江愛(ài)明，曹 俊，蔡高磊

(1 漢江師范學(xué)院 生物化學(xué)與環(huán)境工程系，湖北十堰 442000；2 十堰市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北十堰 442000)

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秦巴山區(qū)石斛屬親緣關(guān)系及金釵石斛遺傳多樣性ISSR分析

江愛(ài)明1，曹 俊1，蔡高磊2*

(1 漢江師范學(xué)院 生物化學(xué)與環(huán)境工程系，湖北十堰 442000；2 十堰市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北十堰 442000)

為研究秦巴山區(qū)石斛屬親緣關(guān)系，利用5條ISSR引物對(duì)秦巴地區(qū)石斛屬植物12個(gè)居群的遺傳多樣性進(jìn)行了初步探討。結(jié)果表明：(1)UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，金釵石斛(DendrobiumnobileLindl)、曲莖石斛(D.flexicauleZ. H. Tsi)和細(xì)葉石斛(D.hancockiiRolfe)分別聚為三支，在分子水平上出現(xiàn)了明顯的分化，揭示三者是獨(dú)立物種。(2)金釵石斛種下6個(gè)居群可明顯分為2支，LJ、MT、YP和WF遺傳一致度較近聚為一支；YJ和PT遺傳高度一致，遺傳距離最近聚在一起。(3)金釵石斛種下居群間Nei’s總基因多樣性(Ht)為0.388，基因分化系數(shù)(Gst)為0.934，顯示金釵石斛居群間存在較高的遺傳分化。研究結(jié)果揭示了秦巴山區(qū)石斛屬植物的親緣關(guān)系，從分子水平上為其鑒定提供了依據(jù)，并為金釵石斛的資源利用和遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

金釵石斛；ISSR；遺傳多樣性

石斛屬(DendrobiumSw.)植物多為附生植物，約1 000種，廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)至大洋洲。中國(guó)有74種和2變種，主要分布在秦嶺以南諸省區(qū)。國(guó)內(nèi)種類中具細(xì)莖而花小的類群，如細(xì)莖石斛、鐵皮石斛、梳唇石斛、美花石斛、鉤狀石斛、霍山石斛和金釵石斛等，這其中以金釵石斛(DendrobiumnobileLindl)尤為珍貴[2]，以秦巴山區(qū)產(chǎn)量較多，質(zhì)量最好[3]。因其含有石斛堿及多糖類物質(zhì)，具有較高的藥用價(jià)值而名列“中華九大仙草”之首[4]。由于近年來(lái)過(guò)度開(kāi)采、生態(tài)環(huán)境破壞及自身生長(zhǎng)緩慢等原因，野生金釵石解愈來(lái)愈少。近幾年研究人員主要進(jìn)行野生金釵石斛資源的保護(hù)，但是對(duì)該地區(qū)金釵石斛遺傳多樣性研究還很欠缺。

ISSR(inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增)是由Zietkiewicz[5]等于1994年創(chuàng)建的一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的新型分子標(biāo)記，該技術(shù)具有DNA用量小、成本低、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、遺傳關(guān)系及遺傳多樣性、基因標(biāo)記、指紋圖譜的建立等多方面的研究[6-7]。馬佳梅等[8]建立并優(yōu)化了流蘇石斛ISSR反應(yīng)體系；盧家仕等[9]采用ISSR技術(shù)對(duì)云南及廣西地區(qū)石斛屬親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，將24份不同產(chǎn)地石斛樣品劃分為 6個(gè)類群，揭示了居群間豐富的遺傳多樣性，為石斛屬親緣關(guān)系的鑒定提供了依據(jù)。本研究采用ISSR標(biāo)記，對(duì)秦巴山區(qū)不同海拔、不同地點(diǎn)12個(gè)居群的石斛屬進(jìn)行基因組多態(tài)性研究，分析石斛樣品的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為更好地保護(hù)和利用本地區(qū)的石斛資源提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料12個(gè)居群，共計(jì)514個(gè)個(gè)體，其中金釵石斛、曲莖石斛(圖1)和細(xì)葉石斛的居群數(shù)分別為6、4、2個(gè)。各居群的樣地信息和采樣個(gè)體數(shù)見(jiàn)表1，居群采樣時(shí)，每個(gè)個(gè)體間隔50 m以上，并將野外采集的個(gè)體引種栽培于實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 ISSR標(biāo)記

