鄭 凱，倪志勇，曲延英，王 怡，蔡永生，陳全家

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

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海島棉GbTCP15基因的克隆與表達(dá)分析

鄭 凱，倪志勇，曲延英，王 怡，蔡永生，陳全家*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

根據(jù)陸地棉GhTCP15基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，通過(guò)PCR技術(shù)從海島棉品種‘新海21號(hào)’中克隆一個(gè)同源基因，命名為GbTCP15。海島棉GbTCP15基因具有一個(gè)1 056 bp開(kāi)放閱讀框，編碼351個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為38 057.4 kD，等電點(diǎn)為9.01，序列中含有一個(gè)高度保守的TCP結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列對(duì)比表明，海島棉GbTCP15蛋白與其他植物中的TCP蛋白有較高的一致性，說(shuō)明該基因在進(jìn)化過(guò)程中是相當(dāng)保守的。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，GbTCP15主要分布在細(xì)胞核上，推測(cè)GbTCP15在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中發(fā)揮著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等作用。進(jìn)化樹(shù)分析表明，海島棉GbTCP15基因與雷蒙德氏棉GrTCP15基因分布在同一分支上。實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，海島棉GbTCP15基因在莖部和15 d纖維中表達(dá)量較高。研究表明，GbTCP15轉(zhuǎn)錄因子可能參與棉花纖維以及表皮毛的發(fā)育。

海島棉；TCP；克??；序列分析；表達(dá)分析

TCP家族是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在植物中廣泛存在，同時(shí)也在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用，目前已知在擬南芥中有24個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子[1]，在水稻中有20個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子[2]。早期發(fā)現(xiàn)的4個(gè)TCP基因分別為玉米(Zeamays)的TB1(teosintebranched1)、金魚(yú)草(Antirrrhinummajus)的CYC(cycloidea)，以及水稻(Oryzasativa)的PCF1和PCF2(proliferatingcellfactors1，proliferatingcellfactors2)，TCP則分別來(lái)自這幾個(gè)基因名稱(chēng)的首字母[3]。通過(guò)對(duì)這4個(gè)基因序列比較發(fā)現(xiàn)，序列中均含有一個(gè)由60個(gè)氨基酸組成的高度保守的區(qū)域，也叫TCP結(jié)構(gòu)域(TCP domain)，能夠形成一個(gè)堿性-螺旋-環(huán)-螺旋的結(jié)構(gòu)又稱(chēng)(bHLH結(jié)構(gòu)域)[4]。推測(cè)TCP結(jié)構(gòu)域的功能可能作用于蛋白二聚化以及與DNA結(jié)合這些方面。除了bHLH結(jié)構(gòu)外，CYC和TB1還有一個(gè)保守的富含極性氨基酸的區(qū)域[3]，大約有18個(gè)氨基酸組成，可以形成一個(gè)親水α螺旋的R結(jié)構(gòu)區(qū)。

根據(jù)TCP基因家族與DNA結(jié)合的位點(diǎn)序列不同，TCP家族又被分為2個(gè)亞族(ClassⅠ和ClassⅡ)。由于TCP結(jié)構(gòu)的差異，ClassⅡ類(lèi)又被分成兩類(lèi)進(jìn)化分支。一類(lèi)是含有金魚(yú)草生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子cincinnata，稱(chēng)為CIN支；另一類(lèi)在bHLH區(qū)之間有一個(gè)富含谷氨酸和半胱氨酸的保守區(qū)域ECE區(qū)(也稱(chēng)ECE支)，包括CYC、TB1以及擬南芥的TCP1、TCP12等[5-6]。在功能上大致也分兩類(lèi)，即ClassⅠ類(lèi)和ClassⅡ類(lèi),ClassⅠ類(lèi)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮正調(diào)控的功能，主要是促進(jìn)細(xì)胞分化，在植物分生組織中起作用[7]；ClassⅡ類(lèi)對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行負(fù)調(diào)控，主要是抑制細(xì)胞的增值[8]。目前，針對(duì)棉花纖維發(fā)育相關(guān)的TCP轉(zhuǎn)錄因子的研究還很少。夏桂先研究組從陸地棉中克隆了一個(gè)GhTCP14轉(zhuǎn)錄因子，研究表明GhTCP14可能是生長(zhǎng)素調(diào)控纖維起始和伸長(zhǎng)的一個(gè)上游調(diào)控子[9]。張獻(xiàn)龍研究組在海島棉中分離了一個(gè)TCP家族的轉(zhuǎn)錄因子GbTCP，在棉纖維伸長(zhǎng)期(5～15 d)高表達(dá)[10]。

