劉小玉，付登強(qiáng)，賈效成，陳良秋

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南 文昌 571339)

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油茶根際土壤解磷菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件

劉小玉，付登強(qiáng)，賈效成，陳良秋

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南 文昌 571339)

從油茶根際土壤中分離篩選出7株溶磷細(xì)菌，根據(jù)透明圈法和鉬銻抗比色法綜合分析，最終得出菌株4-Y-06溶磷活性最強(qiáng)。通過菌落形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析等研究，初步鑒定菌株 4-Y-06為嗜氣芽孢桿菌。同時，研究了不同碳源、氮源、C/N、pH、以及溫度等不同培養(yǎng)條件對菌株4-Y-06溶磷效果的影響。結(jié)果表明：解磷菌4-Y-06 在碳源為蔗糖、氮源為硫酸銨、C/N為40:1、pH 7.0～7.5、30 ℃條件下解磷效果最好。

解磷菌；碳源；氮源；培養(yǎng)條件

油茶是我國南方特有的木本油料作物，與油棕、油橄欖、椰子并稱為世界四大木本油料作物。近年來，我國食用植物油消費(fèi)量持續(xù)增長，需求缺口不斷擴(kuò)大，食用植物油安全問題日益突出。油茶作為我國種植面積最大、產(chǎn)油量最高的木本油料作物，是健康優(yōu)質(zhì)食用油的重要來源。因此努力發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)提升我國食用油自給率，保障國家食用油安全具有重要意義。磷是是影響作物產(chǎn)量的重要限制因子之一，土壤缺磷直接影響農(nóng)作物的生長。我國缺磷耕地面積占74 %，且土壤中95 %以上的磷為無效態(tài)，很難被植物直接吸收利用[1]。但是土壤與植物根際中存在大量解磷菌，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為易被植物吸收利用的磷[2]。有研究表明海南油茶在低磷條件下可正常生長，未表現(xiàn)出明顯的缺磷癥狀[3]。此外，也有研究表明油茶根際土壤中存在溶磷菌[4]，油茶根際溶磷菌的高效溶磷作用可能是油茶適應(yīng)低磷脅迫的重要機(jī)理之一。

施用解磷微生物能夠溶解土壤中難溶性磷，提高土壤有效磷含量，促進(jìn)作物生長[5-7]。但不同種類的解磷菌，不僅解磷能力存在巨大的差異，而且解磷機(jī)理也可能不一樣。另外，培養(yǎng)基中碳源[8]、氮源、磷源和無機(jī)鹽[9]等也會影響解磷菌生長或改變其生理代謝途徑，從而影響其解磷效果。也有學(xué)者認(rèn)為微生物的解磷能力可能與它分泌有機(jī)酸類物質(zhì)有關(guān)，也可能存在多個解磷機(jī)理[10]。本實(shí)驗(yàn)通過研究不同碳源、氮源、C/N、pH值及溫度對菌株4-Y-06溶磷效果的影響，建立菌株4-Y-06的擴(kuò)繁技術(shù)體系，可為生產(chǎn)上研制油茶專用溶磷菌肥提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試土壤采自五指山南圣、水滿等地油茶林的油茶根際土壤。

1.2 溶磷細(xì)菌的篩選與鑒定

1.2.1 溶磷細(xì)菌的分離與篩選 采用稀釋平板法進(jìn)行溶磷菌的分離，溶磷圈法定性分析菌株的溶磷能力，鉬銻抗比色法定量測定溶磷菌的溶磷能力，具體方法詳見參考文獻(xiàn)[11]。菌株溶磷能力的計(jì)算公式如下：

P=K×V/V1

其中：P為有效磷增量；K為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得顯色液的磷含量(mg/L)；V為顯色時溶液定容的體積(mL)；V1為顯色時吸取上清液的體積(mL)。

1.2.2 溶磷細(xì)菌的鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株4-Y-06的菌落形態(tài)特征及主要生理生化特征進(jìn)行試驗(yàn)和觀察記錄。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株4-Y-06的DNA。PCR 擴(kuò)增選用通用引物27 F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492 R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應(yīng)體系50 μl (1μl模板、1 μl 1492 R、1 μl 27 F、25 μl PCR mastermix、22 μl ddH2O)。將PCR 產(chǎn)物送至華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。經(jīng)測序獲得溶磷菌株4-Y-06的16S rDNA序列，將該序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),采用BioEdit、Mega5.0等軟件對菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(Neighbour-joining,NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 不同培養(yǎng)條件對菌株菌株4-Y-06溶磷能力的影響

