張艷芳，孫瑞芬*，郭樹春，于海峰，石慧芹

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031；2 內(nèi)蒙古園藝研究院，呼和浩特 010010)

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向日葵E3泛素連接酶基因克隆及表達(dá)分析

張艷芳1，孫瑞芬1*，郭樹春1，于海峰1，石慧芹2

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031；2 內(nèi)蒙古園藝研究院，呼和浩特 010010)

該研究從向日葵中克隆了E3泛素連接酶基因HERC2，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和不同脅迫條件的表達(dá)分析。序列分析表明，HERC2(登錄號(hào)為KT832066)序列的CDS為1 608 bp，編碼535個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量131 kD，等電點(diǎn)為5.03。HERC2編碼的蛋白質(zhì)為疏水性蛋白質(zhì)，且為細(xì)胞質(zhì)蛋白；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明，向日葵HERC2可能定位在高爾基體中；該蛋白質(zhì)有5個(gè)RCC1保守結(jié)構(gòu)域。向日葵HERC2與已報(bào)道的其他植物同源蛋白有相似的保守區(qū)域，與醉蝶花親緣關(guān)系最近，而與大豆和野生大豆的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。與HERC2 cDNA對(duì)應(yīng)的gDNA(登錄號(hào)為KT832067)的ORF長(zhǎng)度為3 409 bp，與cDNA編碼序列比對(duì)結(jié)果表明，該gDNA由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，向日葵HERC2基因表達(dá)受非生物脅迫調(diào)節(jié)，在不同器官及不同非生物脅迫下存在特異性表達(dá)差異。研究認(rèn)為，HERC2基因應(yīng)答逆境脅迫具有其特定的表達(dá)模式，研究結(jié)果為加強(qiáng)對(duì)HERC2的利用奠定了基礎(chǔ)。

向日葵；E3泛素連接酶；基因克?。恍蛄蟹治?；基因表達(dá)

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，在生物細(xì)胞生命周期中不斷合成與降解，參與生物體內(nèi)幾乎全部的生理活動(dòng)[1]。蛋白質(zhì)降解是蛋白質(zhì)代謝中不可或缺的部分，生物通過降解蛋白來實(shí)現(xiàn)生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)平衡，完成整個(gè)生理代謝和生長(zhǎng)發(fā)育，以適應(yīng)新的環(huán)境[2]。真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解途徑主要有溶酶體途徑、泛素化途徑和胱天蛋白酶途徑三種。其中，泛素介導(dǎo)的蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是真核生物體內(nèi)具有高度特異性、最為重要的蛋白質(zhì)降解途徑，參與細(xì)胞周期調(diào)整、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、離子通道、生長(zhǎng)與凋亡、生物與非生物抗性等重要的生理過程[3-5]。泛素蛋白酶體途徑主要由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶(ubiquitin-ligating enzyme，E3)和26S蛋白酶體(proteasome)等組成，其對(duì)靶蛋白的降解是一種級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程[6]。在這個(gè)途徑中，泛素用來標(biāo)記需要降解的蛋白質(zhì)，被標(biāo)記的靶蛋白進(jìn)而被26S蛋白酶體識(shí)別并降解，細(xì)胞內(nèi)80%～90%的蛋白通過泛素途徑降解[7]。蛋白質(zhì)的泛素化修飾涉及一系列的酶參與反應(yīng)，包括泛素激活酶E1、結(jié)合酶E2以及連接酶E3。E3是泛素蛋白酶體途徑中種類最多，在底物的特異性選擇降解過程中作用最重要的成員，對(duì)靶蛋白的特異性識(shí)別起關(guān)鍵作用。E3分子量較大，約100～300 kD。根據(jù)其亞基成分和作用機(jī)制，可分為單亞基類型(如HECT、RING/Ubox)和多亞基類型(如SCF復(fù)合物、后期促進(jìn)復(fù)合物APC、CUL3-BTB、CUL4-DDB等)[8]。泛素連接酶所有的E3都具有連接靶蛋白和特定E2的能力，它通過調(diào)節(jié)蛋白的泛素化過程參與細(xì)胞內(nèi)的生理過程，主要功能是識(shí)別應(yīng)該被泛素化的靶蛋白，然后使活化的泛素靠近特異靶蛋白的賴氨酸，從而將泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白上去[9-10]。蛋白質(zhì)特定的翻譯后的修飾經(jīng)常作為其相應(yīng)的E3泛素連接酶識(shí)別的標(biāo)志。宋素勝等[11]認(rèn)為E3泛素連接酶在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中起關(guān)鍵作用。寧約瑟等[12]認(rèn)為E3泛素連接酶介導(dǎo)植物干旱脅迫響應(yīng)。楊玖霞等[13]認(rèn)為E3泛素連接酶參與了各種抗病信號(hào)反應(yīng)途徑的調(diào)控，在植物免疫反應(yīng)從最初病原物的識(shí)別到下游信號(hào)途徑等各個(gè)過程中發(fā)揮正調(diào)控或負(fù)調(diào)控作用。張雅芬[14]研究認(rèn)為E3泛素連接酶在番茄對(duì)灰霉病抗性反應(yīng)中起作用。阮松林等[15]研究發(fā)現(xiàn)，E3泛素連接酶在擬南芥響應(yīng)水分、鹽脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用。吳建民等[16]研究表明擬南芥E3泛素連接酶基因能夠被脫水、NaCl和ABA處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

