黃忠華，梁 智

（廣西輕工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，廣西 南寧 530031）

海藻酮糖測(cè)定方法的探討

黃忠華，梁 智

（廣西輕工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，廣西 南寧 530031）

文章采用高壓液相色譜法（HPLC）測(cè)定海藻酮糖的含量，通過分析比對(duì)兩個(gè)廠家的液相色譜系統(tǒng)和四種不同廠家和類型的液相色譜柱測(cè)定結(jié)果的差異，最終確定用Waters公司氨基型碳水化合物分析專用柱來測(cè)定溶液中海藻酮糖的含量，流動(dòng)相為乙腈：水=（4∶1），示差折光檢測(cè)器。

海藻酮糖；液相色譜

蔗糖、異麥芽酮糖和海藻酮糖是同分異構(gòu)體，根據(jù)查到的國(guó)內(nèi)外所有文獻(xiàn)［1-10］的報(bào)道，蔗糖在蔗糖異構(gòu)酶的催化作用下，會(huì)專一的生成異麥芽酮糖和海藻酮糖，不同微生物來源的酶，生成異麥芽酮糖和海藻酮糖的比例不一樣，這也符合酶的專一性的特征，此外還有因蔗糖水解產(chǎn)生的果糖、葡萄糖等其他微量組分。海藻酮糖和異麥芽酮糖作為蔗糖的同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差異使得兩者性質(zhì)和用途既相似又有所區(qū)別，如甜度，前者為蔗糖的52%，后者為蔗糖的70%；溶解度，25℃時(shí)，異麥芽酮糖的溶解度為25%左右，而海藻酮糖的溶解度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于此，因此至今未有晶體產(chǎn)品問世。正因?yàn)楹Ｔ逋浅司邆洚慃溠客欠侵慢x齒性、不引起血糖升高等一樣的性質(zhì)外，還具有溶解度高，吸濕性好等優(yōu)勢(shì)，更利于在高糖度的食品、保健品和化妝品中發(fā)揮作用。目前，蔗糖、異麥芽酮糖都有標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)方法，但是海藻酮糖沒有標(biāo)準(zhǔn)品，本課題組通過電話咨詢?nèi)鏢igma公司等標(biāo)準(zhǔn)品供應(yīng)商，也委托專業(yè)的試劑藥品經(jīng)銷商采購(gòu)，經(jīng)多方努力依然無法得到海藻酮糖標(biāo)準(zhǔn)品或者含量很高的對(duì)照品，因此，本文就是針對(duì)海藻酮糖的測(cè)定方法進(jìn)行研究與探索。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

異麥芽酮糖母液：廣西科學(xué)院生物所。

異麥芽酮糖：廣西維科特生物技術(shù)有限公司。果糖、葡萄糖、蔗糖、異麥芽酮糖、乙腈（分析純）：市售。

1.2 主要儀器設(shè)備

液相色譜系統(tǒng)：美國(guó)安捷倫1100，GPC色譜分析工作站，配示差檢測(cè)器，大連依利特S1201自動(dòng)進(jìn)樣器；美國(guó)Waters液相色譜系統(tǒng)，威瑪龍色譜分析工作站，配示差檢測(cè)器，515泵，大連依利特S3101自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱：Waters公司氨基型碳水化合物分析專用柱、大連依利特氨基柱、伯樂Ca2+型糖分析柱、廣州菲羅門Ca2+型糖分析柱。

1.3 異麥芽酮糖母液的預(yù)處理

異麥芽酮糖母液一般錘度為50°Bx左右，先用高純水稀釋至30°Bx左右，添加2.0%～3.0%活性炭，在60～70℃條件下保溫?cái)嚢?0～60分鐘，過濾，取濾液過陰陽(yáng)離子混合交換樹脂，使電導(dǎo)率將至10ms/cm以下，備用。

1.4 樣品溶液的配置

樣品溶液的配置：液相色譜測(cè)定前，將預(yù)處理后的異麥芽酮糖母液、蔗糖、葡萄糖、果糖、異麥芽酮糖用高純水稀釋至1°Bx（即1.0%）左右，經(jīng)0.22um水系微孔濾膜過濾。

