董蓮花，李杰，蔣明，陳斌

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128）

豬GPR40基因的多態(tài)性及其對(duì)肉質(zhì)性狀的影響

董蓮花1，2，李杰1，2，蔣明1，2，陳斌1，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128）

試驗(yàn)以杜洛克豬、大白豬、大圍子豬、沙子嶺豬、桃源黑豬、五指山豬和杜長(zhǎng)大商品豬為試驗(yàn)材料，通過測(cè)序和PCR-RFLP的方法對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體40基因（GPR40）的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，并分析該基因?qū)ωi肉質(zhì)性狀的影響。結(jié)果表明，在GPR40基因外顯子606位點(diǎn)存在A-G突變，該位點(diǎn)除了大圍子豬和杜洛克豬外，其余5個(gè)豬種均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；在肉質(zhì)性狀上，GPR40基因606A-G位點(diǎn)貯存損失AA型和GG型差異不顯著，而AG型顯著低于AA型和GG型；肉色等級(jí)與肉質(zhì)色度，AA型和AG型差異不顯著，但都顯著高于GG型。推測(cè)GPR40基因可能是一個(gè)影響豬肉色的分子遺傳標(biāo)記。

GPR40；限制性內(nèi)切酶；多態(tài)性；肉質(zhì)性狀

我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，同時(shí)也是豬肉消費(fèi)大國(guó)，豬肉在我國(guó)的日常飲食中有著舉足輕重的地位。隨著社會(huì)的發(fā)展、人們生活水平的提高及口味選擇的變化，人們對(duì)豬肉品質(zhì)的要求越來越高，育種工作者的育種重點(diǎn)也由降低豬背膘厚、提高瘦肉率等向提高豬肉風(fēng)味、口感及營(yíng)養(yǎng)等方面發(fā)生轉(zhuǎn)變[1]。研究表明，肉質(zhì)的風(fēng)味、多汁性和嫩度與肌內(nèi)脂肪含量直接相關(guān)[2]，因此一些與脂肪代謝平衡及脂肪沉積相關(guān)的基因也成為肉質(zhì)分子選育的重要候選基因。

G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein couple receptors, GPCRs），又稱為7α螺旋跨膜受體蛋白，是體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)超家族。GPCRs蛋白的肽鏈包括7個(gè)跨膜α螺旋、1個(gè)N末端、1個(gè)C末端、3個(gè)胞外環(huán)和3～4個(gè)胞內(nèi)環(huán)，GPCRs能與胞內(nèi)的G蛋白結(jié)合并激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路[3]。G蛋白偶聯(lián)受體40（G protein-coupled receptor 40,GPR40）是發(fā)現(xiàn)較晚的一種G蛋白偶聯(lián)受體，它可被中、長(zhǎng)鏈脂肪酸所激活，故又被稱為游離脂肪酸受體1（Free fat acid receptor 1,FFAR1）[4]。作為游離脂肪酸（Free fatty acid,FFAs）的受體，GPR40在脂肪代謝平衡中具有重要作用。此外，研究顯示，長(zhǎng)鏈脂肪酸（long chain fatty acids,LCFAs）在細(xì)胞中和GPR40結(jié)合后，利用胞外途徑來放大葡萄糖的刺激從而分泌胰島素而阻斷GPR40表達(dá)，能減弱FFAs的刺激，最終使胰島素分泌降低[5]。本試驗(yàn)以杜洛克、大白豬、沙子嶺豬、五指山豬、大圍子豬、桃源黑豬和杜長(zhǎng)大商品豬為研究對(duì)象，采用PCR-RFLP方法對(duì)GPR40基因進(jìn)行多態(tài)性分析，并將其與肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，旨在挖掘與肉質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的遺傳分析標(biāo)記，為生豬育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2013—2014年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)豬耳樣采自于正虹原種豬場(chǎng)、益陽(yáng)農(nóng)科所種豬場(chǎng)和地方品種豬種豬場(chǎng)。其中正虹原種豬場(chǎng)大白豬71頭、杜長(zhǎng)大65頭；益陽(yáng)農(nóng)科所種豬場(chǎng)杜洛克47頭、大白豬62頭；地方豬品種五指山豬47頭、大圍子豬45頭、桃源黑豬48頭、沙子嶺豬15頭。剪取試驗(yàn)豬小塊耳組織放入滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，加入70%的酒精，放于-20℃用于提取DNA。隨機(jī)選取平均體重達(dá)到100 kg左右時(shí)的72頭大白豬進(jìn)行屠宰測(cè)定。