本研究以‘內(nèi)葵雜4號(hào)’為試驗(yàn)材料，克隆了向日葵E3泛素連接酶基因HERC2的cDNA和gDNA的ORF，并分別對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和基因結(jié)構(gòu)分析，同時(shí)進(jìn)行了不同脅迫條件下HERC2的表達(dá)模式分析。研究結(jié)果對(duì)探索向日葵E3泛素連接酶基因的功能及利用具有重要意義，為進(jìn)一步解析其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供新線索。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘內(nèi)葵雜4號(hào)’種子由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院作物研究所向日葵課題組提供。試驗(yàn)在內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心植物培養(yǎng)室中進(jìn)行。選取飽滿、無病蟲害的種子，常溫下浸泡24 h后，播種于裝有等量蛭石的塑料盆(上口直徑16.5 cm、下口直徑12 cm、高12 cm)中，每盆播種30粒種子。待下胚軸伸長(zhǎng)3 cm左右將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗從蛭石中取出，用清水洗凈根部的蛭石。將塑料盆中裝滿等量的1/2MS營(yíng)養(yǎng)液，蓋上已打孔的塑料盆蓋(每個(gè)蓋子均勻打15個(gè)孔)，每3株小苗為一組，用海綿輕輕裹住下胚軸，放到1個(gè)孔中，根部全部浸入到營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)以適應(yīng)液體環(huán)境，培養(yǎng)期間每天更換1次新鮮的培養(yǎng)液。第1對(duì)真葉完全展開時(shí)，將塑料盆中的1/2MS營(yíng)養(yǎng)液換為含有等量的0、120、150和180 mmol·L-1NaCl，0、5、10和50 μmol·L-1ABA，0、5%、10%和20%PEG6000的1/2MS溶液中進(jìn)行脅迫處理，每種脅迫處理各1盆，每盆45株。以0、6、24和48 h為時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)處理每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)孔(9株)中的幼苗混合，分別取根、下胚軸、葉，立即于液氮中速凍，-80℃冰箱保存。

1.2 核酸提取及cDNA合成

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成 前期通過高通量測(cè)序完成的向日葵轉(zhuǎn)錄組[17]和數(shù)字化基因表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果中，得到120 mmol·L-1NaCl脅迫處理2 d向日葵葉片中候選基因HERC2(CL5734.Contig2-All)的表達(dá)量最高。因此，本研究以120 mmol·L-1NaCl脅迫2 d向日葵幼苗葉片為材料，利用TaKaRa公司的RNAiso Plus提取總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性和純度。用TaKaRa公司的PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA。具體操作步驟依據(jù)說明書進(jìn)行。

1.2.2 基因組DNA的提取 利用天根生化試劑(北京)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取相同材料的DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性和純度。具體操作步驟依據(jù)說明書進(jìn)行。