1.5 色譜條件及分析方法

方法一：色譜柱：伯樂Ca2+型糖分析柱、廣州菲羅門Ca2+型糖分析柱，流動(dòng)相：高純水，柱溫80～85℃，進(jìn)樣濃度1.0%，進(jìn)樣量20ul，流速：1.0ml/min。

方法二：Waters公司氨基型碳水化合物分析專用柱、大連依利特氨基柱，流動(dòng)相：乙腈：水=4:1，柱溫30℃，進(jìn)樣濃度1.0%，進(jìn)樣量20ul，流速：1.0ml/min。

具體見表1。

表1 兩種不同液相色譜檢測(cè)方法操作參數(shù)比較

1.6 結(jié)果分析與討論

本項(xiàng)目開展之前，我院承擔(dān)了“果葡糖漿分離”、“甘露醇和山梨醇的分離”、“木糖和L-阿拉伯糖的分離”等多個(gè)科研項(xiàng)目的研究，均采用方法一（色譜柱：Ca2+型糖分析柱；洗脫劑：高純水；柱溫：80～85℃；流速：0.6mL/min；示差檢測(cè)器：40℃；進(jìn)樣濃度：約1%；進(jìn)樣量：20ul）對(duì)物料進(jìn)行液相色譜分析檢測(cè)，均獲得成功，分離效果非常好，在此基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目的前期研究階段（模擬移動(dòng)床連續(xù)分離之前的實(shí)驗(yàn)）一直沿用方法一，采用面積歸一化法，對(duì)異麥芽酮糖母液進(jìn)行分析測(cè)試，液相分析圖譜如下。

圖1 果糖和葡萄糖液相圖譜

圖2 木糖和L-阿拉伯糖液相圖譜

圖3 甘露醇和山梨醇液相圖譜

圖4 異麥芽酮糖母液液相色譜圖

由以上液相色譜分析圖可見，異麥芽酮糖和海藻酮糖在Ca2+型糖分析柱上的出峰時(shí)間很接近，前者為9.915分鐘，后者為11.173分鐘，兩者只相差1.258分鐘，而且蔗糖、葡萄糖的出峰時(shí)間也為9分鐘附近，有時(shí)候出現(xiàn)了多峰重疊的現(xiàn)象，說明兩者在Ca2+型糖分析柱上雖然可以分離，但是難以達(dá)到像果糖—葡萄糖（圖1），木糖—L-阿拉伯糖（圖2），甘露醇—山梨醇（圖3）那樣完美分離，由此可以預(yù)見，本項(xiàng)目的分離難度系數(shù)很大。

中試實(shí)驗(yàn)開展之后，一些科研人員認(rèn)為采用方法一對(duì)海藻酮糖進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)有些峰重疊的現(xiàn)象，會(huì)影響測(cè)試結(jié)果，根據(jù)文獻(xiàn)［4］，環(huán)民霞，林璐等在《淀粉與淀粉糖》2007年第4期發(fā)表的文章《利用Erwinia rhapontici NX-4菌株高效制備新型甜味劑異麥芽酮糖》所述，采用氨基型分析柱，乙腈：水=80：20為洗脫劑，流速0.8Ml/min，示差檢測(cè)器40℃，進(jìn)樣量20ul，檢測(cè)結(jié)果如下。

圖5 文獻(xiàn)報(bào)道海藻酮糖液相色譜測(cè)試圖

同時(shí)參照異麥芽酮糖企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（QB 1581-1992）和相關(guān)文獻(xiàn)資料［1-10］，在中試試驗(yàn)階段采用方法二對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分析，兩種分析方法及液相色譜分析結(jié)果如下。