TCP家族的轉(zhuǎn)錄因子在植物的整個(gè)生長(zhǎng)周期中參與多種途徑的調(diào)控。然而，有關(guān)TCP轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控棉花纖維發(fā)育的相關(guān)研究還不是很多，尤其是在海島棉纖維發(fā)育時(shí)期的功能還有待進(jìn)一步的探究。本研究從海島棉中克隆一個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子GbTCP15，分析該基因的蛋白結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征，為今后棉花TCP轉(zhuǎn)錄因子在纖維發(fā)育階段的功能及分子機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉花品種‘新海21號(hào)’由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，試驗(yàn)材料于2015年7月種植在阿克蘇16團(tuán)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地。按照正常田間管理，在花期掛牌標(biāo)記棉鈴，開(kāi)花當(dāng)天記為0 d以及開(kāi)花后的5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d(開(kāi)花天數(shù))的棉花纖維，以及開(kāi)花當(dāng)天的花瓣、花萼、子房以及柱頭，取樣后置于液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

室內(nèi)取‘新海21號(hào)’種子剝?nèi)シN皮，將種仁浸泡于70 %無(wú)水乙醇消毒3 min后，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3～5次，將種子平鋪在放有濾紙的發(fā)芽盒中，28 ℃暗培養(yǎng)4 d然后取下胚軸，剩余的移植到營(yíng)養(yǎng)液中繼續(xù)生長(zhǎng)，待第一片真葉展開(kāi)時(shí)，取根、莖、葉，將樣品置于液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于提取總RNA。

1.2 方 法

1.2.1 棉花總RNA提取及第一鏈cDNA合成 按Trizol試劑盒(Tiangen)使用說(shuō)明，分別提取0 d、5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d以及根、莖、葉、下胚軸和開(kāi)花當(dāng)天的花瓣、花萼、子房、柱頭的總RNA。使用DnaseⅠ(Tiangen)去除基因組DNA污染。按照First Strand cDNA Synthesis試劑盒(Thermo試劑公司)說(shuō)明書(shū)操作步驟，以獲得不同時(shí)期棉花纖維和其他組織的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2 海島棉GbTCP15基因的克隆及序列分析 以擬南芥AtTCP15基因(AT1G69690.1)序列作為BlaseP查詢(xún)序列，在全基因組信息庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov)和美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索棉花TCP家族基因與AtTCP15序列保守的序列，將其在已經(jīng)公布的棉花數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，獲得1個(gè)cDNA序列，然后根據(jù)該序列的ORF設(shè)計(jì)了引物。