稱取新鮮石斛葉片5 g于研缽中液氮研磨，采用MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit(TaKaRa公司提供)提取基因組DNA，最后加入100μL×1TAE Buffer(pH8.0)溶解DNA。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品的濃度和純度，-20℃下貯存?zhèn)溆谩８鶕?jù)哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的引物序列，從中篩選出穩(wěn)定性好，重復(fù)性強(qiáng)且條帶清晰的引物作為本次實(shí)驗(yàn)引物，引物編號(hào)及序列見(jiàn)表2。

表1 石斛屬采樣基本數(shù)據(jù)

圖1 石斛屬植物形態(tài)Fig.1 The morphology of Dendrobium

從每個(gè)居群選取4個(gè)個(gè)體進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μL：包含1 μL Tks Gflex DNA Polymerase(TaKaRa公司提供)，12 μL 2×Gflex Buffer(TaKaRa公司提供)，1 μL基因組DNA，1 μL SSR引物，10 μL ddH2O。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性45 s，53 ℃～57 ℃(視引物Tm而定)退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。用含有Gold view的1.5%瓊脂糖凝膠于120 V恒壓電泳45 min。最后在凝膠成像系統(tǒng)(北京六一WD-9413B)上進(jìn)行拍照并保存，用于后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

當(dāng)三喜突然撲出將那只呆頭呆腦的肥大野兔死死摁住的時(shí)候，他心里興奮的不是如何將它做成清蒸、紅燒或者烹炒的種種兔肉，與全家人一番大快朵頤，而是心里迅速就堅(jiān)定了一個(gè)信念：我必須用槍來(lái)把它射殺，對(duì)，就是用槍，而不是其它的任何一種方式，以此給全村人一個(gè)說(shuō)法：我三喜不但會(huì)打槍，而且槍法相當(dāng)相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)。不是說(shuō)眼見(jiàn)為實(shí)嗎，那你們就好好看看吧，這，就是我三喜打死的兔子！

ISSR作為顯性分子標(biāo)記視每一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)為一個(gè)等位基因。在同一相對(duì)遷移位置出現(xiàn)清晰條帶的計(jì)為1，沒(méi)有或模糊的條帶記為0，將條帶數(shù)據(jù)信息構(gòu)建成0和1的原始數(shù)據(jù)矩陣。使用POPGENE1.32軟件分析遺傳變異的各項(xiàng)參數(shù)：Nei’s基因多樣度指數(shù)(H)、平均每個(gè)位點(diǎn)上的觀察等位基因數(shù)(Na)、平均每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因(Ne)、Shannon多樣性信息指數(shù)(I)、居群間遺傳分化系數(shù)(Gst)、居群內(nèi)基因多樣度(Hs)、總的基因多樣度(Ht)、基因流(Nm)等。利用NTSYS2.1軟件計(jì)算供試材料之間的遺傳距離，采用非加權(quán)類平均法(UPGMA)對(duì)遺傳距離進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA純度檢測(cè)

用TaKaRa 9770A試劑盒提取12份石斛基因組DNA后，經(jīng)1% Agarose 電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示：12個(gè)泳道都出現(xiàn)一條清晰的DNA條帶，無(wú)拖尾現(xiàn)象，表明蛋白質(zhì)和 RNA的含量極少(圖2)。用紫外分光光度法檢測(cè)所有DNA的OD260/OD280值，均在1.85～1.98，質(zhì)量濃度在 350～360 ng/μL。以上結(jié)果表明提取的DNA純度較高，質(zhì)量濃度均勻，符合PCR模板的要求。

2.2 ISSR結(jié)果分析

圖3為引物UBC 900對(duì)12個(gè)石斛屬材料的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其它引物都達(dá)到很好的擴(kuò)增效果，表明選定的反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序效果較好，擴(kuò)增產(chǎn)物可用于下一步的數(shù)據(jù)分析。

