高美萍，林志城，張 馳，江 文，何芳練，楊 柳，韋紹龍*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西植物組培苗有限公司，廣西 南寧 530007；3.廣西桂林市平樂縣農(nóng)業(yè)局，廣西 平樂 542400)

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利用間歇浸沒式生物反應器進行慈姑組培快繁研究

高美萍1，林志城2，張 馳3，江 文1，何芳練1，楊 柳1，韋紹龍1*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西植物組培苗有限公司，廣西 南寧 530007；3.廣西桂林市平樂縣農(nóng)業(yè)局，廣西 平樂 542400)

以慈姑(Sagittariasagittifolia)莖尖誘導的組培苗為材料，利用間歇浸沒式生物反應器(TIBs)開展慈姑組培快繁激素組合的篩選、慈姑不同代數(shù)繼代材料的培養(yǎng)效果、不同接種密度對慈姑組培增殖影響及不同間歇頻率對慈姑組培快繁的影響等組培快繁技術(shù)體系研究。結(jié)果表明：TIBs系統(tǒng)可以使慈姑組培苗一代增殖19.5倍以上，比傳統(tǒng)方法提高3倍以上；培養(yǎng)基含6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L的TIBs適合組培苗繼代增殖培育；TIBs系統(tǒng)中，以第5代繼代材料為宜，接種密度10株/L，間歇浸沒頻率在10 min/3 h時，最有利于慈姑組培苗的增殖和生長。

慈姑；組培快繁；間歇浸沒式生物反應器(TIBs)

慈姑(SagittariasagittifoliaL.)是澤瀉科(Alismataceae)慈姑屬宿根性水生草本。在我國主要分布于長江流域及其以南各省(區(qū))，其中太湖沿岸及珠江三角洲為主產(chǎn)區(qū)，長江以北亦有少量栽培。廣西是全國優(yōu)良慈姑品種白慈姑主產(chǎn)區(qū)，已有一、兩百年栽培歷史，其中“桂林白慈姑”以球莖個大、皮白、品質(zhì)優(yōu)、無苦澀味，商品性好而聞名國內(nèi)外。

目前我國慈姑種植方式主要為留種繁殖，以球莖留種過程不僅消耗大量商品慈姑，而且還占用大量田地，同時，因慈姑主產(chǎn)區(qū)多年連作，導致病蟲害逐年加重，許多優(yōu)良品種種性退化、產(chǎn)量下降等諸多問題。采用慈姑組培苗繁殖，可保持品種優(yōu)良種性，節(jié)約用種成本，朱紅蓮等[1-2]對慈姑組織培養(yǎng)研究結(jié)果表明，慈姑組織培養(yǎng)繼代一代僅增殖3～4倍，且慈姑組培苗內(nèi)生菌污染特別嚴重，繼代培養(yǎng)2～3次仍可再次出現(xiàn)內(nèi)生菌污染，影響慈姑的快速繁殖的進展[3]；間歇浸沒式生物反應器(TIBs)是一種用于植物組織培養(yǎng)和植物次生代謝物研究的系統(tǒng)，其原理是利用液體培養(yǎng)基以經(jīng)過過濾的空氣壓力為動力對植物組培苗進行間歇式培養(yǎng)，使材料獲得最大的增殖數(shù)。該系統(tǒng)自動化程度高，在2個月的培養(yǎng)周期中，材料無需轉(zhuǎn)接，節(jié)省人力物力，在組織培養(yǎng)過程中可大為降低生產(chǎn)成本[4-7]。目前有關(guān)“桂林白慈姑”組培苗快繁相關(guān)技術(shù)研究尚未見報道，因此，擬通過采用TIBs系統(tǒng)對慈姑進行組培快繁研究，為慈姑組培苗生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，對解決市場需求及實現(xiàn)慈姑組培苗工廠化生產(chǎn)及對推動慈姑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以廣西農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所提供的經(jīng)莖尖脫毒培養(yǎng)的慈姑組培苗“桂慈1號”。TIBs系統(tǒng)參照Lorenzo等[8]設(shè)計思路建立。TIBs 系統(tǒng)中培養(yǎng)瓶和儲液瓶分別為 2.5和3.0 L 的廣口白色玻璃瓶和三角瓶，瓶高分別為26和30 cm，直徑為14和15 cm。儲液瓶中液體培養(yǎng)基體積均為1.0 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 TIBs系統(tǒng)與傳統(tǒng)慈姑組培方法的比較 傳統(tǒng)慈姑組培采用半固體培養(yǎng)方式，培養(yǎng)基采用MS+6-BA 2.5 mg/L+ NAA 0.01 mg/L+白糖25 g/L。TIBs系統(tǒng)各參數(shù)參考Lorenzo等[8-9]的設(shè)計思路，接種密度為10株/L，間歇頻率按浸沒10 min 間歇1 h。TIBs系統(tǒng)繼代增殖培養(yǎng)6周。傳統(tǒng)方法每3 周繼代1次，比較兩種方法的增殖倍數(shù)、萌芽時間、株高、葉片數(shù)、生根數(shù)。