表1 引物序列

根據(jù)海島棉GbTCP15 基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，用引物GbTCP15-F 和GbTCP15-R 擴(kuò)增GbTCP15 ORF(表1)，以棉花纖維0 d的cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增基因。擴(kuò)增體系為25 μL，其中含有cDNA 1 μL；10×緩沖液(含Mg2+)2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 2 μL；Taq酶0.5 μL；正反引物各1 μL，補(bǔ)充水到25 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；55 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物置1%瓊脂糖中電泳，經(jīng)紫外凝膠成像儀觀(guān)察結(jié)果。采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN )回收目的片段，回收產(chǎn)物與 載體pEASY-T1(全式金生物公司)連接后轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant 感受態(tài)細(xì)胞(全式金生物公司)，涂在含有卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基上，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后，將陽(yáng)性克隆送深圳華大基因公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將所得的GbTCP15基因的ORF用DNAMAN翻譯成蛋白序列，利用SMART軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守功能域(http://smart.embl-heidelberg.de/)。用EXPASy的Prot-Param tool 在線(xiàn)程序(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)預(yù)測(cè)蛋白的分子量和等電點(diǎn)。使用在線(xiàn)軟件InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/sequencesearch)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)分析。利用PSIRRED Server工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)。利用SWISS-MODEL工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)(http://swissmodel.expasy.org/)。利用DNAMAN軟件和Blast檢索GenBank進(jìn)行多重序列比對(duì)和同源性分析。用ClustalX比對(duì)蛋白氨基酸序列，用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用鄰位相連法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，BootStrap 參數(shù)設(shè)置為1000次重復(fù)，使分支結(jié)果更為可靠。用Post(http://www.psort.org/)在線(xiàn)工具預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)GbTCP15基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物GbTCP15-qF和GbTCP15-qR，以GbUBQ7基因?yàn)閮?nèi)參基因，擴(kuò)增引物為GbUBQ7-F和GbUBQ7-R(表1)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以棉花開(kāi)花當(dāng)天(0 d)的胚珠和開(kāi)花后5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d的纖維組織反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物以及根、莖、葉、下胚軸和開(kāi)花當(dāng)天的花瓣、花萼、子房、柱頭反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物為模板，檢測(cè)GbTCP15基因在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期棉纖維中的表達(dá)情況。20 μL PCR擴(kuò)增體系為：混合液2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL(全式金生物公司)；校正液Passive Reference Dye(50×)0.4 μL(全式金生物公司)；正反引物各0.4 μL；模板1 μL；ddH2O 7.8 μL。用實(shí)時(shí)熒光定量專(zhuān)用96孔板(applied biosystems，美國(guó))，ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀(ABI Prism，美國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用兩步法，PCR程序?yàn)?4 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；結(jié)果采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，并制作柱形圖顯示該基因在不同棉花組織和不同棉纖維時(shí)期的表達(dá)情況。試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海島棉GbTCP15基因的克隆與序列分析

以‘新海21號(hào)’5 d 棉花纖維cDNA為模板，根據(jù)引物GbTCP15-F和GbTCP15-R，用RT-PCR方法，獲得目的片段。GbTCP15編碼區(qū)長(zhǎng)1 056 bp(圖1)，運(yùn)用DNAMAN分析得出，該編碼區(qū)編碼351個(gè)氨基酸，其中絲氨酸占11.7%，蘇氨酸占8.5%，甘氨酸和脯氨酸各占8.3%，亮氨酸占7.4%，丙氨酸占6.8%；預(yù)測(cè)分子量為38 057.4 kD，等電點(diǎn)為9.01。通過(guò)NetPhos 2.0 Serve預(yù)測(cè)GbTCP15蛋白的磷酸化位點(diǎn)(圖2)，GbTCP15含有26個(gè)絲氨酸(Ser)、8個(gè)蘇氨酸(Thr)、1個(gè)絡(luò)氨酸(Tyr)位點(diǎn)。由此推測(cè)磷酸化作用可能主要與這2個(gè)蛋白的活性調(diào)控有關(guān)。

通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)(圖3)GbTCP15蛋白的N端具有一個(gè)TCP家族特有保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?yàn)镃lassⅠ型TCP家族基因所特有的，因此認(rèn)定該基因?qū)儆诿藁═CP轉(zhuǎn)錄因子家族。

M. Marker；1. GbTCP15圖1 棉花GbTCP15基因PCR產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR product of cotton GbTCP15 genes

圖2 GbTCP15蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 GbTCP15 protein phosphorylation sites prediction

Helix.α螺旋；Sheet.β折疊 圖4 GbTCP15蛋白的氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Helix. Alpha helix；Sheet. Beta foldingFig.4 GbTCP15 protein secondary structure prediction