圖6 采用方法一用廣州菲羅門Ca2+型糖柱對(duì)異麥芽酮糖母液測(cè)試液相色譜圖

圖7 采用方法一用伯樂Ca2+型糖柱對(duì)異麥芽酮糖母液測(cè)試液相色譜圖

圖8 采用方法二用大連依利特氨基型氨基柱對(duì)異麥芽酮糖母液測(cè)試液相色譜圖

圖9 采用方法二用Waters氨基型碳水化合物分析柱對(duì)異麥芽酮糖母液測(cè)試液相色譜圖

表2 方法一液相結(jié)果

表3 方法二液相結(jié)果

由以上圖表可見，異麥芽酮糖和海藻酮糖在方法一（即Ca2+型糖分析柱）上的出峰時(shí)間很接近，而方法二（即氨基型氨基柱）上，甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖等其他組分在20分鐘前就已經(jīng)出峰，而異麥芽酮糖的出峰時(shí)間為23.45分鐘，海藻酮糖的出峰時(shí)間為26.15分鐘，兩者相差2.7分鐘，可見，方法二更適合用于檢測(cè)海藻酮糖的含量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)美國(guó)伯樂和廣州菲羅門的Ca2+型糖分析柱的檢測(cè)結(jié)果沒有顯著差異，但是Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱比大連依利特的NH2+型氨基柱的峰形、分離效果和重現(xiàn)性要好得多，因此采用方法二，Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱，通過面積歸一化法對(duì)本項(xiàng)目中試分離實(shí)驗(yàn)及結(jié)果進(jìn)行海藻酮糖的定性和定量分析檢測(cè)。

分別按乙腈含量80%、75%配置流動(dòng)相，以Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱為色譜柱，按照方法二的檢測(cè)方法對(duì)異麥芽酮糖母液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下。

圖10 采用方法二按80%乙腈測(cè)試異麥芽酮糖母液液相色譜圖

圖11 采用方法二按75%乙腈測(cè)試異麥芽酮糖母液液相色譜圖

由以上圖可見，采用乙腈含量80%的分離效果比75%的要好一點(diǎn)，因此，本項(xiàng)目的后期實(shí)驗(yàn)均采用乙腈含量80%（即乙腈：水=4:1），Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱為色譜柱，按照方法二的檢測(cè)方法對(duì)異麥芽酮糖溶液進(jìn)行檢測(cè)。

［1］ QB 1581-1992食品添加劑-異麥芽酮糖，中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［J］，1993年4月.

［2］ 林璐，李莎等.生物催化生產(chǎn)異麥芽酮糖的研究進(jìn)展，食品與發(fā)酵工業(yè)［J］，2007年第6期，91-94.

［3］ 薛蓓，梁甲元.海藻酮糖的研究進(jìn)展，食品與發(fā)酵工業(yè)［J］，2012第11期，127-130.

［4］ 環(huán)民霞，林璐等.利用Erwinia rhapontici NX-4菌株高效制備新型甜味劑異麥芽酮糖，淀粉與淀粉糖［J］，2007年第4期，22-24.

［5］ 唐文竹，陳放等.蔗糖異構(gòu)酶催化生產(chǎn)異麥芽酮糖研究進(jìn)展，微生物學(xué)通報(bào)［J］，2012年第9期1314-1322.

［6］ 李莎，徐虹.微生物來源蔗糖異構(gòu)酶的研究進(jìn)展及應(yīng)用，化工進(jìn)展［J］，2011年第6期，1326-1331.

［7］ 甘賓賓，蔣世瓊.高效液相色譜法測(cè)定帕拉金糖，廣西化工［J］，2001年第3期，40-41.

［8］ 沃爾夫?qū)ね吆盏?含海藻酮糖的組合物，其制備及其用途，PCT中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枺?01080023895.0.

［9］ 韋宇拓，梁甲元等.一種純化海藻酮糖的方法，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310428359.1.

［10］李丕武，王瑞明等.從異麥芽酮糖母液分離異麥芽糖和海藻酮糖的方法，中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枺?01410284332.7.

TS249．9

B

2095-820X（2016）01-07

2016-01-06

2013年廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目，制糖業(yè)共性關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)與示范重大專項(xiàng)，合同編號(hào)：桂科重：1348002-6，計(jì)劃類別：重大專項(xiàng)。

黃忠華（1982-），男，廣西田陽(yáng)人，大學(xué)本科，工程師，從事糖類及其深加工與應(yīng)用的研究，Email：18777162820@126.com。