1.2.2 TIBs系統(tǒng)中慈姑組培快繁激素組合的篩選 試驗以第6代繼代組培苗，接種密度為10株/L，TIBs系統(tǒng)間歇頻率按浸沒10 min 間歇1 h，6-BA質(zhì)量濃度為1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mg/L ，NAA質(zhì)量濃度為0.01、0.05 mg/L。

1.2.3 慈姑不同代數(shù)的繼代材料在TIBs系統(tǒng)中的培養(yǎng)效果 利用繼代數(shù)為1～8 代的組培苗為材料，增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA 0.01 mg/L+白糖25 g/L，TIBs系統(tǒng)間歇頻率按浸沒10 min 間歇1 h，接種密度10株/L。

1.2.4 不同接種密度對TIBs系統(tǒng)中慈姑組培增殖影響 試驗材料為經(jīng)5次繼代的組培苗，增殖培養(yǎng)基及TIBs系統(tǒng)設(shè)計同試驗方法1.2.3，接種密度為5、10、15、20和25株/L。

1.2.5 TIBs系統(tǒng)中不同間歇頻率對慈姑組培快繁的影響 試驗材料為經(jīng)5次繼代的組培苗，增殖培養(yǎng)基同試驗方法1.2.3，接種密度為10株/L，TIBs系統(tǒng)浸沒間歇頻率按浸沒10 min 分別間歇1、3、6、12和24 h。

以上各試驗培養(yǎng)條件：光照強度1500 lx，培養(yǎng)溫度(28±2) ℃，光照16 h/d，黑暗8 h/d。培養(yǎng)基pH 5.0～6.0，增殖培養(yǎng)6周。試驗均設(shè)每個處理5套TIBs系統(tǒng)，重復3次，采集增殖倍數(shù)、株高、萌芽時間、生根數(shù)、污染率等，取平均值。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件SNK法進行統(tǒng)計及多重比較顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TIBs系統(tǒng)與傳統(tǒng)慈姑組培方法比較

由表1可見，慈姑組培苗1代繼代增殖倍數(shù)在傳統(tǒng)Semi-solid培養(yǎng)方式下為6.3倍，而利用TIBs系統(tǒng)培養(yǎng)，其增殖倍數(shù)為19.5倍，兩者差異達顯著水平(P<0.05，下同)。TIBs系統(tǒng)培養(yǎng)方式下，組培苗的株高、生根數(shù)和葉片數(shù)等指標均高于傳統(tǒng)方法，其中株高、生根數(shù)顯著高于傳統(tǒng)方法，而兩種方法下慈姑組培苗葉片數(shù)差異不顯著(P>0.05，下同)。