1.3 HERC2基因cDNA和gDNA開放閱讀框(ORF)的克隆

根據(jù)NaCl脅迫下向日葵根的mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中獲得的HERC2序列，在其ORF(Open Reading Frame)兩端設(shè)計(jì)特異性引物。以向日葵葉片的cDNA為模板，用TaKaRa公司LATaq，經(jīng)PCR擴(kuò)增cDNA片段。同時(shí)以基因組DNA為模板，用LATaq，PCR擴(kuò)增其對(duì)應(yīng)的gDNA(genomic DNA)片段。cDNA和gDNA反應(yīng)體系為50 μL：LATaq0.5 μL，10×LA PCR Buffer II(Mg2+Free) 5 μL，dNTP Mixture 8 μL，MgCl25 μL，E3F1 1 μL，E3R1 1 μL，cDNA/DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足到50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖電泳分析后，用Roche公司的High Pure PCR Product Purification Kit回收。分別連接到pGM-T載體上，進(jìn)行TA克隆并測(cè)序。pGM-T克隆試劑盒、TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化試劑(北京)有限公司。HERC2相關(guān)的引物合成在TaKaRa公司完成，序列測(cè)定在南京金斯瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，引物序列見表1。

1.4 HERC2基因的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找和翻譯HERC2 cDNA序列的CDS(Coding Sequence)；運(yùn)用在線分析軟件ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；運(yùn)用在線分析軟件ProtScale(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測(cè)；運(yùn)用在線分析軟件TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析目的蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用PSORT(http//psort.hgc.jp/form.html)分析蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；運(yùn)用在線分析軟件Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索和比對(duì)分析；運(yùn)用DNAMAN軟件將目的序列與已報(bào)道其他物種的E3泛素連接酶基因同源序列進(jìn)行多重比對(duì)，用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；運(yùn)用DNAMAN軟件將獲得的gDNA核苷酸序列與cDNA核苷酸序列比對(duì)分析基因結(jié)構(gòu)。

1.5 HERC2基因在不同脅迫下的表達(dá)分析

根據(jù)HERC2 cDNA的CDS設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物E3RTF1和E3RTR1，以向日葵18S rRNA(HM638219)為內(nèi)參基因(表1)。用RNAiso Plus提取不同脅迫處理的向日葵根、下胚軸、葉的總RNA，并稀釋到相同濃度，用TaKaRa公司的PrimeSript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，具體方法按照說明書進(jìn)行。采用Real-time PCR分析各處理向日葵葉中HERC2的相對(duì)表達(dá)量，并對(duì)每種脅迫處理相對(duì)表達(dá)量最高的時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行HERC2在不同器官中的相對(duì)表達(dá)量分析。Real-time PCR用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqII(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行，向日葵18S rRNA作為內(nèi)參。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為E3RTF1 0.5 μL、E3RTR1 0.5 μL、cDNA 1 μL、SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL、ddH2O補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量分析。采用方差分析檢測(cè)向日葵HERC2基因在不同非生物脅迫下不同時(shí)間表達(dá)水平的顯著性。

表1 HERC2相關(guān)的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 HERC2基因cDNA和gDNA的ORF克隆

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果得到HERC2基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，以120 mmol·L-1NaCl脅迫處理2 d向日葵葉片的總RNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得1條約1 700 bp的目的片段(圖1，A)?；厥湛寺y(cè)序結(jié)果表明該片段的長(zhǎng)度為1 690 bp，且與高通量測(cè)序結(jié)果一致。以DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得1條約3 500 bp的目的片段(圖1，B)，回收克隆測(cè)序結(jié)果表明該片段的長(zhǎng)度為3 491 bp。最終獲得HERC2基因的cDNA長(zhǎng)度為1 994 bp(基因登錄號(hào)為KT832066)，gDNA長(zhǎng)度為3 795 bp(基因登錄號(hào)為KT832067)。