1.3 基因組DNA提取與檢測(cè)

苯酚/氯仿法提取基因組DNA后，TE溶解，采用Nanodrop 2000核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度及純度，-20℃保持備用。

1.4 性狀測(cè)定

對(duì)屠宰的試驗(yàn)豬測(cè)定其嫩度、肉色、pH、滴水損失、失水率、熟肉率、大理石紋等指標(biāo)，指標(biāo)測(cè)定在屠宰現(xiàn)場(chǎng)和畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。其中肉色采取傳統(tǒng)評(píng)分和色差儀兩種方法測(cè)量，色差儀測(cè)量肉質(zhì)色度。

1.5 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上公布的豬GPR40基因mRNA序列（XM_003127043.1），利用NCBI和BLAST程序在線比對(duì)獲得豬GPR40外顯子序列，利用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工有限公司合成，引物信息見表1。

表1 GPR40基因引物

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，68℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 SNP位點(diǎn)檢測(cè)

分別選取杜洛克豬、大白豬、大圍子豬、沙子嶺豬、桃源黑豬、五指山豬和杜長(zhǎng)大商品豬各10個(gè)DNA混池，以DNA混池為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選取特異性高、條帶明亮單一的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)序反應(yīng)由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

測(cè)序結(jié)果用DNAStar7.1軟件比對(duì)尋找SNP位點(diǎn)，然后繼續(xù)通過DNAStar7.1軟件分析確定限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。

1.7 擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切

1.7.1 限制性內(nèi)切酶的選擇使用DNAStar7.1軟件對(duì)包括SNP位點(diǎn)在內(nèi)的4～7個(gè)堿基選擇內(nèi)切酶，盡量保證除SNP位點(diǎn)外，DNA片段的其他片段區(qū)域內(nèi)無該內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，如存在多個(gè)酶切位點(diǎn)，必須保證不用基因型DNA酶切后片段大小能通過電泳區(qū)分開來，以便區(qū)分基因型。利用DNAStar7.1軟件選出的內(nèi)切酶見表2。

表2 GPR40基因的限制性內(nèi)切酶

1.7.2 酶切反應(yīng)體系和反應(yīng)條件GPR40 606A-G位點(diǎn)TaiⅠ酶切反應(yīng)體系：酶切反應(yīng)總體系為15 μL，10×Buffer Tango緩沖液1.5 μL，TaiⅠ（10 U/μL）0.15 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，其余的用超純水補(bǔ)齊，65℃水浴4～6 h。酶切反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Excel 2010軟件分別計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，判斷多態(tài)位點(diǎn)是否偏離Hardy-Weinberg平衡，且根據(jù)GPR40各位點(diǎn)在所選豬種中的分布情況，計(jì)算所選豬群樣本的遺傳雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）和有效等位基因數(shù)（Ne）。統(tǒng)計(jì)屠宰測(cè)定豬的基因型，再結(jié)合肉質(zhì)測(cè)定結(jié)果，用SAS9.2軟件進(jìn)行方差分析，估計(jì)不同基因型的最小二乘均值。分析所采用的模型（GLM）如下：Yijkn=μ+hi+lj+gk+εijkn，其中Yijkn為肉質(zhì)性狀表型值，μ為總體均值，hi為豬場(chǎng)效應(yīng)，lj為時(shí)間效應(yīng)，gk為GPR40基因基因型對(duì)肉質(zhì)性狀的效應(yīng)，εijkn是隨機(jī)誤差的效應(yīng)，服從正態(tài)分布（0，σ2）。

