王玉祥 楊 潔 楊 超 王少青 張 辛 宋玉芝

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

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疏肝化痰祛瘀方聯(lián)用紫杉醇對(duì)乳腺癌大鼠乳房微循環(huán)的影響

王玉祥 楊 潔 楊 超 王少青1張 辛 宋玉芝

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

目的 觀察疏肝化痰祛瘀方聯(lián)用紫杉醇對(duì)乳腺癌大鼠乳房微循環(huán)的影響。方法 將形成滿意腫瘤結(jié)節(jié)的乳腺癌大鼠隨機(jī)分為乳腺癌組、紫杉醇組、小劑量疏肝化痰祛瘀方聯(lián)用紫杉醇組(小劑量聯(lián)合組)和大劑量疏肝化痰祛瘀方聯(lián)用紫杉醇組(大劑量聯(lián)合組)，將同期健康大鼠作為對(duì)照組。給予紫杉醇組尾靜脈注射紫杉醇(劑量25 μg/g)，小劑量聯(lián)合組在紫杉醇組基礎(chǔ)上給予10 ml/kg疏肝化痰祛瘀方湯劑灌胃，大劑量聯(lián)合組在紫杉醇組基礎(chǔ)上給予(20 ml/kg)疏肝化痰祛瘀方湯劑灌胃，對(duì)照組尾靜脈及灌胃給予0.9%氯化鈉溶液，所有組別連續(xù)給藥4 w。檢測(cè)體重、微循環(huán)灌注量、血液黏稠度和乳房組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，乳腺癌組的體重與微循環(huán)灌注量明顯降低(P<0.05)，血液黏稠度、VEGF和bFGF水平明顯增加(P<0.05)，與乳腺癌組比較，紫杉醇組、小劑量和大劑量聯(lián)合組的體重與微循環(huán)灌注量顯著增高(P<0.05)，血液黏稠度、VEGF和bFGF水平明顯降低(P<0.05)，與紫杉醇組比較，大劑量聯(lián)合組的體重與微循環(huán)灌注量顯著增高(P<0.05)，血液黏稠度、VEGF和bFGF水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 疏肝化痰祛瘀方聯(lián)用紫杉醇對(duì)乳腺癌大鼠具有一定的治療效果，與改善乳房微循環(huán)、血流黏稠度和乳腺組織的VEGF和bFGF表達(dá)有關(guān)。

疏肝化痰祛瘀方；紫杉醇；乳腺癌；乳房微循環(huán)

乳腺癌在中醫(yī)領(lǐng)域?qū)儆凇叭閹r”的范疇，其病機(jī)在“瘀”和“痰”兩方面〔1，2〕，其一：肝郁致使氣機(jī)運(yùn)行不暢，氣機(jī)郁滯，氣滯血瘀，其二，肝郁克脾，脾不健運(yùn)，水濕聚而為痰?？梢姟梆觥焙汀疤怠笔侨橄侔┑牟±懋a(chǎn)物，可見消除病理產(chǎn)物可能是乳腺癌的治療途徑之一。疏肝化痰祛瘀方是臨床治療乳腺癌的常用方劑，也獲得了較好的效果，但其治療機(jī)制至今仍未有研究。本研究觀察疏肝化痰祛瘀方聯(lián)用紫杉醇對(duì)乳腺癌大鼠乳房微循環(huán)的影響。

1 資料與方法

1.1 受試動(dòng)物 選擇健康沒有生育史的雌性SD大鼠，體重180～220 g，購(gòu)于浙江省試驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2003-0001。12 h日光燈照明，自由飲水?dāng)z食，常規(guī)飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 Walker-256腫瘤細(xì)胞 Walker-256腫瘤細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)用常規(guī)1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃中培養(yǎng)。在指數(shù)增長(zhǎng)期消化收集待用。

1.3 受試藥品 紫杉醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，二甲基苯蒽(DMBA，Sigma公司，批號(hào)：087K1196，規(guī)格：5 g/瓶)；疏肝化痰祛瘀方：當(dāng)歸、川芎、青皮、醋制香附、桃仁、紅花、浙貝母和白芥子各12 g、半夏和蒼術(shù)各10 g，皂角刺20 g、陳皮6 g，加水1 L，煎至100 ml。疏肝化痰祛瘀方各味藥均購(gòu)自市中藥材批發(fā)市場(chǎng)，由齊惠珍教授鑒別為真品。兔抗鼠VEGF抗體和和兔抗鼠bFGF抗體均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.4 試驗(yàn)儀器 IEC601-1型激光多普勒微循環(huán)分析儀及配套LAB Measurement Statistics軟件系統(tǒng)(英國(guó)Moor公司)；FASCO型全自動(dòng)血液流變快測(cè)儀(重慶大學(xué)維多研究所)；BX50-3E01型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；RM-2235型石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 乳腺癌大鼠的制備 參照相關(guān)文獻(xiàn)〔3〕，構(gòu)建乳腺癌大鼠模型。Walker-256腫瘤細(xì)胞單次接種在大鼠左側(cè)腋下，將死亡或未形成滿意腫瘤結(jié)節(jié)淘汰，成功率約60%。