2.2 HERC2基因cDNA和gDNA序列分析

對(duì)HERC2基因cDNA全長(zhǎng)序列分析表明，該基因具有完整的開放閱讀框，自起始密碼子ATG至終止密碼子TAG長(zhǎng)度為1 608 bp，編碼535個(gè)氨基酸(圖2)。運(yùn)用ProtParam軟件推測(cè)其編碼蛋白的理論分子量為131 kD，等電點(diǎn)為5.03。對(duì)HERC2編碼的氨基酸組成進(jìn)行分析，其中含量最高的是丙氨酸(Ala)，占28%，其后依次是蘇氨酸(Thr)占27.4%、甘氨酸(Gly)占26.4%，含量最少的為半胱氨酸(Cys)，占18.2%。分子式為C4841H8076N1608O2050S293，總原子數(shù)11 970，親水性平均系數(shù)0.662。運(yùn)用ProtScale軟件的Kyte & Doolittle算法對(duì)HERC2編碼的氨基酸進(jìn)行了疏水性分析，氨基酸在疏水性區(qū)域所占比重遠(yuǎn)大于親水性區(qū)域，預(yù)測(cè)HERC2編碼的蛋白質(zhì)為疏水性蛋白。TMHMM結(jié)果表明HERC2整條肽鏈都位于細(xì)胞膜外，不存在跨膜域，可能為細(xì)胞質(zhì)蛋白。運(yùn)用PSORT軟件在線預(yù)測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位情況，發(fā)現(xiàn)存在于高爾基體中的可能性比較大。通過Blast發(fā)現(xiàn)，有5個(gè)RCC1(Regulator of chromosome condensation 染色體濃縮調(diào)節(jié)因子)保守結(jié)構(gòu)域，分別為第33～88、91～153、224～272、287～333和337～395氨基酸。通過Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)HERC2與已報(bào)道的芝麻(XP_011081781.1)、黃色猴臉花(XP_012857820.1)、蓖麻(XP_015573157.1)、木豆(KYP65138.1)、馬鈴薯(XP_015170023.1)、香瓜(XP_008445010.1)、大豆(XP_003545609.1)、蒺藜狀苜蓿(XP_003603615.2)、野生大豆(KHN12959.1)、綠豆(原變種)(XP_014504264.1)和醉蝶花(XP_010541254.1)的E3泛素連接酶氨基酸序列相似性分別為58%、58%、57%、57%、57%、57%、56%、55%、54%、54%和53%。氨基酸序列多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)HERC2與以上11個(gè)物種基因推導(dǎo)氨基酸序列有相似的高度保守區(qū)域(圖3)。利用MEGA5.0軟件將向日葵與芝麻等11種植物的E3泛素連接酶氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，表明向日葵與醉蝶花親緣關(guān)系最近，而與大豆和野生大豆的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4)。HERC2 cDNA對(duì)應(yīng)的gDNA，經(jīng)序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)自起始密碼子ATG至終止密碼子TAA長(zhǎng)度為3 409 bp，與cDNA編碼序列比對(duì)結(jié)果表明該gDNA由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，5個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為94、174、36、113和1 191 bp，4個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為101、1 300、339和61 bp，內(nèi)含子兩端具有典型的GT/AG結(jié)構(gòu)。

M.DL5000；1.cDNA；2.gDNA圖1 HERC2 基因開放閱讀框cDNA和gDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of ORF cDNA and gDNA of HERC2 gene

圖2 HERC2 cDNA的CDS序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 CDS and its deduced amino acid sequence of HERC2 cDNA

2.3 HERC2基因的表達(dá)分析

實(shí)施熒光定量PCR分析表明，向日葵幼苗受到NaCl、ABA和PEG的脅迫后，葉片中的HERC2表達(dá)量較對(duì)照均有所增加，但增加的倍數(shù)有所不同。說明HERC2在不同脅迫條件下的表達(dá)模式不同。

不同濃度NaCl脅迫下，HERC2的表達(dá)量隨脅迫濃度的增大而增高，120 mmol·L-1NaCl脅迫處理較對(duì)照增加幅度最小，當(dāng)濃度達(dá)到180 mmol·L-1時(shí)的表達(dá)量增高幅度最大。隨時(shí)間的延長(zhǎng)， 每種濃度處理HERC2的表達(dá)量均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)；其中NaCl脅迫24 h時(shí)基因的表達(dá)量最大，此時(shí)120、150和180 mmol·L-1處理分別為對(duì)照(0 h)的15.96、38.32和45.99倍(圖5，A)。

KT832066. 向日葵；XP_011081781.1. 芝麻；XP_012857820.1. 黃色猴臉花；XP_015573157.1. 蓖麻；KYP65138.1. 木豆；XP_015170023.1. 馬鈴薯；XP_008445010.1. 香瓜；XP_003545609.1. 大豆；XP_003603615.2. 蒺藜狀苜蓿；KHN12959.1. 野生大豆；XP_014504264.1. 綠豆(原變種)；XP_010541254.1. 醉蝶花圖3 HERC2與其他物種E3泛素連接酶基因的氨基酸序列比對(duì)KT832066. Helianthus annuus; XP_011081781.1. Sesamum indicum; XP_012857820.1. Erythranthe guttata; XP_015573157.1. Ricinus communis; KYP65138.1. Cajanus cajan; XP_015170023.1. Solanum tuberosum; XP_008445010.1. Cucumis melo; XP_003545609.1. Glycine max; XP_003603615.2. Medicago truncatula; KHN12959.1. Glycine soja; XP_014504264.1. Vigna radiata var. radiata; XP_010541254.1. Tarenaya hasslerianaFig.3 Comparison of the amino acid sequences of HERC2 and other E3 ubiquitin ligase genes

