王連生 徐奇友 陳 迪,2 鄭榮寧

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；3.連云港金陵飼料有限公司，連云港222313)

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不同蛋白質(zhì)源飼料中添加α-酮戊二酸對雜交鱘幼魚肝臟谷氨酰胺含量、抗氧化能力及生長激素、胰島素樣生長因子-Ⅰ基因表達(dá)的影響

王連生1徐奇友1陳 迪1,2鄭榮寧3

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；3.連云港金陵飼料有限公司，連云港222313)

雜交鱘幼魚；α-酮戊二酸；谷氨酰胺；抗氧化；生長激素基因；胰島素樣生長因子-Ⅰ基因

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，AKG)作為Gln的前體物質(zhì)，是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，可以與氨結(jié)合生成谷氨酸和Gln。AKG能有效促進(jìn)機(jī)體氮代謝，可以降低銨離子對機(jī)體的毒性[8]。AKG可以激活雷帕霉素靶蛋白信號通路，進(jìn)而促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)沉積[9]。鯉魚飼料中添加AKG能顯著提高谷氨酰胺酶(GS)基因的表達(dá)量，進(jìn)而提高機(jī)體Gln的含量[10]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究了AKG對雜交鱘和松浦鏡鯉生長、氨氮應(yīng)激、腸道健康及抗氧化功能的影響，在不同飼料原料、不同飼料蛋白質(zhì)水平條件下均具有促進(jìn)生長的作用，在氨氮應(yīng)激條件下可以通過提高熱應(yīng)激蛋白減緩應(yīng)激作用，同時(shí)具有改善腸道形態(tài)、提高抗氧化能力的作用[11-15]。肝臟是機(jī)體氨基酸代謝的主要場所，本試驗(yàn)擬在不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG，研究AKG對雜交鱘幼魚肝臟功能的影響，并進(jìn)一步研究AKG對肝臟中生長相關(guān)基因生長激素(GH)和胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因表達(dá)的影響，為Gln在雜交鱘飼料中的應(yīng)用進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交鱘幼魚購自北京房山鱘魚養(yǎng)殖基地。AKG購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98.5%。

1.2 試驗(yàn)飼料

分別以大豆?jié)饪s蛋白(SPC)和SPC+魚粉(FM，進(jìn)口)為蛋白質(zhì)源，并在此基礎(chǔ)上分別添加0和1%的AKG，配制蛋白質(zhì)水平均為44%的4種試驗(yàn)飼料，試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。各組原料經(jīng)粉碎，過40目篩，逐級混勻，制成粒徑為2.0 mm的顆粒飼料，室溫條件下通風(fēng)干燥后，在-20 ℃冰柜存放。

1.3 試驗(yàn)分組及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用雜交鱘幼魚用食鹽水(5%)消毒后暫養(yǎng)2周。挑選健康、大小均一、平均體重為(7.65±0.04) g的試驗(yàn)魚500尾，隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25魚。養(yǎng)殖水環(huán)境條件為溫度(21.2±1.0) ℃，溶氧濃度大于5 mg/L，pH 7.8，自然光照。試驗(yàn)期間每天投喂3次，投喂時(shí)間分別為08:00、13:00和17:00，每次飽食投喂，投喂量約為魚體重的5%，每天投喂后吸取殘餌和糞便，定期檢測水質(zhì)，每天換去水族箱內(nèi)1/3水并注入已曝氣的水，確保水質(zhì)良好，養(yǎng)殖周期為8周。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目Items試驗(yàn)飼料Experimentaldiets1234食鹽NaCl0.500.50合計(jì)Total100.00100.00100.00100.00營養(yǎng)水平Nutrientlevels粗蛋白質(zhì)CP44.0544.2944.2844.04粗脂肪EE15.9715.4316.4416.33