用ISSR引物UBC840、UBC 841、UBC 842、UBC 899、UBC 900對(duì)全部石斛屬樣本進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增條帶清晰，如圖3中引物UBC 900對(duì)樣品擴(kuò)增結(jié)果所示。表2分析表明，5條引物擴(kuò)增共檢測(cè)到80個(gè)清晰的條帶，每條引物平均擴(kuò)增出16個(gè)片段。采用POPGENE1.32軟件進(jìn)行分析，5條引物在12個(gè)石斛屬居群中擴(kuò)增的遺傳多樣性參數(shù)(表3)顯示：共檢測(cè)到13個(gè)等位基因，觀測(cè)的等位基因數(shù)(Na)3.4～8.2，平均等位基因數(shù)為5.38。有效等位基因(Ne)1.633～1.982，平均值為1.852。Nei’s基因多樣度指數(shù)(H)0.388～0.495，平均值為0.457。Shannon多樣性信息指數(shù)(I)0.576～0.689，平均值為0.649，表明5條引物擴(kuò)展產(chǎn)物均具有多態(tài)性，可用于石斛屬各居群的遺傳多樣性分析。

M.DL2000；1．LJ；2．MT；3．YJ；4．WF；5．YP；6．PT；7．HS；8．QL；9．ZJ；10．HF；11．BM；12．CL；居群編號(hào)同表1；圖3同圖2 提取石斛DNA電泳圖M.DL2000；1．LJ；2．MT；3．YJ；4．Wsame as Table 1；The same as Fig.3Fig.2 DNA electrophoresis of Dendrobium Sw extracted with kit

圖3 引物UBC900對(duì)樣品的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 ISSR bands of Dendrobium Sw amplified with primer UBC900

表2 ISSR引物序列及其PCR擴(kuò)增的多態(tài)性

Note：Y=C/T

表3 石斛居群遺傳多樣性

表4 石斛屬居群多樣性Nei’s分析

2.3 石斛居群遺傳分化分析

石斛屬居群多樣性Nei’s分析(表4)顯示，金釵石斛6個(gè)居群Ht為0.388，Hs為0.158，Gst為0.934，即93.4%的變異存在于居群之間，6.6%的變異存在于居群內(nèi)，結(jié)果顯示居群間的遺傳分化大于居群內(nèi)的分化。居群間的基因流(Nm)為0.214，表明居群之間的基因流水平較低。曲莖石斛4個(gè)居群Ht為0.254，Hs為0.083，Gst為0.772，居群間的基因流(Nm)為0.136，說(shuō)明遺傳變異主要來(lái)自于居群間。細(xì)葉石斛2個(gè)居群Ht為0.171，Hs為0.111，Gst為0.533，居群間的基因流(Nm)為0.214。物種間Nm為0.035，表明物種之間的基因交流幾乎不發(fā)生。

2.4 石斛屬聚類分析

采用POPGENE1.32軟件分析得出，石斛屬12個(gè)居群兩兩間的Nei’遺傳一致度(Hi)范圍為0.593 3～0.911 8，遺傳距離(D)為0.092 3～0.522 0(表5)。YJ與PT居群間遺傳一致度最高(Hi=0.911 8)，遺傳距離最近(D=0.092 3)；通過(guò)NTSYSpc-2.1聚類分析軟件構(gòu)建各居群間親緣關(guān)系系統(tǒng)樹(shù)，并計(jì)算表5金釵石斛居群間遺傳相似系數(shù)(Gs)(圖4)。各材料間UPGMA聚類結(jié)果顯示，Gs范圍0.36～0.88，平均值為0.62。Gs最低值存在于細(xì)葉石斛和金釵石斛之間為0.36，這表明其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；最高值0.88為金釵石斛YJ和PT居群之間，說(shuō)明其親緣關(guān)系最近。金釵石斛6個(gè)居群按照遺傳距離遠(yuǎn)近以及遺傳一致度高低聚為2個(gè)大支。其中YJ和PT遺傳高度一致，遺傳距離最近，首先聚在一起為CladeⅡ；LJ、MT、YP和WF遺傳一致度與地理距離較近聚為CladeⅠ。通過(guò)聚類分析也表明，細(xì)葉石斛與曲莖石斛先聚為一支，二者親緣關(guān)系較近；金釵石斛單獨(dú)聚為一支，與曲莖石斛、細(xì)葉石斛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表5 石斛屬各個(gè)居群間的Nei’s遺傳一致度(對(duì)角線上方)和遺傳距離(對(duì)角線下方)