2 結(jié)果

2.1 突變位點(diǎn)分析

用DNAStar 7.1軟件比對(duì)GPR40基因的測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPR40基因外顯子606位點(diǎn)存在A→G突變。經(jīng)分析，該突變引起了編碼的氨基酸的變化，使編碼的氨基酸由異亮氨酸Ile（AUA）突變成蛋氨酸Met（AUG），具體情況見圖1。

圖1 GPR40基因突變位點(diǎn)測(cè)序

2.2 GPR40基因外顯子區(qū)606A-G多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)TaiⅠ酶切后會(huì)產(chǎn)生204 bp、483 bp 2個(gè)大小的片段。酶切產(chǎn)物經(jīng)過電泳后得到3種帶型，其中GG型含有204 bp和483 bp 2種條帶，AG型含有204 bp、483 bp和687 bp 3種條帶，AA型只有687 bp 1種條帶。電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2 GPR40基因外顯子區(qū)TaiⅠ-RFLP酶切電泳結(jié)果

2.3 GPR40基因多態(tài)位點(diǎn)在不同豬種中的分布

由表3可知，GPR40基因606 A-G位點(diǎn)除沙子嶺豬不存在多態(tài)性，杜洛克豬、大白豬、大圍子豬、桃源黑豬、五指山豬和杜長(zhǎng)大商品豬都存在遺傳多態(tài)性，大圍子豬未檢測(cè)到AA型。從基因頻率可以看出，在外來豬種中，A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。等位基因A的頻率大白豬最高（0.834 6），其次是杜洛克（0.627 7）和杜長(zhǎng)大商品豬（0.561 5），大圍子豬最低（沙子嶺豬除外）。在地方豬種中除五指山豬外等位基因G的頻率均高于等位基因A，桃源黑豬的等位基因G頻率最高達(dá)到0.927 1。通過對(duì)各品種試驗(yàn)豬的基因型分布適合性χ2檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，大白豬、五指山豬、桃源黑豬、沙子嶺豬和杜長(zhǎng)大商品豬都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明在該位點(diǎn)這幾個(gè)品種（組合）處于隨機(jī)交配的穩(wěn)定狀態(tài)。而地方品種大圍子豬和外來品種杜洛克豬不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表3 GPR40 606A-G位點(diǎn)基因型頻率和基因頻率

由表4可知，GPR40基因606A-G位點(diǎn)各豬種（組合）的遺傳純合度都高于0.5，其中沙子嶺豬處于完全純合狀態(tài)，外來豬種中大白豬的純合度較高（0.720 6），地方豬種中桃源黑豬的遺傳純合度最高（0.864 8）。從有效等位基因數(shù)上看，GPR40基因606A-G位點(diǎn)有效等位基因數(shù)變化趨勢(shì)為五指山豬>杜長(zhǎng)大>大圍子豬>杜洛克>大白豬>桃源黑豬>沙子嶺豬，和試驗(yàn)群體的遺傳雜合度和多態(tài)信息含量變化一致。在多態(tài)信息含量上，五指山豬、大圍子豬、杜洛克、杜長(zhǎng)大均處于0.25～0.5之間，該4個(gè)品種在此位點(diǎn)具有遺傳多態(tài)性，且具有較大的遺傳變異。其他3個(gè)品種的多態(tài)信息含量都低于0.25，為低度多態(tài)性，其中沙子嶺豬不具有多態(tài)性。

表4 GPR40 606A-G位點(diǎn)遺傳多態(tài)性分析

2.4 GPR40基因多態(tài)位點(diǎn)對(duì)豬肉質(zhì)性狀的影響

由表5可知，GPR40基因606A-G位點(diǎn)對(duì)貯存損失、肉色等級(jí)和肉質(zhì)色度3個(gè)性狀的影響達(dá)到了顯著性水平，而對(duì)其他性狀未發(fā)現(xiàn)顯著性影響。在貯存損失性狀上，AA型和GG型無顯著差異（P> 0.05），AG型與AA型和GG型差異均顯著（P< 0.05），AG型比AA型和GG型分別低29.54%和33.17%。在肉色等級(jí)性狀和肉質(zhì)色度性狀上基因型差異一致，均為AA型和AG型差異不顯著，而GG型與AA型和AG型均差異顯著；GG型個(gè)體的肉色等級(jí)比AA型和AG型個(gè)體分別低8.59%和7.53%，GG型個(gè)體在肉質(zhì)色度性狀上比AA型和AG型分別低35.43%和34.57%。

