，吉濤，楊晉青，王志俊，韓惠瑛，段亞娜，鄭明學，古少鵬

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；2.山西省動物疫病預防控制中心，太原030027；3.山西農(nóng)業(yè)大學，晉中030801）

豬鏈球菌與豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染的診斷研究

王紅寶1，郭雪麗1，李紅麗1，吉濤1，楊晉青1，王志俊1，韓惠瑛2，段亞娜1，鄭明學3，古少鵬3

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；2.山西省動物疫病預防控制中心，太原030027；3.山西農(nóng)業(yè)大學，晉中030801）

通過細菌學檢查、ELISA試劑盒檢測、陽性豬場RT-PCR檢測、病理剖檢和病理組織學觀察，對部分地區(qū)流行的以繁殖障礙、高熱、呼吸異常、耳朵發(fā)紺、皮膚發(fā)紅等癥狀的病豬或病死豬病因進行了探討，初步認為這次疾病的流行是由豬鏈球菌與豬繁殖與呼吸綜合征混合感染造成的，混合感染加重了此次疫情所造成的損失。

豬鏈球菌；豬繁殖與呼吸綜合征；混合感染；診斷；研究

豬鏈球菌病（Streptococcus suis,SS）是由多種致病性豬鏈球菌感染引起的一種常見的豬傳染病，早在20世紀50年代，在英國和荷蘭就有人報道了豬群中有鏈球菌病的發(fā)生，1998年在江蘇、2005年在四川資陽及周邊地區(qū)發(fā)生豬鏈球菌病，導致幾十萬余頭豬死亡，并引起人感染發(fā)病甚至死亡，給人類的健康帶來了巨大威脅[1-4]。該病一年四季均可發(fā)生，5～11月份較多見，在豬群中常見散發(fā)或呈地方性流行[5-6]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)實踐中，豬鏈球菌病常常被養(yǎng)豬生產(chǎn)者所忽視，而導致“高熱病”發(fā)病豬場大批豬發(fā)病死亡的直接性致病病因，大多是由于豬鏈球菌的感染，給豬場帶來重大損失。近十多年來很多豬場不明病因的種豬繁殖障礙現(xiàn)象，也被證明與豬鏈球菌感染有關[7-8]。豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由病毒引起的一種接觸性傳染病，又名豬藍耳病。1987年首次在美國發(fā)現(xiàn)[9]，1996年郭寶清等在我國首次分離到藍耳病病毒（PRRSV）[10-11]，近幾年該病在我國部分省市已廣為流行。該病各種年齡的豬均可發(fā)病，但病情、癥狀差異較大，主要特征是母豬呈現(xiàn)發(fā)熱、流產(chǎn)、木乃伊胎、死產(chǎn)、弱仔等癥狀；仔豬表現(xiàn)異常呼吸癥狀和高死亡率[12-14]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染對豬鏈球菌病具有“引爆”和“放大”效應，給很多豬場豬的疾病防控帶來很大困擾。

筆者自2011年以來，對山西呂梁、臨汾、晉城等部分地區(qū)規(guī)?；i場流行的一種以繁殖障礙、高熱、呼吸異常、耳朵發(fā)紺、皮膚發(fā)紅等癥狀的病豬或病死豬，經(jīng)流行病學調查、臨床癥狀、病理解剖及實驗室檢測，確診為豬鏈球菌混合感染豬繁殖與呼吸綜合征?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 血樣的采集與處理

采集不同發(fā)病地區(qū)發(fā)病急、傳染快、死亡率高；眼瞼水腫，眼結膜潮紅，流淚，鼻鏡干燥；繁殖障礙、高熱、呼吸異常、耳朵發(fā)紺、皮膚發(fā)紅等癥狀的病豬的血清。肥育豬及仔豬前腔靜脈采血（母豬耳靜脈采血），每份血樣3～5 mL，于離心管中靜置30 min，待血清析出后，干冰冷藏送至實驗室，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌學檢查

（1）取心血涂片，進行革蘭氏染色，顯微鏡檢查。

（2）取心血分別接種鮮血瓊脂平板，營養(yǎng)瓊脂平板，麥康凱平板。37℃需氧培養(yǎng)24 h后，挑取可疑菌落接種于改良馬丁肉湯，37℃培養(yǎng)24 h后，革蘭氏染色，鏡檢。

（3）隨機抽取細菌血清肉湯培養(yǎng)物，分別做糖發(fā)酵試驗、乙酰甲基甲醇試驗（Voges-Prokauer reaction，V-P）、甲基紅（Methyl Red，M.R）試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、吲哚（靛基質）試驗等生化試驗。