預(yù)混料為每千克飼料提供The premix provided the following per kg of diets：VA 8 000 IU，VE 70 mg，硫胺素 thiamine 18 mg，VB235 mg，VB618 mg，泛酸 pantothenic acid 50 mg，煙酸 niacin 200 mg，生物素 biotin 2.5 mg，VB120.6 mg，葉酸 folic acid 6 mg，肌醇 inositol 1 000 mg，膽堿 choline 5 000 mg，VC 500 mg，VD32 000 IU，VK 7 mg，Zn 65 mg，F(xiàn)e 75 mg，Cu 3.5 mg，Mn 16 mg，I 0.65 mg，Co 0.1 mg，Se 0.1 mg。

1.4 樣品采集與分析

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，饑餓24 h，從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取4尾魚，用麻醉劑間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)麻醉后取其肝臟，按質(zhì)量(g)與體積(mL)比為1∶9加入預(yù)冷的生理鹽水，然后用FJ-200CL高速組織勻漿機(jī)勻漿(15 000 r/min，3 min)稀釋，在4 ℃下以4 000 r/min離心10 min，取上清液放入1.5 mL離心管中，保存于冰箱(-40 ℃)中，用于Gln含量、CS活性、堿性磷酸酶(ALP)活性及抗氧化指標(biāo)分析。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定Gln含量、CS活性、ALP活性、還原型谷胱甘肽(GSH)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量，具體方法參見試劑盒說明書。

每個(gè)重復(fù)另隨機(jī)取3尾魚的肝臟，包裹在錫箔紙中，迅速投入到液氮中，使其迅速冷凍，然后置于-80 ℃冰箱中儲存，用于肝臟中GH、IGF-Ⅰ基因相對表達(dá)量的測定。肝臟總RNA的提取根據(jù)總RNA提取試劑盒SV total RNA Isolation System (Promega)說明書進(jìn)行。cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，步驟見PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)說明書，結(jié)束后于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。利用Primer premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)鱘魚類GH、IGF-Ⅰ mRNA的基因序列，設(shè)計(jì)GH、IGF-Ⅰ的引物，IGF-Ⅰ：5′-TCATCGCCCTGACAGTCTACAT-3′(F)，5′-GGTCGCCTGCTGAAATAAAAG-3′(R)；GH：5′-AGATGAGCAGCGTCACTCCAGC-3′(F)，5′-AGAGCCACAATACCTTCCTCCA-3′(R)；18S rRNA：5′-CCGCTTTGGTGACTCTGGAT-3′(F)，5′-CTTGGATGTGGTAGCCGTTTC-3′(R)。所有引物由生工生物工程(上海)公司合成。采用Aapplied Biosystems 7500 Real-Time PCR System檢測各組GH、IGF-ⅠmRNA的實(shí)時(shí)表達(dá)量，PCR反應(yīng)體系為20 μL。采用2-ΔΔCT法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以蛋白質(zhì)源和AKG添加量為影響因素，采用雙因素方差分析，顯著性水平為P<0.05，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟Gln含量、GS活性和ALP活性的影響

不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟Gln含量、GS活性和ALP活性的影響見表2。雙因素方差分析表明：AKG添加量顯著影響肝臟Gln含量和GS活性(P<0.05)，飼料中添加1% AKG顯著提高肝臟Gln含量和GS活性(P<0.05)，對ALP活性無顯著影響(P>0.05)。蛋白質(zhì)源對肝臟Gln含量、GS活性和ALP活性無顯著影響(P>0.05)，蛋白質(zhì)源和AKG添加量對肝臟Gln含量、GS活性和ALP活性無顯著交互作用(P>0.05)。

表2 不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟Gln含量、GS活性和ALP活性的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響見表3。雙因素方差分析表明：AKG添加量顯著影響肝臟MDA、GSH含量(P<0.05)，飼料中添加1% AKG顯著降低肝臟MDA含量(P<0.05)，顯著提高肝臟GSH含量(P<0.05)。蛋白質(zhì)源顯著影響肝臟GSH含量(P<0.05)，與SPC+FM作為蛋白質(zhì)源相比，SPC作為蛋白質(zhì)源顯著提高肝臟GSH含量(P<0.05)。蛋白質(zhì)源和AKG添加量對肝臟SOD和CAT活性均無顯著影響(P>0.05)，且蛋白質(zhì)源和AKG添加量對肝臟各抗氧化指標(biāo)無顯著交互作用(P>0.05)。