表5 GPR40 606A-G位點(diǎn)對(duì)豬肉質(zhì)性狀的影響

3 討論

3.1 GPR40基因遺傳結(jié)構(gòu)分析

G蛋白偶聯(lián)受體（GPR40）也稱游離脂肪酸受體1（FFAR1），是中、長(zhǎng)鏈游離脂肪酸的內(nèi)源性受體，它介導(dǎo)了游離脂肪酸對(duì)葡萄糖刺激的胰島素分泌雙時(shí)相效應(yīng)[6]。研究顯示，GPR40基因與2型糖尿病及肥胖有重大關(guān)聯(lián)[7-8]。

本試驗(yàn)檢測(cè)了杜洛克豬、大白豬、大圍子豬、沙子嶺豬、桃源黑豬、五指山豬和杜長(zhǎng)大商品豬GPR40基因TaiⅠ酶切位點(diǎn)的基因（型）頻率，并對(duì)基因型在不同品種（組合）中的分布進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在該多態(tài)性位點(diǎn)上杜洛克豬和大圍子豬不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，其原因可能為兩品種豬試驗(yàn)樣本數(shù)不夠，或?yàn)樵撈贩N豬長(zhǎng)期選育的結(jié)果，其他5個(gè)品種均符合Hardy-Weinberg平衡，說明樣本具有代表性。

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外來品種杜洛克和大白豬中，處于優(yōu)勢(shì)地位的是A等位基因，而杜長(zhǎng)大中等位基因A和等位基因G相差不大（A為0.561 5、G為0.438 5），這可能跟未檢測(cè)的長(zhǎng)白豬的基因頻率分布有關(guān)。地方品種中，桃源黑豬和沙子嶺豬等位基因G占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其中桃源黑豬中G等位基因達(dá)到0.927 1，而沙子嶺豬在檢測(cè)的樣本中更是達(dá)到100%的G等位基因，是否沙子嶺豬均為G等位基因還有待加大樣本量進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證；五指山豬和大圍子豬兩種等位基因基因頻率相差不大。從基因型頻率分布情況來看，AA型和AG型在杜洛克豬、大白豬和杜長(zhǎng)大雜交豬種3個(gè)品種中的分布占優(yōu)勢(shì)；而在地方品種中，AG型和GG型占優(yōu)勢(shì)，并且在沙子嶺豬和大圍子豬中還沒檢測(cè)到AA型的存在，可能與這兩個(gè)品種的樣本數(shù)量太少有關(guān)。從多態(tài)性分布情況看，杜洛克豬、五指山豬、大圍子豬和杜長(zhǎng)大商品豬的遺傳雜合度較高，而大白豬、桃源黑豬和沙子嶺豬遺傳雜合度較低，這與豬品種（組合）的種質(zhì)特性有關(guān)，加上不同的純種豬群，各品種（組合）選擇強(qiáng)度也不同，綜合起來造成了不同品種遺傳多態(tài)性的差異。