2.2 TIBs系統(tǒng)中慈姑組培快繁激素組合的篩選

從表2可以看出， 當NAA添加濃度固定時，慈姑組培苗的增殖倍數(shù)均隨著6-BA添加濃度增加而增加。當NAA添加濃度為 0.05 mg/L時，6-BA添加濃度為4.0 mg/L處理的組培苗增殖倍數(shù)(22.7)顯著高于其他處理，1.0 mg/L處理組培苗增殖倍數(shù)(10.5)顯著低于其他處理， 2.0 和3.0 mg/L2處理之間增殖倍數(shù)差異不顯著，且均顯著高于1.5 mg/L處理。當NAA添加濃度為0.01 mg/L時，6-BA添加濃度為4.0 mg/L處理的組培苗增殖倍數(shù)(25.3)顯著高于其他處理，1.0 mg/L處理組培苗增殖倍數(shù)(12.6)顯著低于其他處理， 1.5和2.0 mg/L 2處理之間增殖倍數(shù)差異不顯著，且均顯著低于3.0 mg/L處理。當NAA添加濃度固定時，不同6-BA添加濃度處理間，慈姑組培苗株高、葉片數(shù)和生根數(shù)差異均不顯著；NAA添加濃度為0.05 mg/L處理慈姑組培苗生根數(shù)均顯著多于0.01 mg/L處理。同時，在研究過程中觀察發(fā)現(xiàn)，當6-BA濃度達 4.0 mg/L 時，雖然增殖倍數(shù)多，但其植株較細，長勢稍遜，且出現(xiàn)一部分玻璃化苗，這可能與6-BA濃度高有關(guān)。為降低組培苗變異率，保證組培苗質(zhì)量，又不影響增殖倍數(shù)，選擇6-BA 3.0 mg/L +NAA 0.01 mg/L效果較好。

表1 TIBs系統(tǒng)與傳統(tǒng)慈姑組培方法比較

注：同列數(shù)據(jù)后*表示差異達顯著水平(P<0.05)。

Note:* in the same column meant significant difference(P<0.05).

表2 TIBs系統(tǒng)中慈姑組培快繁激素組合的篩選

注：同列數(shù)據(jù)后不同小字母表示差異達5 %顯著水平。下同。

Note:Different capital and small alphabets in the same column meant significant difference at 5 %.

2.3 慈姑不同代數(shù)的繼代材料在TIBs系統(tǒng)中的培養(yǎng)效果

從表3可知，在第3代以前的材料增殖倍數(shù)為7倍左右，從第4代開始顯著增加，其中第5代材料增殖倍數(shù)為19.5，顯著高于前4代材料，且與第6～8代材料差異不顯著。在TIBs系統(tǒng)中，為保證慈姑組培苗有足夠材料又不影響增殖條件下，選擇第5代苗為繼代材料進行快繁較好。在1～5代，隨著代數(shù)的增高，萌芽的時間呈縮短趨勢，但差異不顯著，均為3 d左右，在第6～8代，萌芽時間推遲，為5 d左右；不同繼代材料對葉片數(shù)、株高影響不顯著。前6代污染率均為0，第7和8代污染率分別為15.00 %和17.00 %。

2.4 不同接種密度對TIBs系統(tǒng)中慈姑組培增殖影響

從表4結(jié)果可以看出，在TIBs系統(tǒng)中，慈姑組培苗增殖倍數(shù)隨接種密度增加呈先增大后減少的趨勢；其中接種密度為15株/L處理，增殖倍數(shù)最大(20.9倍)，顯著高于除10株/L處理外的其他各接種密度處理，接種密度為10、20和25株/L處理間增殖倍數(shù)差異均不顯著，且均顯著高于5株/L處理。慈姑組培苗萌芽時間隨接種密度增加呈縮短趨勢，其中25株/瓶處理萌芽用時最少，為2.6 d，顯著少于其他處理；5株/L處理萌芽用時最長，為6.2 d，顯著高于其他處理；10～20株/L處理間萌芽時間差異不顯著，均為4.0 d左右。不同接種密度對慈姑組培苗株高、葉片數(shù)的影響差異均不顯著。培養(yǎng)基污染率隨接種密度增加而增加，其中接種密度為5和10株/L的處理污染率均為0。因此，從不影響繼代增殖倍數(shù)及植株生長，又可降低培養(yǎng)基被污染風險角度綜合考慮，選擇10株/L的接種密度為宜。