表3 不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟IGF-Ⅰ、GH基因表達(dá)的影響

各組雜交鱘幼魚肝臟IGF-Ⅰ、GH基因的相對表達(dá)量見表4。雙因素方差分析表明：AKG添加量顯著影響肝臟IGF-Ⅰ、GH基因的相對表達(dá)量(P<0.05)，飼料中添加1% AKG顯著提高肝臟IGF-Ⅰ、GH基因的相對表達(dá)量(P<0.05)。蛋白質(zhì)源顯著影響肝臟IGF-Ⅰ、GH基因的相對表達(dá)量(P<0.05)，與SPC+FM作為蛋白質(zhì)源相比，SPC作為蛋白質(zhì)源顯著提高肝臟IGF-Ⅰ和GH基因的相對表達(dá)量(P<0.05)。蛋白質(zhì)源和AKG添加量對肝臟IGF-Ⅰ、GH基因的相對表達(dá)量無顯著交互作用(P>0.05)。

表4 不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟IGF-Ⅰ、GH基因相對表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟Gln含量、GS活性和ALP活性的影響

3.2 不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟抗氧化能力的影響

機(jī)體抗氧化系統(tǒng)由抗氧化酶系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)組成?？寡趸赶到y(tǒng)主要包括SOD、谷胱甘肽過氧化物還原酶(GSH-Px)、CAT等，非酶抗氧化系統(tǒng)主要包括GSH、維生素E、維生素C等[18]。動物組織里的MDA能使核酸、蛋白質(zhì)和腦磷脂發(fā)生交聯(lián)而喪失活性。因此，MDA含量的測定對機(jī)體脂質(zhì)氧化程度有很好的指示作用，而且可以間接地反映出機(jī)體細(xì)胞組織受損傷程度[19]。GSH主要起到維持機(jī)體氧化平衡的作用，是抵抗活性氧損害的主要物質(zhì)，能夠綜合反映組織細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力及受氧化損傷程度[20]。AKG作為機(jī)體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，除了參與三羧酸循環(huán)外，還參與機(jī)體內(nèi)多種生理生化過程。AKG作為一種抗氧化劑，在機(jī)體活性氧自由基清除方面發(fā)揮重要作用[21]。體外試驗(yàn)研究表明，AKG可以抑制過氧化氫對人紅細(xì)胞或神經(jīng)元誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[22-23]。在氨氮應(yīng)激條件下，飼料中添加AKG能顯著提高雜交鱘機(jī)體SOD、GSH-Px、CAT活性，且降低MDA含量[12]。對大鼠的研究同樣表明AKG能提高機(jī)體SOD和CAT的活性，其主要是原因由于AKG促進(jìn)機(jī)體脂肪代謝，抑制氧自由基的產(chǎn)生[8]，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。此外，本試驗(yàn)中，飼料中添加1% AKG可提高雜交鱘肝臟中Gln的含量，而Gln可以顯著提高雜交鱘的抗氧化酶活性[24]。

3.3 不同蛋白質(zhì)源飼料中添加AKG對雜交鱘幼魚肝臟IGF-Ⅰ和GH基因表達(dá)的影響

GH對促進(jìn)動物的生長發(fā)育起決定性的作用。GH是通過由垂體分泌的生長因子刺激合成并釋放出IGF-Ⅰ作用于靶細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體的生長[25]。IGF-Ⅰ主要由生長因子作用于肝臟，在肝臟的循環(huán)代謝中產(chǎn)生的，在機(jī)體的生長發(fā)育、免疫功能、骨骼增長以及繁殖方面都有積極的促進(jìn)作用。仔豬血液中IGF-Ⅰ的水平和體重的增長呈正相關(guān)趨勢[26-27]。有研究表明，AKG攝入到人類體內(nèi)明顯地提高了血漿中一些激素的水平，例如胰島素、GH和IGF-Ⅰ等[28]。斷奶仔豬飼糧中添加AKG能有效改善脂多糖對血清中IGF-Ⅰ水平產(chǎn)生的負(fù)面影響[29]。這些研究結(jié)果都表明IGF-Ⅰ在機(jī)體的生長方面起著積極的促進(jìn)作用。另有研究表明，IGF-Ⅰ與GH對生長的促進(jìn)功能具有協(xié)同作用[30]。本試驗(yàn)研究表明，1% AKG的添加顯著提高了肝臟中IGF-Ⅰ和GH基因的相對表達(dá)量，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體的生長。