3.2 GPR40基因與豬肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析

本試驗(yàn)以GPR40基因作為豬肉質(zhì)性狀的候選基因，研究該基因一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與豬肉質(zhì)性狀的關(guān)系。但是，因?yàn)橥涝讞l件的限制，本試驗(yàn)只分析了72頭大白豬GPR40基因的多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與豬肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPR40基因606AG位點(diǎn)貯存損失AA型與GG型差異不顯著，但AG型顯著低于AA型與GG型；肉色等級(jí)和肉質(zhì)色度，AA型和AG型顯著高于GG型，且AA型與AG型差異不顯著。由此可以看出，GPR40基因606A-G位點(diǎn)等位基因A可能是影響豬肉色等級(jí)和肉質(zhì)色度的一個(gè)有利基因，表明GPR40基因可以作為豬肉質(zhì)性狀的候選基因。豬群與遺傳學(xué)背景不同常常會(huì)導(dǎo)致一個(gè)基因位點(diǎn)的遺傳變異對(duì)肉質(zhì)性狀的遺傳效應(yīng)不同，選擇樣本也存在各種各樣的差異，最后這些原因均會(huì)影響統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，關(guān)于GPR40基因多態(tài)性對(duì)肉質(zhì)性狀的效應(yīng)仍需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

本研究以GPR40基因做為豬肉質(zhì)性狀的候選基因，通過混池測(cè)序再結(jié)合PCR-RFLP方法檢測(cè)對(duì)7個(gè)豬品種（組合）TaiⅠ酶切位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率進(jìn)行檢測(cè)，并與肉質(zhì)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPR40基因外顯子存在606A-G突變；關(guān)聯(lián)分析表明，GPR40基因多態(tài)性對(duì)豬肉質(zhì)性狀具有一定的遺傳效應(yīng)，可能是影響肉色的一個(gè)分子遺傳標(biāo)記。

[1]李德臻.豬脂肪誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因FIT的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

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[4]武珅，陸濤峰，武爽，等.G蛋白偶聯(lián)受體40研究進(jìn)展[J].遺傳，2013，35（1）：27-34.

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（編輯：富春妮）

不吃主食減肥更年期提前

不吃主食減肥，是當(dāng)下流行的一種減肥方法。“不吃主食”可能在短期內(nèi)奏效，因?yàn)樯眢w吸收少，體重會(huì)下降。但這種方法的最大弊端是：除非堅(jiān)持一輩子，否則一旦恢復(fù)吃主食，體重就會(huì)一直反彈。

一些人在堅(jiān)持不吃主食一段時(shí)間后，會(huì)出現(xiàn)皮膚變差、脫發(fā)的情況，有人抱怨自己呼氣時(shí)有股爛蘋果味兒，還有人感覺記憶力下降，甚至出現(xiàn)脾氣古怪、情緒煩躁、難以溝通的跡象。這些負(fù)面作用讓人有種提前進(jìn)入更年期的感覺。實(shí)際上，沒有不好的食物，只有不合理的膳食，關(guān)鍵在于平衡。主食不僅要吃，還要注意粗細(xì)搭配。

（摘自《北京青年》）

The Polymorphism of GPR40 Gene and Its Effects on Meat Quality Traits in Pig

DONG Lianhua1,2,LI Jie1,2,JIANG Ming1,2,CHEN Bin1,2
(1.College of Animal Science&Technology,Hu'nan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hu'nan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal,Changsha 410128,China)

In this experiment,the Duroc,Yorkshire,Daweizi,Shaziling,Taoyuan,Wuzhishan and the DLY Hybrid were chosen,the polymorphism of G protein-coupled receptor 40(GPR40)detected through the sequencing and PCR-RFLP method,and we also analyzed the association of polymorphisms of GPR40 with the meat traits,the results show that the extron of GPR40 gene has 606A-G mutations,and 606A-G are in Hardy Weinberg equilibrium besides Daweizi and Duroc pigs;on the meat quality traits,storage losses of AA and GG genotype difference was not significant,but the AG significantly lower than AA type with GG type;flesh-colored levels and fleshy chromaticity same,AA and AG were no significant differences,but both higher than the GG genotype.GPR40 gene is likely to be one of the molecular genetic markers for flesh-colored levels.

GPR40;restriction enzyme;polymorphism;lipid metabolism;meat traits

S828.8

A

1002-1957(2016)01-0061-04

2016-01-05

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-36）

董蓮花（1991-），女，湖南衡陽(yáng)人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖.E-mail：donglianhua013＠126.com

陳斌，教授，博士生導(dǎo)師，博士.E-mail：chenbin7586＠126.com