A. GbTCP15蛋白的氨基酸序列；B. 蛋白結(jié)構(gòu)示意圖,方框部分代表TCP結(jié)構(gòu)域圖3 GbTCP15蛋白的氨基酸序列以及蛋白結(jié)構(gòu)示意圖A. Amino acid sequence of GbTCP15；B. Schematic diagram of GbTCP15，Box part represents TCP domain structureFig.3 GbTCP15 protein amino acid sequence and protein structure diagram

圖5 GbTCP15蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of GbTCP15

利用PSIRRED Server程序(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，GbTCP15蛋白由351個(gè)氨基酸組成，其中7個(gè)氨基酸形成α-螺旋，1個(gè)氨基酸可能形成β-折疊。組成α-螺旋氨基酸的比例占87%，β-折疊占13%。分布如圖4所示。

通過(guò)SWISS-MODEL工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，得到該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖(圖5)，與其他TCP蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，其三級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋—β-折疊—α-螺旋，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

GbTCP15.海島棉；GaTCP15.亞洲棉(Cotton_A_33342); GhTCP15.陸地棉(CotAD_65741); GrTCP15.雷蒙德氏棉(XP_012465080); AtTCP15.擬南芥(AT1G69690); BrachypodiumTCP15.二穗短柄草(XP_003570652); SorghumTCP 15.高粱(EES07255); PrunusTCP.果梅(XP_008221641); ArachisTCP15.花生(XP_016202735);CucumisTCP15.黃瓜(XP_011655678); CacaoTCP.可可(XP_007046143); ViniferaTCP15.葡萄(XP_002274048); OryzaTCP15.水稻(XP_015641757); ZeaTCP14.玉米(XP_0086462571)圖6 GbTCP15與其他TCP氨基酸序列對(duì)比分析GbTCP15. Gossypium barbadense; GaTCP15.Gossypium arboreum(Cotton_A_33342); GhTCP15.Gossypium hirsutum(CotAD_65741); GrTCP15.Gossypium raimondii(XP_012465080); AtTCP15.Arabidopsis thaliana(AT1G69690); BrachypodiumTCP15.Brachypodium distachyon(XP_003570652); SorghumTCP15.Sorghum bicolor(EES07255); PrunusTCP15.Prunus mume(XP_008221641); ArachisTCP15.Arachis ipaensis(XP_016202735); CucumisTCP15.Cucumis sativus(XP_011655678); CacaoTCP.Theobroma cacao(XP_007046143); ViniferaTCP15.Vitis vinifera(XP_002274048); OryzaTCP15.Oryza sativa(XP_015641757); ZeaTCP14.Zea mays(XP_0086462571)Fig.6 Amino acid sequence alignment of GbTCP15 with other related proteins

借助NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)將堿基序列翻譯成氨基酸序列，用DNAMAN對(duì)海島棉GbTCP15和雷蒙德氏棉GrTCP15(Gossypiumraimondii，XP_012465080)之間進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，其一致性為98.01%。海島棉GbTCP15與亞洲棉GaTCP15(Gossypiumarboreum，Cotton_A_33342)、陸地棉GhTCP15(Gossypiumhirsutum，CotAD_65741)、可可TCP(Theobromacacao，XP_007046143)、高粱TCP 15(Sorghumbicolor，EES07255)、水稻TCP15(Oryzasativa，XP_015641757)、玉米TCP(Zeamays,XP_0086462571)、花生TCP15(Arachisipaensis,XP_016202735)、黃瓜TCP15(Cucumissativus,XP_011655678)、葡萄TCP15(Vitisvinifera，XP_002274048)、擬南芥TCP15(Arabidopsisthaliana，AT1G69690)和二穗短柄草TCP15(Brachypodiumdistachyon，XP_003570652)氨基酸序列一致性分別為94.56%、96.25%、81.29%、50.66%、38.11%、44.73%、51.43%、54.97%、61.49%、51.70%、50.33%。這些TCP相關(guān)的蛋白都有一個(gè)高度保守的TCP domain，其他區(qū)域一致性較低(圖6)。