1.3.1 不同碳源對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 以有機(jī)磷培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別設(shè)葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖等為碳源，均以等量碳量加入培養(yǎng)基中。于28 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)7 d后測定菌株4-Y-06數(shù)量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.2 不同氮源對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 以有機(jī)磷培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別設(shè)硝酸鉀、硫酸銨、尿素、硝酸銨等為氮源，均以等量氮量加入培養(yǎng)基中。于28 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)7 d后測定菌株4-Y-06數(shù)量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.3 不同C/N對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 以有機(jī)磷培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以葡萄糖和硫酸銨為碳源和氮源，設(shè)C/N為40∶1、20∶1、8∶1等3種處理。于28 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)7 d后測定菌株4-Y-06數(shù)量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.4 不同pH對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 以有機(jī)磷培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值分別設(shè)為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測定菌株4-Y-06數(shù)量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.5 不同溫度對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 以有機(jī)磷培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)溫度設(shè)為24、26、28、30、32、34、36 ℃，然后置于200 r/min搖床培養(yǎng)7 d后測定菌株4-Y-06數(shù)量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.6 菌體數(shù)量、pH和水溶性磷含量的測定 將培養(yǎng)7 d后的菌液低速(1500 r/min)離心3 min，然后取4 mL 菌液用等體積1 mol/L HCl稀釋，目的是除去上清液中殘留的碳酸鈣顆粒，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌株的數(shù)量。剩余的菌液再經(jīng)10 000 r/min離心10 min后用pH計(jì)測定上清液pH值，最后用鉬銻抗比色法測定上清液中水溶性磷含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel和SAS軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷細(xì)菌的分離純化

共分離篩選出7株能產(chǎn)生明顯溶磷圈的細(xì)菌，對7株細(xì)菌的形態(tài)進(jìn)行觀察，用溶磷圈法對各菌株的D/d值進(jìn)行測定(表1)。另外，菌株4-Y-06在有機(jī)磷培養(yǎng)基上出現(xiàn)的透明圈如圖1。

2.2 溶磷細(xì)菌的溶磷能力

各菌株發(fā)酵培養(yǎng)7 d后測定其有效磷含量，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)7株溶磷菌溶解有機(jī)磷能力差異顯著，有效磷含量在 34.76～168.74 mg/L，與不接菌對照(23.99 mg/L)相比，有效磷增量在10.77～144.75 mg/L，增幅在44.8 %～603.4 %。菌株4-Y-06的溶磷量為168.74 mg/L，比CK增加了7倍，溶磷效果顯著高于其他菌株。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株4-Y-06的形態(tài)特征 菌株4-Y-06在LB培養(yǎng)基上生長較好，速度快，培養(yǎng)48 h后，菌落為圓形，乳白色，不透明，濕潤，扁平，無色素產(chǎn)生，菌落小。

表1 溶磷菌培養(yǎng)7 d的菌落特征

注：1)快-12 h后可觀察到生長，中等-24 h可觀察到生長，慢—48 h后可觀察到生長 ；2)+生長較差，++生長一般，+++生長良好。

Note:1)Fast-growth is observed after 12 hours, medium-growth is observed after 24 hours, slow-growth is observed after 48 hours;

2)+ poor growth, ++ growth generally,+++ good growth.

圖1 菌株4-Y-06在有機(jī)磷培養(yǎng)基上的溶磷圈Fig.1 Phosphate dissolving circle of strain 4-Y-06 in medium

2.3.2 菌株4-Y-06的生理生化特征 菌株淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)呈陰性；過氧化氯酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)呈陽性；能利用葡萄糖。

2.3.3 16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析 將菌株4-Y-06的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到一條1500 bp左右的條帶，經(jīng)序列測定，其大小為1351 bp。經(jīng)BLAST相似性分析，發(fā)現(xiàn)菌株 4-Y-06與GenBank中的AJ831844(Bacillusaerophilus28KT)同源性最高，相似性達(dá)100%。根據(jù)同源性從高到低的院長，挑取7株菌株的16S rDNA序列，運(yùn)用BioEdit、Mega5.0等軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)

表2 有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中接種7 d的溶磷量

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示0.05水平上的差異顯著性，下同。 Note:Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as below.