分支上的數(shù)值表示Bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)節(jié)點(diǎn)的可信度；標(biāo)尺表示遺傳距離圖4 HERC2的氨基酸序列與其他物種同源序列的進(jìn)化分析The numbers on the branches represent the reliability percent of Bootstrap values based on 1 000 replication; The scale bar represents genetic distanceFig.4 Phylogenetic analysis of amino acid sequences compare with other species of HERC2

*和**分別表示各濃度脅迫處理與對(duì)照之間在0.05和0.01水平存在顯著性差異圖5 不同濃度NaCl、ABA和PEG脅迫下HERC2在向日葵葉中的表達(dá)* and ** represent significant difference between every concentration stress and control at 0.05 and 0.01 levels, respectivelyFig.5 Expression analysis of HERC2 gene in sunflower leaf under different NaCl, ABA and PEG concentration stress

不同濃度ABA脅迫下，HERC2的表達(dá)量在50 μmol·L-1時(shí)增高幅度最小，在10 μmol·L-1時(shí)增高幅度最大。每種處理濃度HERC2的表達(dá)量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)；其中ABA脅迫處理48 h時(shí)基因的表達(dá)量最大，此時(shí)50、5和10 μmol·L-1處理分別為對(duì)照(0 h)的5.98、14.29和和45.25倍(圖5，B)。

不同濃度PEG脅迫下，HERC2表達(dá)量隨脅迫濃度的增大而增高，5%時(shí)增高幅度最小，20%時(shí)的增高幅度最大。每種處理濃度HERC2的表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)。其中PEG脅迫處理48 h時(shí)基因的表達(dá)量最大，5%、1%和2%處理HERC2表達(dá)量分別為對(duì)照(0 h)的36.09、108.63和118.06倍(圖5，C)。

**表示根與下胚軸、葉之間在0.01水平存在顯著性差異圖6 HERC2在不同脅迫處理下的器官特異性表達(dá)** represent significant difference between root and hypocotyl, leaf at 0.01 levelFig.6 Expression of HERC2 gene in various organs of sunflower under different kinds of stress

向日葵幼苗受到NaCl、ABA和PEG的脅迫后，HERC2在根、下胚軸、葉中的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)極顯著性差異。其中，180 mmol·L-1NaCl脅迫處理24 h，HERC2在葉片中的表達(dá)量最高，是根中表達(dá)量的1.18倍；其次為根；在下胚軸中的表達(dá)量最低，是根的0.87倍。10 μmol·L-1ABA脅迫處理48 h，HERC2在根中的表達(dá)量最高；其次是葉，是根的0.53倍；在下胚軸中的最少，是根的0.36倍。20%PEG脅迫處理48 h，HERC2在根中的表達(dá)量最高；其次是下胚軸，是根的0.66倍；在葉中的最少，是根的0.64倍(圖6)。說明HERC2在向日葵中存在器官特異性表達(dá)差異。

3 討 論

在植物的發(fā)育過程中，E3泛素連接酶參與從胚胎發(fā)育到花器官產(chǎn)生幾乎所有的發(fā)育過程，控制植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等過程中的關(guān)鍵步驟。E3泛素連接酶在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中參與自交不親和[18]、花發(fā)育[19-20]和植物衰老等反應(yīng)[21-22]。E3泛素連接酶積極參與激素反應(yīng)，有針對(duì)性地降解激素應(yīng)答基因下游的特異性轉(zhuǎn)錄因子抑制生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸、乙烯和茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，限制激素生物合成[23-24]。Dong等[25]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥通過泛素/蛋白酶體途徑中的E3泛素連接酶HOS1降解ICE1蛋白減弱冷脅迫的傷害。對(duì)U-box蛋白CaPUB1、PUB22/23以及RING-finger蛋白DRIP1/DRIP2、Rma1H1的研究均表明，E3泛素連接酶可以通過泛素化修飾靶蛋白調(diào)控植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)過程[26-28]。