2.2 海島棉GbTCP15亞細(xì)胞定位及功能預(yù)測(cè)分析

利用POSRT 3.0軟件對(duì)GbTCP15的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，GbTCP15在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的分布比例分別為30%、10%，在細(xì)胞核中的分布最多，結(jié)果表明GbTCP15基因編碼的蛋白其作用發(fā)生在植物的細(xì)胞核內(nèi)。

運(yùn)用Protfun2.2軟件對(duì)GbTCP15的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分類(lèi)，結(jié)果顯示該蛋白在輔因子生物結(jié)合、運(yùn)輸和結(jié)合、監(jiān)管職能、嘌呤和嘧啶以及翻譯過(guò)程中發(fā)揮的可能性分別是0.210、0.773、0.034、0.331、0.071，而作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮功能的可能性分別是0.205、0.219、0.111(表2)，這些數(shù)據(jù)明顯高于其他功能。考慮該基因家族的特性，綜合判斷GbTCP15可能在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中發(fā)揮著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等作用。

2.3 海島棉GbTCP15系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA6軟件對(duì)上述物種的TCP氨基酸進(jìn)行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖7)表明，GaTCP15和GhTCP15聚集在同一分支，GbTCP15 和GrTCP15聚在同一分支，表明海島棉TCP15基因與雷蒙德氏棉的同類(lèi)基因的親緣關(guān)系較近。

2.4 GbTCP15表達(dá)模式分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析GbTCP15基因在棉花不同纖維時(shí)期的表達(dá)量以及在棉花的營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中的表達(dá)情況。由圖8可知，GbTCP15基因在纖維發(fā)育的第15天時(shí)表達(dá)量最高，明顯高于其他發(fā)育時(shí)期的棉纖維，并且該基因在纖維發(fā)育的后期，即次生壁增后期和脫水成熟期表達(dá)量非常低。據(jù)此推測(cè)GbTCP15基因可能在棉纖維起始階段和纖維伸長(zhǎng)期中發(fā)揮一定的功能。同時(shí)在根、莖、葉和下胚軸中也檢測(cè)到GbTCP15基因的表達(dá)(圖9)，而且在莖上的表達(dá)明顯高于根、葉和下胚軸，說(shuō)明GbTCP15基因可能在棉花莖稈表皮毛的發(fā)育中也發(fā)揮著一定的作用。

表2 GbTCP15功能分析結(jié)果

圖7 GbTCP15蛋白與其他植物相關(guān)蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic analysis of GbTCP15 with other related proteins in different plants

圖8 GbTCP15基因在不同纖維時(shí)期的表達(dá)情況Fig.8 GbTCP15 gene expression in different fiber periods

圖9 GbTCP15基因在棉花營(yíng)養(yǎng)器官中的表達(dá)情況Fig.9 GbTCP15 gene expression in the different tissues and organs of cotton

3 討 論

棉花纖維的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程決定了成熟纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)，近幾年，針對(duì)棉纖維發(fā)育的相關(guān)研究備受關(guān)注，但是到目前為止，控制纖維發(fā)育的關(guān)鍵基因和調(diào)控機(jī)理還不清楚，因此針對(duì)棉花纖維開(kāi)展分子機(jī)制的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

TCP轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類(lèi)基因家族，在植物發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用；棉花纖維細(xì)胞是棉花胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)分化突起和極性伸長(zhǎng)而形成的單細(xì)胞。現(xiàn)有的研究表明，TCP轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用大部分與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化有關(guān)，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂進(jìn)一步控制植物側(cè)枝、花等器官的生長(zhǎng)發(fā)育。如玉米的TB1基因作用在兩方面：一是抑制分生組織的生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)控頂端優(yōu)勢(shì),二是通過(guò)抑制雄花原基發(fā)育調(diào)控雄花的形成[11];金魚(yú)草的CYC基因則調(diào)控花的對(duì)稱(chēng)發(fā)育[12]；而水稻的PCF1和PCF2基因則是調(diào)控分生組織中的Pcan基因的轉(zhuǎn)錄[13]。