圖4 石斛屬UPGMA聚類圖Fig.4 UPGMA dendrogram of the genetic relationship of Dendrobium Sw

3 討 論

3.1 秦巴山區(qū)石斛屬遺傳多樣性與種間親緣關(guān)系

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，一個(gè)居群遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，表明其對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)。因此對(duì)遺傳多樣性的研究可以揭示物種或居群的進(jìn)化歷史，也能為進(jìn)一步分析其進(jìn)化潛力和未來(lái)的命運(yùn)提供重要的資料，尤其有助于物種稀有或?yàn)l危原因及過(guò)程的探討。秦巴山區(qū)地處中國(guó)北亞熱帶向暖溫帶過(guò)渡地帶并對(duì)中國(guó)植物區(qū)系的演化與分化研究具有重要意義，該區(qū)域地貌類型豐富、氣候溫暖濕潤(rùn)，是中國(guó)生物多樣性分布的中心地區(qū)之一[10]。本研究中，通過(guò) ISSR標(biāo)記顯示金釵石斛(D.nobileLindl)、曲莖石斛(D.flexicauleZ.H.Tsi)具有較高的遺傳多樣性。金釵石斛6個(gè)居群聚為2個(gè)大支，且CladeⅠ和CladeⅡ的遺傳分化明顯。曲莖石斛4個(gè)居群也聚為2類，但是HS居群和金釵石斛CladeⅡ的遺傳距離較近，究其原因可能是種群間還存在一定程度的基因流，針對(duì)石斛屬植物的特點(diǎn)而言，花粉的擴(kuò)散可能是植物基因流主要形式。這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，居群內(nèi)和居群間存在基因交流，秦巴山區(qū)石斛屬品種遺傳多樣性豐富，也為今后研究秦巴山區(qū)石斛屬種質(zhì)資源進(jìn)化發(fā)展提供依據(jù)。

3.2 秦巴山區(qū)金釵石斛遺傳多樣性及居群間遺傳分化

根據(jù)ISSR分析結(jié)果顯示，金釵石斛種下居群間Nei’s總基因多樣性(Ht)為0.388，基因分化系數(shù)Gst為0.934，這說(shuō)明金釵石斛居群間存在較高的遺傳分化。這一較高的遺傳多樣性一方面可能與秦巴山區(qū)復(fù)雜的地質(zhì)地貌有較大關(guān)聯(lián)[11-13]。山地的溫度、濕度、光照和土壤等環(huán)境因子較復(fù)雜，生活環(huán)境多變，可能會(huì)使物種的分布展現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。這種現(xiàn)象在秦巴山區(qū)藥用植物群落物種多樣性的研究中也有發(fā)現(xiàn)[14]。另一方面，長(zhǎng)期的地理隔離導(dǎo)致各居群間適應(yīng)不同的環(huán)境，從而產(chǎn)生較大的遺傳變異，從NTSYSpc-2.1聚類分析來(lái)看CladeⅠ和CladeⅡ正好處在秦嶺山脈的兩側(cè)，居群間基因之間正常的交流可能被山脈所阻斷，基因流(Nm)較小為(0.214)也驗(yàn)證了這一假設(shè)。