表3 不同代數(shù)繼代組培苗在TIBs系統(tǒng)中的增殖效果

表4 不同接種密度對TIBs系統(tǒng)中慈姑組培增殖影響

表5 TIBs系統(tǒng)中不同間歇頻率對慈姑組培快繁的影響

2.5 TIBs系統(tǒng)中不同間歇頻率對慈姑組培快繁的影響

在TIBs 系統(tǒng)中，隨著間歇頻率的降低，繼代增殖倍數(shù)降低。如表5所示，間歇頻率為10 min/h和10 min/3h處理之間的增殖倍數(shù)差異不顯著，且均顯著高于其余各處理；不同間歇頻率處理對萌芽時間影響差異不顯著，均在3 d左右；組培苗的株高和根長均隨間歇頻率降低呈增加趨勢，且各處理間差異均達顯著水平。隨著間歇頻率的降低，組培苗污染率的風險提高，24 h時，污染率達到20.00 %。綜合繼代增殖率、同時又能控制低污染率，節(jié)約電能等考慮，最優(yōu)選擇間歇頻率為10 min/3h。

3 討 論

TIBs系統(tǒng)培養(yǎng)綜合固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的有點，并對其進行了優(yōu)化，使培養(yǎng)材料達到最大的增殖數(shù)。Angela[10]等將澳大利亞的幾個不同甘蔗品種在不同生物反應器進行試驗比較，發(fā)現(xiàn)利用 TIBs 系統(tǒng)的甘蔗組培苗一代增殖率超過20倍。本研究條件下，慈姑組培苗在TIBS系統(tǒng)中繼代增殖達19倍以上，遠遠高于傳統(tǒng)方法。在國內(nèi)，劉麗敏等[14]利用該系統(tǒng)對ROC16和ROC22兩個甘蔗品種研究，發(fā)現(xiàn)ROC16一代增殖率達40倍， ROC22一代增殖率為30倍。目前國內(nèi)外利用此套系統(tǒng)研究的作物種類也在不斷增加，報道較多的主要有菠蘿[11]、香蕉[12-13]、甘蔗[14-15]、桉樹[16]、咖啡[17]等。

在利用TIBs進行組培快繁的過程中，不同代數(shù)對組培苗的繼代增殖效果不同。使用不同代數(shù)的繼代苗為材料，其組培苗的生長、增殖等狀況也不同。Quiala等[18]在利用TIBS進行菠蘿組培快繁時研究發(fā)現(xiàn)，以第2代繼代苗為外植體時，保持了較高的增殖和生長能力，而粟靖等[19]研究發(fā)現(xiàn)，以第7代香蕉繼代組培苗為材料時，香蕉的生長和增殖達到最好效果。本研究結(jié)果表明在控制組培苗變異率情況下，慈姑工廠化生產(chǎn)的代數(shù)一般不高于8代效果最好。

接種密度是TIBs系統(tǒng)中重要的調(diào)控參數(shù)之一。McClelland等[20]報道，外植體數(shù)/培養(yǎng)基量、外植體數(shù)/容器容積等比值直接影響器官形成與發(fā)育，培養(yǎng)過程中適宜的接種密度隨植物種類不同而有所差異。篤斯越橘叢生苗(Vacciniumuliginosum)也具有類似特性[21]。楊柳等[13]研究報道，在TIBs系統(tǒng)中接種密度在10～15株/L時組培苗增殖和生長較優(yōu)。Angela[10]等發(fā)現(xiàn)在TIBs系統(tǒng)中接種密度在15～20株/L時效果最好。而本研究結(jié)果則表明較低的接種密度(10株/L)既能控制低污染率又不影響組培苗增殖效果。