（4）將細菌按5×108～10×108CFU細菌/鼠的劑量腹腔接種4只20 g/只左右的小白鼠，觀察48 h。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme linked immunos orbent assay,ELISA）試劑盒檢測分別應用豬繁殖與呼吸綜合征和鏈球菌病ELISA試劑盒檢測抗體。ELISA檢測方法分別按其試劑盒要求方法進行操作。

將試劑盒中試劑恢復至室溫（18～25℃），輕輕旋轉或振蕩混合。1）取出抗原包被板，在記錄表上記錄樣本的位置；2）在包被孔內加入100 μL未稀釋的陰性對照，每次設定2個陰性對照孔；3）在包被孔內加入100 μL未稀釋的陽性對照，每次設定2個陽性對照孔；4）在相應的孔中加入100 μL 40倍稀釋血清樣本；5）18～25℃孵育30 min；6）吸棄各孔的液體，然后加300 μL洗滌液，自動洗板洗滌4次；7）每孔加入100 μL辣根過氧化酶標記的抗豬IgG抗體；8）18～28℃孵育30 min；9）重復步驟6；10）每孔加入100 μL TMP底物液；11）18～25℃孵育15 min；12）每孔加入100 μL終止液，終止反應；13）置酶標儀650 nm處測量并記錄各孔吸光值A；14）統(tǒng)計并分析結果。

1.2.3 豬繁殖與呼吸綜合征陽性豬場RT-PCR檢測

用TaKaRa RNAiso Reagent提取血清中的總RNA，用PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2對所提取的RNA進行RT-PCR擴增。具體反應程序為：42℃45 min，95℃3 min，1個循環(huán)；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.3 病理學研究

追蹤調查流行情況以及臨床癥狀。無菌取病豬、病死仔豬及母豬和流產(chǎn)胎兒、新生發(fā)病和病死仔豬的鼻甲骨黏膜、心、肝、脾、腎和肺臟等組織于10%福爾馬林液中固定，石蠟包埋，切片，H.E染色，鏡檢。

1.4 試劑

PRRSV Antibo dy Test Kit和Streptococcus Suis Antibo dy Test Kit均購自IDEXX公司；RNAiso Reagent和PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2購自TaKaRa生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 結果

2.1 細菌學檢查結果

（1）取心血涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢，可見單個或成對的革蘭氏陽性球菌。

（2）取心血分別接種鮮血瓊脂平板、麥康凱平板、營養(yǎng)瓊脂平板、改良馬丁肉湯等，培養(yǎng)后，革蘭氏染色，顯微鏡檢查，結果發(fā)現(xiàn)：血液瓊脂中形成光滑、邊緣整齊、半透明小菌落，周圍呈β溶血；在麥康凱瓊脂平板上不生長。在營養(yǎng)瓊脂上生長不好。該菌在改良馬丁肉湯中底部有沉淀，在血清肉湯中先均勻渾濁，后在試管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

（3）在葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、山梨醇、衛(wèi)矛醇等培養(yǎng)基中均為陽性，在水楊苷、菊糖、棉子糖、側金盞花醇等培養(yǎng)基中呈陰性。乙酰甲基甲醇試驗（V-P）、甲基紅（M.R）試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、吲哚（靛基質）試驗等試驗為陰性，均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的菌均為豬鏈球菌。

（4）4只接種病料的小白鼠，48 h內全部死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟腫大，并從死亡小鼠的心血、脾臟分離到革蘭氏陽性的鏈球菌，確診為致病性鏈球菌。

2.2 血清學調查

2.2.1 豬鏈球菌和豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測結果豬鏈球菌和豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測結果見表1。

表1 來自不同地區(qū)病豬血清的豬鏈球菌和豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測結果

2.2.2 抗PRRSV抗體變化趨勢PRRSV持續(xù)性感染豬群的PRRS抗體動態(tài)曲線見圖1。圖中縱坐標為S/P值，PRRS抗體的陽性/陰性通過計算樣品與陽性對照（S/P）的比值進行判定。S/P值低于0.4樣品判定為PRRS抗體陰性，S/P值大于或等于0.4樣品判定為PRRS抗體陽性。從圖中可以看出整個群體抗PRRSV抗體均為陽性，S/P值均在1.0以上，第9周抗體水平上升至2.0以上。