2.4 不同培養(yǎng)條件對菌株4-Y-06溶磷能力的影響

2.4.1 不同碳源對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 從表3可見，不同碳源顯著影響解磷菌的溶磷能力。當(dāng)以蔗糖為唯一碳源時，菌株4-Y-06表現(xiàn)出最強(qiáng)的解磷能力，溶磷量可達(dá)179.75 mg/L。供試的6 種碳源對菌株4-Y-06解磷效果的高低順序?yàn)椋赫崽?、葡萄糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖。菌體生長量變化趨勢與溶磷量相似，蔗糖為唯一碳源時解磷菌的生長量顯著高于其他碳源。綜合溶磷量和菌株數(shù)量可以看出，蔗糖為碳源時菌株4-Y-06溶磷能力最強(qiáng)。另外，各處理培養(yǎng)7 d后發(fā)酵液的pH值均下降，以蔗糖處理的降幅最大，pH 5.82，這有可能是菌株4-Y-06在發(fā)酵過程中不斷產(chǎn)生有機(jī)酸，從而引起發(fā)酵液的pH下降。

2.4.2 不同氮源對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 從表4可以看出，不同氮源顯著影響解磷菌的溶磷能力，其中以硫酸銨為唯一氮源時，菌株4-Y-06的溶磷量達(dá)到最高(168.43 mg/L)，同時培養(yǎng)介質(zhì)pH值的降幅和發(fā)酵液中菌株4-Y-06的數(shù)量也分別達(dá)到最大?？赡苁遣煌从绊懥司?-Y-06的代謝途徑，從而改變其分泌的次生代謝產(chǎn)物組分，最終表現(xiàn)出不同的解磷能力。

圖2 菌株4-Y-06的同源性分析Fig.2 Homology analysis of strain 4-Y-06

碳源Carbonsources溶磷量(mg/L)Phosphatesolubilizationcapacity菌株數(shù)量(cfu/mL)NumberofstrainspH葡萄糖167.51b2.3×1010a6.12±0.06果糖115.48c5.7×109b6.30±0.12可溶性淀粉52.53c3.2×107d6.12±0.09蔗糖179.75a4.6×1010a5.82±0.08麥芽糖68.68d2.9×108c6.19±0.18乳糖34.62f4.6×106e6.03±0.06

2.4.3 不同C/N對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 表5表明，菌株4-Y-06溶磷能力隨著C/N的減小而顯著減少，當(dāng)C/N為40∶1時，其溶磷量最高，達(dá)到184.35 mg/L，是C/N為20∶1處理的1.13倍，C/N為8∶1處理的2.21倍，但是從培養(yǎng)介質(zhì)的pH變化來看，3個處理之間相差不大。菌體數(shù)量在C/N為40∶1時達(dá)到最大，8∶1時較少。

2.4.4 不同pH對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 表6表明，不同pH顯著影響菌株4-Y-06的溶磷能力，其中pH為7.0時，溶磷量達(dá)到最大(171.43 mg/L)，pH為7.5時次之(162.78 mg/L)。pH為7.0和7.5時菌株數(shù)量顯著大于其他處理，綜合溶磷量及菌株數(shù)量可以看出，菌株4-Y-06最適pH為7.0～7.5。此外，各處理的終pH值均比初始pH小，有可能是菌株4-Y-06在發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機(jī)酸，導(dǎo)致pH值降低。

2.4.5 不同溫度對菌株4-Y-06溶磷能力的影響 表7表明，不同溫度顯著影響菌株4-Y-06的溶磷能力，當(dāng)溫度為30 ℃時，其溶磷量達(dá)到最大(183.78 mg/L)，菌株數(shù)量也達(dá)到最高(4.3×1010cfu/mL)，說明菌株4-Y-06最適溫度為30 ℃。各處理后發(fā)酵液的pH值差異不顯著，但均比初始pH值小，可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)有機(jī)酸的原因。