間歇浸沒頻率影響植物組培快繁，不同作物對間歇頻率要求不同。Marta 等[22]得出的結(jié)論是短的浸沒時間和高頻率浸沒能增加栓皮櫟體細胞胚的數(shù)量和質(zhì)量(1 min浸沒間歇12 h)，相反，Raúl等[23]對酒店草研究結(jié)果顯示，低頻率浸泡(每24 h)和短浸泡時間(5 min)比每3和12 h組培增殖產(chǎn)生更好的結(jié)果。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，提高間歇浸沒頻率，有利于降低內(nèi)生菌污染風險。這可能與高頻率的氣體交換，及間干間濕的生長環(huán)境有關(guān)，具體原因有待進一步深入分析。

4 小 結(jié)

本研究結(jié)果表明，利用TIBs系統(tǒng)進行慈姑組培苗快繁，適宜增殖生長的培養(yǎng)基激素組合為6-BA 3.0 mg/L +NAA 0.01 mg/L，取第5代繼代材料，接種密度10株/L，間歇浸沒時間10 min/3h，繼代增殖倍數(shù)達19倍以上。該實驗為利用間歇浸沒式生物器進行慈姑組培快繁的研究應用，為實現(xiàn)大規(guī)模、自動化慈姑組培健康種苗的工廠化生產(chǎn)奠定一定基礎(chǔ)，為推廣TIBS系統(tǒng)在植物組培中的應用提供了實驗依據(jù)。

[1]劉玉平，柯衛(wèi)東.慈姑的組織培養(yǎng)[J]. 植物生理學通訊，2002，38(3):244.

[2]朱紅蓮，柯衛(wèi)東，汪李平. 慈姑莖尖組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].中國蔬菜，2006(3):17-19．

[3]黃凱豐，時 政.慈姑莖尖組織培養(yǎng)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39(15):8848-8849.

[4]Benlal A，Maehad O P，Cortegaza L, et al. Priming，integrated into sugarcane propagation technology by Temporary Bioreactor to TIBs[J]. Sugar Technolygy, 2008, 10(1):42-47.

[5]Park S Y, Murthy H N, Paek K Y. Mass multiplication of protocorm-like bodies using bioreactor system and subsequent plant regeneration in Phalaenopsis[J]．Plant Cell，Tissue and Organ Culture, 2002, 63(1):67-72．

[6]Arencibia A D, Bernal A, Yang L, et al. New role of phenyl compounds during sugarcane micro-propagation in Temporary. Immersion Bioreactors (TIBs) [J]. Plant Science, 2008, 175(4):487-496.

[7]Zhu L H, Li X Y, Welander M. Optimization of growing conditions for the apple rootstock M26 grown in RITA containers using temporary immersion principle[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2005, 81(2):313-318.

[8]Lorenzo J C, Gonza L, Escalona B M. Sugarcane shoot formation in an improved temporary immersion system[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2001,54(1):197-200.

[9]Lorenzo J C, Ojeda E, Espinosa A. Field performance of temporary immersion bioreactor-derived sugarcane plants[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2003,37(6):803-806.

[10]Angela M, Jean A B, Prakash L, et al. Development of a temporary immersion system (RITA R for mass production of sugarcane Saccharum spp. inter specific hybrids)[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2009, 45:450-457.

[11]Arago C E, Sealona M，Rodriguez R. Effect of sucrose and carbon dioxide on piantain micropropagation in temporary immersion bioreaetors[J].I In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant ,2010,46:89-94.

[12]Ikram H , Muhammad U D. Effect of immersion systems on chlorophyll contents in micro-propagating banana[J]. African Journal of Biotechnology, 2007,6 (9):1095-1101.

[13]楊 柳，秦 剛，楊麗濤，等. 利用間歇浸沒式生物反應器進行甘蔗組培快繁的研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報, 2011(1):37-41.