4 結(jié) 論

雜交鱘幼魚飼料中添加1% AKG可以通過提高肝臟中GS的活性進(jìn)而提高Gln的含量，通過提高肝臟中GSH的含量進(jìn)而降低MDA的含量，并可提高肝臟中生長相關(guān)基因GH、IGF-Ⅰ的表達(dá)。

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Author, WANG Liansheng, assistant professor, E-mail： wangliansheng@hrfri.ac.cn

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Effects of Dietary α-Ketoglutarate Supplementation on Liver Glutamine Content, Antioxidant Capacity and the Expressions of Growth Hormone and Insulin-Like Growth Factor Ⅰ Genes of Juvenile Hybrid Sturgeon Fed Different Protein Source Diets

WANG Liansheng1XU Qiyou1CHEN Di1,2ZHENG Rongning3

(1.HeilongjiangRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Harbin150070,China; 2.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China; 3.LianyungangJinlingFeedCo.,Ltd.,Lianyungang222313,China)

The aim of this experiment was to study the effects of α-ketoglutarate (AKG) supplementation on liver glutamine (Gln) content, antioxidant capacity and the expressions of growth hormone (GH) and insulin-like growth factor Ⅰ (IGF-Ⅰ) genes of juvenile hybrid sturgeon fed different protein source diets. Four experimental diets were formulated using soybean protein concentrate (SPC) or SPC+fish meal (FM) as protein sources and with 0 or 1% AKG. A total of 500 juvenile hybird sturgeon with an average initial body weight of (7.65±0.04) g were randomly divided into 4 groups with 5 replicates per group and 25 fish per replicate. The experiment lasted for 8 weeks. The results showed that the supplementation of 1% AKG significantly increased the liver Gln content and glutamine synthetase(GS) activity (P<0.05), but had no significant effect on liver alkaline phosphatase (ALP) activity (P>0.05). Protein source had no significant effects on liver Gln content, GS activity and ALP activity (P>0.05), and the protein source and AKG supplemental level had no significant interaction effects on liver Gln content, GS activity and ALP activity (P>0.05). The supplementation of 1% AKG significantly decreased the content of liver malondialdehyde (MDA), and increased the content of liver glutathione (GSH) (P<0.05). Compared with the SPC+FM, SPC as the protein source significantly increased the content of liver GSH (P<0.05). Protein source and AKG supplemental level had no significant effects on liver superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities (P>0.05), and protein source and AKG supplemental level had no significant interaction effects on all liver antioxidant indices (P>0.05). The supplementation of 1% AKG significantly increased the relative expression levels of liverIGF-Ⅰ andGHgenes (P<0.05). Compared with the SPC+FM, SPC as the protein source significantly increased the relative expression levels of liverIGF-Ⅰ andGHgenes (P<0.05). protein source and AKG supplemental level had no significant interaction effects on the relative expression levels of liverIGF-Ⅰ andGHgenes (P>0.05). In conclusion, the supplementation of 1% AKG in juvenile hybrid sturgeon diet increase the content of Gln by increasing the GS activity, reduce the content of MDA by increasing the content of GSH, and can improve the liver growth related geneIGF-Ⅰ andGHexpression.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(12)：3917-3924]

juvenile hybrid sturgeon; α-ketoglutarate; glutamine; antioxidation;GHgene;IGF-Ⅰ gene

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.12.025

2016-05-31

黑龍江水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(HSY201408)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)(201003055)

王連生(1984—)，男，內(nèi)蒙古豐鎮(zhèn)人，助理研究員，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail： wangliansheng@hrfri.ac.cn

S963

A

1006-267X(2016)12-3917-08