3.3 金釵石斛可持續(xù)利用與保護(hù)策略

金釵石斛是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，在“神農(nóng)本草經(jīng)”中列為上品?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)藥理研究表明，石斛在提高人體免疫能力、抗衰老、抑制腫瘤、補(bǔ)五臟虛勞等方面有明顯的效果，具有很高的藥用價(jià)值[15]。同時(shí)它還含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸，并含有豐富的Ca、Mg、P等無(wú)機(jī)元素，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[16-17]。秦巴山區(qū)是金釵石斛主要分布區(qū)之一，存在大量保存良好的野生資源。近年來(lái)，由于環(huán)境的破壞和人為掠奪性采挖，導(dǎo)致野生金釵石斛數(shù)量急劇下降。本研究通過(guò)石斛屬形態(tài)、經(jīng)緯度及海拔生長(zhǎng)特性結(jié)合ISSR分子標(biāo)記，把同名異種、同種異名或不同地方來(lái)源的品種資源進(jìn)行客觀的種質(zhì)鑒定,弄清它們之間的遺傳變化及親緣關(guān)系，從而更好地指導(dǎo)科研和實(shí)踐生產(chǎn)工作，更好地開(kāi)發(fā)、利用和保護(hù)秦巴山區(qū)石斛屬植物種質(zhì)資源。通過(guò)聚類分析顯示，金釵石斛6個(gè)居群可明顯分為2支，居群間93.4%變異，居群內(nèi)6.6%變異，居群間變異遠(yuǎn)大于居群內(nèi)，說(shuō)明具有很高的遺傳分化。通過(guò)野外實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，金釵石斛各居群所處生境有很大不同。LJ、MT和YP居群位于自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，居群生境破壞較少，但也遭到了人們過(guò)度的采挖。WF、YJ和PT居群多位于非自然保護(hù)區(qū)，處于荒山野嶺，人類開(kāi)墾、砍伐等因素干擾較明顯，導(dǎo)致這些居群的數(shù)量銳減，因此，對(duì)有巨大藥用價(jià)值的金釵石斛野生資源以及遺傳多樣性的保護(hù)意義重大。對(duì)現(xiàn)存金釵石斛居群應(yīng)該采取一些有效的保護(hù)措施，針對(duì)LJ、MT和YP居群，其生境破壞較少，應(yīng)主要采取就地保護(hù)，禁止人們過(guò)度采挖措施；針對(duì)WF、YJ和PT居群，應(yīng)采取保護(hù)居群的生存環(huán)境的措施，同時(shí)在一些具有優(yōu)良種質(zhì)庫(kù)的地區(qū)進(jìn)行育種繁殖，增加居群的數(shù)量。

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(編輯:宋亞珍)

Genetic Relationship of Dendrobium and Genetic Diversity of Dendrobium nobile in Qinling-Daba Mountains Revealed by ISSR

JIANG Aiming1，CAO Jun1，CAI Gaolei2*

(1 Faculty of Biochemistry and Environmental Engineering，Hanjiang Normal University, Shiyan，Huibei 442000, China；2 Shiyan Academy of Agricultural Science, Shiyan，Huibei 442000, China)

To understand the genetic relationship ofDendrobiumin Qinba，the genetic diversity of 12 populations was analyzed using five inter-simple sequence repeat(ISSR) markers．(1) The UPGMA analysis exhibited significant genetic differentiation amongD.nobileLindl，D.flexicauleZ. H. Tsi andD.hancockiiRolfe，which revealed that they are independent species．(2) Six populations ofD.nobilewere obviously divided into two branches，the populations of LJ, MT, YP and WF are classified as Clade I because of the close genetic consistency among them；the populations of YJ and PT are classified as CladeⅡdue to the highest degree of genetic consistency and genetic distance. (3) The Nei’s gene diversity (Ht) and coefficient of gene differentiation (Gst) ofD.nobilewere 0.388 and 0.934, respectively, which indicated that there were high diversity and gene differentiation among the populations ofD.nobile．Our findings clearly evidenced the genetic diversity ofD.nobilein different areas of Qinba, which will be used in identification and intellectual property protection．

Dendrobiumnobile；inter-simple sequence repeat(ISSR)；genetic diversity

1000-4025(2016)10-1977-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1977

2016-04-10;修改稿收到日期:2016-10-08

湖北省教育廳(Q20156001)

江愛(ài)明(1982-)，男，碩士，講師，主要從事藥用植物育種研究。E-mail：jiangaiming2003@126.com

*通信作者:蔡高磊，碩士，農(nóng)藝師，主要從事植物遺傳育種研究。E-mail：caigaolei@163.com

Q346+.5; Q789

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