[14]劉麗敏，李 松，戴友銘，等.甘蔗莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)研究[J].中國糖料，2009(2):18-20.

[15]Escalona M, Lorenzo J C, González B, et al. Pineapple (AnanascomosusL. Merr) micropropagation in temporary immersion systems[J]. Plant Cell Report,1999, 18:743-748.

[16]Mcalister B，F(xiàn)innie J，Watt M P. Use of the temporary immersion bioreactor system(RITA)for production of commercial Eu-calyptus clones in Mondi Forests [J]. Plant Cell Tissue Organ Culture, 2005(81):347-358.

[17]Herv E, Dechamp E, Barryv E D. Bioreactors in coffee mircro-propagation[J]. Plant Physiology, 2006, 18(1):45-54.

[18]Quiala E, Canal MJ, Meijon M, et al. Morphological and physiological responses of proliferating shoots of teak to temporary immersion and BA treatments[J]. Plant Cell Tissue Organ Culture, 2012, 109(2):223-234.

[19]粟 靖. 利用間歇浸沒式生物反應器(TIBs)進行香蕉組培快繁研究[D].南寧：廣西大學：2011.

[20]McClelland M T, Smith M A, Vessel L, et al. Losure and explants orientation influence in vitro performance of five woody species[J]. Hortscience，1990, 5(7):797-800．

[21]李鐵軍，樸炫春，廉家盛，等. 利用生物反應器接觸培養(yǎng)法增殖篤斯越橘叢生苗[J]. 林業(yè)科學, 2012, 48(11)：130-133.

[22]Marta P, Marria A B , Maritza E, et al. Temporary immersion systems (RITA) for the improvement of corkoak somatic embryo genetic culture proliferation and somatic embryo production[J].Trees, 2013, 27:1277-1284.

[23]Raúl V T, Jacqueline C T, Alma R L, et al. Effect of immersion cycles on growth, phenolics content, and antioxidant properties of Castilleja tenuiflora shoots[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2014 ,50:471-477.

(責任編輯 汪羽寧)

Optimization ofSagittariasagittifoliaRapid Propagation in Temporary Immersion Bioreactors System

GAO Mei-ping1，LIN Zhi-cheng2，ZHANG Chi3, JIANG Wen1，HE Fang-lian1，YANG Liu1，WEI Shao-long1*

(1.Biotechnology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007,China；2.Guangxi Plant Tissue Cultured Seedlings Co. Ltd,Guangxi Nanning 530007,China;3.Guangxi Pingle Agricultural Bureau,Guangxi Pingle 542400,China)

A new protocol using temporary immersion bioreactors (TIBs) was established for micro-propagation ofSagittariasagittifolia. The influence of different hormone , sub-cultured , immersion frequency together with inoculation density onSagittariasagittifoliamultiplication in TIBs was carried out in this paper. The resulted showed that more than 19.5 times multiplication rate were obtained in TIBs, which was more than three times higher than that of traditional method. And also better morphological characteristics were obtained in TIBs. TIBs with 3.0 mg/L 6-BA+NAA 0.01 mg/L were good forSagittariasagittifoliaproliferation and growth. In TIBs , the materials from 5thsubcultures resulted in a higher multiplication rate than other subcultures. And the most suitable density inoculums were 10 plantlets per liter. Temporary frequency of 10 min per 3 h was suitable for multiplication. This research provided the theory basis forSagittariasagittifoliafactory production.

Sagittariasagittifolia; Rapid propagation; Temporary immersion bioreactors (TIBs)

1001-4829(2016)11-2704-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.035

2016-07-11

廣西農(nóng)業(yè)科學院科技發(fā)展基金項目(2015JM10)；廣西農(nóng)業(yè)廳和農(nóng)科院共建項目(廣西平樂慈姑試驗站)

高美萍(1985-)，福建南平人，助理研究員，主要從事生物技術(shù)育種與植物組培快繁技術(shù)研究工作, *為通訊作者，E-mail：weishaolong@gxass.net。

S645.9

A