圖1 PRRSV持續(xù)性感染豬群的PRRS抗體動態(tài)曲線

2.3 豬繁殖與呼吸綜合征陽性豬場RT-PCR結果

根據(jù)檢測結果表明，檢測出的陽性片段分別為410 bp和500 bp，見圖2。經(jīng)基因測序結果發(fā)現(xiàn)檢測出的陽性片段為PRRSV的Nsp2基因片段，其中410 bp為PRRSV變異株，500 bp為PRSSV普通株，普通株僅占30%，其他均為變異株。豬群血清陽性檢出率為51.26%。

圖2 豬繁殖與呼吸綜合征陽性豬場PRRSV RT-PCR結果

2.4 病理學檢查結果

2.4.1 臨床癥狀病豬主要表現(xiàn)為高熱（41℃左右），而且高熱持續(xù)不退，皮膚出現(xiàn)紅斑等癥狀。繁殖母豬反復表現(xiàn)出呼吸加速，食欲不振。有的患病母豬耳朵、腹部、乳頭、外陰、尾部和腿發(fā)紺，耳朵發(fā)紺的患病豬多出現(xiàn)在耳尖部分。患病的懷孕豬在懷孕晚期發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、弱仔、死胎或木乃伊胎；仔豬1月齡內最易感染，表現(xiàn)的癥狀較明顯，死亡率高。大多數(shù)新生仔豬患病后表現(xiàn)呼吸困難（腹式呼吸），后肢麻痹，肌肉震顫等癥狀。肥育豬或種公豬發(fā)病率較低，僅為5%左右，發(fā)病后表現(xiàn)為咳嗽、呼吸急促、發(fā)熱等癥狀，有的病豬表現(xiàn)出皮膚出血，耳朵、背部或體表發(fā)紫。

2.4.2 尸體剖檢及病理組織學觀察病豬及病死豬剖解后可見肺出血、水腫，心外膜和心內膜點狀出血；脾出血，有的出現(xiàn)灰白色壞死灶；腎臟及膀胱黏膜有點狀出血。淋巴結腫脹，呈大理石樣外觀；死胎全身發(fā)紫，臍帶出血、擴張。

病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)病豬或病死豬主要表現(xiàn)為彌漫性間質性肺炎，肺泡壁、小葉間顯著增寬，有大量淋巴細胞和巨噬細胞浸潤、水腫。腎臟主要表現(xiàn)皮質部腎小球毛細血管叢呈嚴重充血和出血，毛細血管內皮腫脹或增生，毛細血管腔內經(jīng)常見有均質紅染的透明血栓。腎小管間間質血管也表現(xiàn)充血或出血，間質增生，血管周圍見有淋巴細胞浸潤。

3 小結與討論

（1）根據(jù)追蹤調查，本次流行的以繁殖障礙、高熱、呼吸異常、耳朵發(fā)紺、皮膚發(fā)紅等癥狀的病豬或病死豬，最早發(fā)生于2011年5月份某地區(qū)的個別養(yǎng)豬場，7月份面積逐漸擴大，到9月份后流行趨緩、發(fā)病減少，10月份仍有個別發(fā)生。8～9月份是此次以繁殖障礙、高熱、呼吸異常、耳朵發(fā)紺、皮膚發(fā)紅等癥狀的豬病流行的高峰期。分析認為發(fā)病的主要原因是因為豬場從外場調入生豬時帶來病原所致，從而造成本次疾病的流行。本次疾病傳播迅速，各種年齡的豬都有發(fā)病，發(fā)病率高，仔豬死亡率高；發(fā)病時間較長，從半個月到3個月；懷孕母豬發(fā)病后流產(chǎn)、產(chǎn)死胎嚴重；病豬臨床特征是出現(xiàn)“無名高熱”，病程后期臨床癥狀表現(xiàn)復雜。

（2）豬鏈球菌病一般不單獨發(fā)病，常常與其它疾病并發(fā)或互為繼發(fā)感染。本次流行的臨床以“無名高熱型”為主的疾病傳播迅速、死亡率也比較高，給養(yǎng)殖戶造成了嚴重的損失，主要是豬鏈球菌病與豬繁殖與呼吸綜合征混合感染所致，其表現(xiàn)癥狀在臨床實踐中往往會被誤認為主要是豬繁殖與呼吸綜合征或主要是豬鏈球菌病的感染。豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染對豬鏈球菌病具有“引爆”和“放大”效應，給很多豬場豬的疾病防控帶來很大困擾。

（3）從不同地區(qū)部分“高熱征”病死豬機體中檢測到的病原還有大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等。

（4）豬繁殖與呼吸綜合征病毒持續(xù)性感染情況非常復雜，因為在感染階段抗體水平較高，但中和抗體是否與病毒發(fā)生相互作用并不十分清楚，用當前的PCR和ELISA檢測手段很難如實反映其感染的真實情況[15]。