3 討 論

郝晶等[12]認(rèn)為菌株的D值，D/d和溶磷量之間并不總是呈正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)合溶磷圈法和鉬銻抗比色法綜合分析，最終篩選出一株解磷效果最強(qiáng)的菌株4-Y-06。然而，解磷微生物的解磷作用并不是一成不變的，隨著外界環(huán)境或是營養(yǎng)物質(zhì)的變化，會改變解磷菌的生長代謝途徑，甚至影響解磷菌的生長和繁殖，從而導(dǎo)致解磷效果的不穩(wěn)定。有關(guān)研究表明，溶磷能力的大小主要是由菌株的特性所決定的，在不同的條件下，菌株的解磷能力有很大差異[13]。此外，虞偉斌等[14]報道同一株磷細(xì)菌在不同的碳氮源或C/N時表現(xiàn)的解磷能力并不一致，解磷菌表現(xiàn)出的解磷能力與其所處環(huán)境有很大關(guān)系。趙小蓉等[13]研究表明，菌體的生長量與溶磷量間并不是總成正相關(guān)關(guān)系，有時有機(jī)酸的作用更大。不同的碳源會改變菌株分泌有機(jī)酸種類，Patel等[15]發(fā)現(xiàn)Citrobactersp. DHRSS解磷菌以蔗糖和果糖為碳源時主要分泌乙酸，當(dāng)以葡萄糖和麥芽糖為碳源時主要分泌葡萄糖酸。劉曉芳等[16]報道，兩株黑曲霉ML2、ML4隨著C/N的增加，菌體生長量隨之增大，菌株的溶磷量先是隨C/N的升高而升高，后又降低，在C/N為35∶1時達(dá)到最大。本研究發(fā)現(xiàn)菌株4-Y-06在碳源為蔗糖、氮源為硫酸銨、C/N為20∶1的培養(yǎng)條件下更適合發(fā)揮其解磷作用，說明不同的菌株都有自身最適合的培養(yǎng)條件。此外，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，各處理經(jīng)發(fā)酵7 d后，上清液pH值均比初始pH值低，這有可能是菌株4-Y-06在發(fā)酵過程中不斷產(chǎn)生有機(jī)酸，有機(jī)酸不斷溶解培養(yǎng)基中的不溶性卵磷脂，致使發(fā)酵液中的可溶性磷含量不斷增加，有機(jī)酸的不斷產(chǎn)生同時引起發(fā)酵液的pH值下降，這與賀夢醒[17]的研究結(jié)果基本一致。

表4 不同氮源對菌株4-Y-06溶磷效果的影響

表5 不同C/N對菌株4-Y-06溶磷效果的影響

表6 不同pH對菌株4-Y-06溶磷效果的影響

表7 不同溫度對菌株4-Y-06溶磷效果的影響

4 結(jié) 論

采用溶磷圈法和鉬銻抗比色法綜合分析，最終得出菌株4-Y-06溶磷活性最強(qiáng)。結(jié)合菌株4-Y-06的菌落形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析等研究，初步鑒定菌株4-Y-06為嗜氣芽孢桿菌(Bacillusaerophilus)。且經(jīng)研究表明菌株4-Y-06在碳源為蔗糖、氮源為硫酸銨、C/N為40∶1、pH 7.0～7.5、30 ℃條件下解磷效果最好。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Isolation, Identification and Culture Condition of Phosphate-solubilizing Bacteria Derived from Camellia Rhizosphere Soil

LIU Xiao-yu，F(xiàn)U Deng-qiang，JIA Xiao-cheng, CHEN Liang-qiu

(Coconut Research Institute, CATAS, Hainan Wenchang 571339，China)

Seven strains phosphate solubilizing bacteria were screened from the rhizosphere of camellia , and strain 4-Y-06 with the highest capacity of solubilizing phosphate was gained, by utilizing the method of transparent zone and molybdenum-antimony anti-spectrophotometric. According to morphology of the colony , physiological and biochemical properties, 16S rDNA and phylogenetic analysis, Strain 4-Y-06 was identified asBacillusaerophilus. In addition, the ability of phosphate solubilization by strain 4-Y-06 was studied with different cultivation conditions including differenr carbon sources,nitrogen forms,C/N,pH,temperatures. The results showed that strain 4-Y-06 had the highest capacity of phosphate solubilization when sucrose was used as carbon source,ammonium sulfate was used as nitrogen form,C/N was 40∶1，pH was 7.0-7.5 and the temperature was 30 ℃.

Phosphate solubilizing bacteria；Carbon source；Nitrogen form；Cultivation condition

1001-4829(2016)11-2637-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.023

2015-12-28

海南省產(chǎn)學(xué)研一體化專項(xiàng)項(xiàng)目(cxy20150020)

劉小玉(1986-),女,江西九江人，碩士研究生,研究實(shí)習(xí)員,主要從事土壤微生物與油茶豐產(chǎn)栽培技術(shù)研究，E-mail:liuxiaoyu06120210@163.com。

S714.4

A