在許多E3泛素蛋白連接酶中發(fā)現(xiàn)，都有至少一個(gè)拷貝的與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)RCC1同源的N末端。RCC1是目前唯一已知的Ran鳥嘌呤核苷酸交換因子，是位于間期細(xì)胞核內(nèi)與染色質(zhì)相結(jié)合與Ran相互作用的一種真核蛋白，它作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在許多有機(jī)體的細(xì)胞中發(fā)揮作用[29]。RCC1和Ran的相互作用可能在基因表達(dá)調(diào)控中起主要作用。RCC1與Ran蛋白結(jié)合，促進(jìn)Ran-GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镽anGTP結(jié)合態(tài)，從而促進(jìn)核質(zhì)運(yùn)輸，在核內(nèi)輸、外運(yùn)，有絲分裂期紡錘體的形成及核膜的重塑，防止S期DNA多重復(fù)制等過程中發(fā)揮作用，同時(shí)在染色體端粒沉默、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、微管的組裝和DNA復(fù)制等過程中發(fā)揮重要功能[30]。向日葵HERC2基因含有5個(gè)RCC1保守結(jié)構(gòu)域，向日葵HERC2基因多重復(fù)RCC1保守結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)可能使該基因在抵御鹽脅迫的傷害上發(fā)揮作用。

通過對(duì)高通量測(cè)序獲得的向日葵E3泛素連接酶基因序列的分析，得到該基因具有完整的CDS。因此，本研究以該序列為基礎(chǔ)，克隆了cDNA和gDNA的ORF。又進(jìn)一步對(duì)HERC2進(jìn)行了鹽脅迫、ABA激素脅迫和PEG模擬干旱脅迫3種非生物脅迫的表達(dá)分析，結(jié)果表明該基因可以被鹽脅迫、激素脅迫、干旱等非生物脅迫誘導(dǎo)，來抵抗或削弱逆境對(duì)植物的傷害。對(duì)HERC2基因在向日葵受到脅迫后不同器官的表達(dá)特征進(jìn)行研究，表明HERC2基因在向日葵中存在器官特異性表達(dá)差異。本研究認(rèn)為HERC2基因參與了非生物脅迫響應(yīng)的信號(hào)應(yīng)答，是一個(gè)正調(diào)節(jié)因子，可以作為通過抗逆基因工程提高農(nóng)作物抗逆性的候選基因，本研究為HERC2基因的功能和作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Gene HERC2 of Sunflower (Helianthus annuus L.)

ZHANG Yanfang1, SUN Ruifen1*, GUO Shuchun1, YU Haifeng1, SHI Huiqin2

(1 Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences, Huhhot 010031, China; 2 Inner Mongolia Horticulture Research Institute, Huhhot 010010, China)

In order to understand the functions ofHERC2 and effectively make use it, we cloned theHERC2 cDNA and gDNA sequence from sunflower and analyzed it by bioinformatics method. Expression pattern ofHERC2 of sunflower was revealed under abiotic stresses. The CDS ofHERC2 is 1 608 bp, encoding 535 amino acids. The predicted molecular weight is 131 kD, isoelectric point is 5.03. TheHERC2 encoded protein is hydrophobic proteins, and it is cytoplasmic protein. The protein was localized in the Golgi apparatus. The protein has 5 RCC1 conserved domains. Phylogenetic analysis of amino acid sequence of E3 ubiquitin ligase was close toTarenayahassleriana, was far withGlycinemaxandGlycinesoja. Gene accession number is KT832066. The ORF of gDNA ofHERC2 is 3 409 bp, which have 5 exons and 4 introns. Gene accession number is KT832067. RT-qPCR showed thatHERC2 has different expression characteristics under different abiotic stresses. The expression characteristics also exist in different organs.

sunflower; E3 ubiquitin ligase; gene cloning; sequence analysis; gene expression

1000-4025(2016)10-1933-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1933

2016-07-04;修改稿收到日期:2016-10-17

內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)創(chuàng)新基金(2013CXJJN14)

張艷芳(1982-)，女，在讀博士研究生，助理研究員，主要從事向日葵生物技術(shù)研究。E-mail：35812653@qq.com

*通信作者:孫瑞芬，研究員，主要從事向日葵生物技術(shù)研究。E-mail：sunruifen3231@sina.com

Q785；Q786

A