（5）研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，PRRSV的抗體具有依賴性增強作用，抗PRRS抗體可以通過Fc受體增強PRRSV感染，豬群在隱性感染階段抗體水平普遍較高，比較容易檢出病毒，其發(fā)生機制有待進一步研究。

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（編輯：郭玉翠）

低脂飲食并非最佳減肥方式

【英國《每日郵報》網(wǎng)站10月30日報道】題：低脂飲食無效：在表示沒有證據(jù)表明減少脂肪攝入有助減肥后，科學家對流傳多年的健康建議提出質疑

今天一項大型研究稱，低脂飲食并非最佳減肥方式，從而對流傳數(shù)十年的健康建議提出質疑。

科學家們表示，沒有證據(jù)支持人們應該減少飲食中的脂肪量這一教條。

這一研究對英國國民保健制度（NHS）32年前給出的指導意見提出了問題—NHS警告民眾避免攝入黃油、全脂牛奶和其他高脂食物。

哈佛大學的研究人員說，衛(wèi)生部門官員應該提出主要關注每份食物重量及未加工食物的簡單指導意見，而不是關注于脂肪、碳水化合物和蛋白質。

研究帶頭人戴爾德麗·托拜厄斯博士說：“沒有確鑿證據(jù)表明，應該建議人們采用低脂飲食?！边@一研究基于超過6.8萬名成年人的數(shù)據(jù)。

托拜厄斯說：“盡管人們普遍接受的教條是，要減輕體重就需要減少脂肪攝入量，但并沒有科學證據(jù)證明，就長期減肥而言，低脂飲食優(yōu)于其他飲食干預措施?！?/p>

1983年，英國政府發(fā)布指導意見，建議英國人將脂肪攝入量減至總能量的30%，并增加碳水化合物的攝入。

批評人士說，這導致“特種”食品大量增加，使人們癡迷于卡路里計算，并催生出龐大的減肥產(chǎn)業(yè)。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，并非所有種類的脂肪都是有害的，其中一些脂肪能夠在保護心臟和減輕體重方面扮演重要角色。

現(xiàn)在人們對地中海飲食的興趣越來越強，而地中海飲食中既包括水果、蔬菜和全谷類，也包括橄欖油、魚和堅果等眾多高脂食物。

哈佛大學的這一研究團隊發(fā)現(xiàn)，要減輕體重，減少脂肪攝入量不如低碳水化合物飲食或地中海飲食有效。

研究人員整理了此前53項比較低脂飲食有效性的試驗的資料，并把研究結果發(fā)表在《柳葉刀·糖尿病和內分泌學雜志》上。

研究顯示，在12個月期間，與低脂飲食人士相比，低碳水化合物飲食人士平均多減重1.15千克。

研究人員發(fā)現(xiàn)，只有與“慣常飲食”（即不改變飲食習慣）的人士相比，低脂飲食者減重較多，平均多減了5.41千克。

（轉自參考消息[N]，2015-11-02）

Study on Diagnosis of Mixed Infection of Streptococcus Suis and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

WANG Hongbao1,GUO Xueli1,LI Hongli1,JI Tao1,YANG Jinqing1,WANG Zhijun1,HAN Huiying2, DUAN Yana1,ZHENG Mingxue3,GU Shaopeng3
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030032, China;2.Animal Disease Prevention and Control Center in Shanxi Province,Taiyuan 030027,China; 3.Shanxi Agricultural University,Jinzhong 030801,China)

By bacteriology examination,ELISA,RT-PCR detection in positive pig,pathological autopsy,pathological and histological observation.The symptom and causes such as reproductive disorder,high fever,abnormal breathing,cyanosis ears,skin redness of disease of pigs or dead pigs causes of popular in some areas were discussed in this paper.The preliminary conclusion is that an epidemic of this disease is by streptococcus suis and porcine reproductive and respiratory syndrome caused by mixed infection,mixed infection increased the losses caused by the disease.

streptococcus suis;porcine reproductive and respiratory syndrome virus;mixed infection;diagnosis; study

S858.28

A

1002-1957(2016)01-0113-04

2015-12-08

山西省農(nóng)業(yè)科學院科技攻關項目（2012ygg35）

王紅寶（1968-），男，山西翼城人，副研究員，主要從事動物疾病診斷和防治研究.E-mail：sxnkywhb@163.com

郭雪麗，副研究員.E-mail：sxnkygxl1969@163.com