本研究從海島棉‘新海21號(hào)’材料的棉纖維中成功克隆1個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子基因，將其命名為GbTCP15；該基因編碼的氨基酸序列含有一個(gè)保守的TCP結(jié)構(gòu)域，通過(guò)聚類(lèi)分析顯示，該基因?qū)儆赥CP轉(zhuǎn)錄家族的ClassⅠ類(lèi)。現(xiàn)有的研究表明，擬南芥TCP家族中ClassⅠ類(lèi)分支上的TCP蛋白在植物的分生組織上發(fā)揮著作用，同時(shí)也參與細(xì)胞的形成和發(fā)育。例如：擬南芥AtTCP14在種子萌發(fā)過(guò)程中起調(diào)控作用[14]；AtTCP16在花粉發(fā)育中起調(diào)控作用[15]；AtTCP15控制葉片的形狀[16]；AtTCP20參與調(diào)控細(xì)胞的分裂、伸長(zhǎng)和分化[17]。Wang等[9]克隆了1個(gè)陸地棉的TCP轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示該轉(zhuǎn)錄因子隸屬于Class Ⅰ 類(lèi)分支，并且該轉(zhuǎn)錄因子在棉花起始和伸長(zhǎng)階段特異性表達(dá)。

通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)克隆的GbTCP15基因在棉花15 d的纖維中和植株的莖部?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)，說(shuō)明GbTCP15基因可能在棉花的表皮細(xì)胞中表達(dá)量較高，進(jìn)一步暗示該轉(zhuǎn)錄因子可能在棉花纖維發(fā)育伸長(zhǎng)期中起一定作用。關(guān)于GbTCP15基因的功能，以及該基因在纖維伸長(zhǎng)期的調(diào)控機(jī)理之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步的研究。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of GbTCP15 in Gossypium barbadense

ZHENG Kai, NI Zhiyong, QU Yanying, WANG Yi, CAI Yongsheng, CHEN Quanjia*

(Agronomy Courtyard/ Key Laboratory of Agricultural Biological Technology, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052,China)

According to the coding sequence ofGhTCP15 gene,a pair of primers were designed. The homologous sequence ofGbTCP15 gene,was cloned from cotton(GossypiumbarbadenseL.)cultivar Xinhai 21 using reverse transcription PCR methods in this study.GbTCP15 gene contained open reading frame(ORF) of 1 056 bp in length, 351 amino acids residues with a predicted molecular mass of about 38 057.4 kD and a basic isoelectric point of 9.01,with a highly conservative TCP domain in the encoded putative protein. Amino acid sequence alignment revealed of GbTCP15 protein shared high degree of identity with other higher plant TCP proteins and the gene in evolution has proved to be conservative. Subcellular localization showed thatGbTCP15 expressed possibly in cell nucleus. Thus, we speculated thatGbTCP15 play a role on signal transduction and transcriptional regulatory during replication and transcription. The phylogenetic tree showed thatGbTCP15 was located at the same distribute withGossypiumraimondiiGrTCP15. The experment results of real time PCR exhibited thatGbTCP15 had a higher expression level in stems and fibers (15 d). Above results suggested thatGbTCP15 transcription factor may be involved in the cotton fiber and table fur development.

GossypiumbarbadenseL.;TCP;cloning;sequence analysis;expression analysis

1000-4025(2016)10-1925-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1925

2016-06-22;修改稿收到日期:2016-09-12

國(guó)家自然科學(xué)基金(31560405)；新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(201411103)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2015M582741)

鄭 凱(1988-)，男，在讀碩士研究生，主要從事棉花分子育種研究。E-mail：zhengkai555@126.com

*通信作者:陳全家，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事棉花遺傳育種研究。E-mail：chenqjia@126.com

Q785;Q786

A