1.5.2 分組和給藥 將形成滿意腫瘤結(jié)節(jié)的乳腺癌大鼠隨機(jī)分為乳腺癌組，紫杉醇組，小劑量疏肝化痰祛瘀方聯(lián)用紫杉醇組(小劑量聯(lián)合組)和大劑量疏肝化痰祛瘀方聯(lián)用紫杉醇組(大劑量聯(lián)合組)，每組12只，將同期健康大鼠作為對(duì)照組。給予紫杉醇組尾靜脈注射紫杉醇(劑量25 μg/g)，小劑量聯(lián)合組在紫杉醇組基礎(chǔ)上每日給予疏肝化痰祛瘀方湯劑按鼠體重10 ml/kg灌胃2次，每12 h灌胃1次；大劑量聯(lián)合組每日給予疏肝化痰祛瘀方湯劑按鼠體重20 ml/kg灌胃2次，每12 h灌胃1次。對(duì)照組給予尾靜脈及灌胃注射0.9%氯化鈉溶液，所有組別連續(xù)給藥4 w。

1.5.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.3.1 乳房微循環(huán)灌注量 給藥結(jié)束前1 d，除去大鼠胸部鼠毛，第二天，麻醉大鼠，激光探頭置于大鼠腋前第5對(duì)乳房，測(cè)試大鼠乳腺微循環(huán)的灌注量。

1.5.3.2 血液流變學(xué) 取大鼠下腔靜脈血5 ml靜脈血，注入肝素抗凝，檢測(cè)血液流變學(xué)參數(shù)。

1.5.3.3 乳房組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)水平 給藥結(jié)束后，處死大鼠，在無(wú)菌條件下，取大鼠胸部左側(cè)第2只乳腺和周圍皮膚約1.5 cm×1.5 cm，用甲醛固定，石蠟包埋，切片。石蠟切片水化，用PBS液沖洗，切片加過氧化氫溶液孵育10 min，PBS沖，加EDTA高壓熱修復(fù)2 min，切片再加—抗，室溫孵育60 min，PBS 沖洗，切片再加聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育，PBS 沖洗，加50酶標(biāo)鼠/兔聚合物，室溫孵育，PBS 沖洗，再加DAB顯色液，陰性對(duì)照采用PBS液代替一抗，鏡下觀察，陽(yáng)性顯色為棕色。用尼康NIS-Element BR3.1圖像分析系統(tǒng)，每份樣本隨機(jī)選5個(gè)視野，將視野中的陽(yáng)性細(xì)胞面積與總面積的比值作為VEGF和bFGF的表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的一般情況比較 乳腺癌組大鼠反應(yīng)遲緩、皮毛松弛，暗淡無(wú)光、蜷縮少動(dòng)、對(duì)刺激敏感度降低和飲食水量減少。紫杉醇組皮毛松弛，毛發(fā)暗淡、倦怠淡漠、對(duì)刺激敏感度降低。小劑量和大劑量聯(lián)合組趨向正常。實(shí)驗(yàn)中乳腺癌組大鼠死亡3只，紫杉醇組死亡2只，大劑量聯(lián)合組死亡1只，小劑量聯(lián)合組死亡2只。

2.2 各組大鼠的腫瘤發(fā)生比較 與對(duì)照組比較，乳腺癌組的腫瘤個(gè)數(shù)明顯增高(P<0.05)，與乳腺癌組比較，紫杉醇組、小劑量和大劑量聯(lián)合組的腫瘤個(gè)數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠的體重和乳房微循環(huán)灌注量的比較 與對(duì)照組比較，乳腺癌組的體重與微循環(huán)灌注量明顯降低(P<0.05)，與乳腺癌組比較，紫杉醇組、小劑量和大劑量聯(lián)合組的體重與微循環(huán)灌注量顯著增高(P<0.05)，與紫杉醇組比較，大劑量聯(lián)合組的體重與微循環(huán)灌注量顯著增高(P<0.05)，見表2。

2.4 各組大鼠的血液流變學(xué)參數(shù)的比較 與對(duì)照組比較，乳腺癌組的血液黏稠度明顯增加(P<0.05)，與乳腺癌組比較，紫杉醇組、小劑量聯(lián)合組和大劑量聯(lián)合組的血液黏稠度明顯降低(P<0.05)，與紫杉醇組比較，大劑量聯(lián)合組的血液黏稠度顯著降低(P<0.05)，見表3。

表1 各組大鼠的腫瘤發(fā)生比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與乳腺癌組比較：2)P<0.05

表2 各組大鼠的體重乳房微循環(huán)灌注量的比較±s)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05;與乳腺癌組比較：2)P<0.05;與紫杉醇組比較：3)P<0.05，下表同

表3 各組大鼠血液流變學(xué)參數(shù)的對(duì)比±s,mPa·s)

2.5 各組大鼠乳腺組織VEGF和bFGF水平的比較 與對(duì)照組比較，乳腺癌組的VEGF和bFGF水平顯著增高(P<0.05)，與乳腺癌組比較，紫杉醇組、小劑量聯(lián)合組和大劑量聯(lián)合組的VEGF和bFGF顯著降低(P<0.05)，與紫杉醇組比較，大劑量聯(lián)合組的VEGF和bFGF顯著降低(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠乳腺組織VEGF和bFGF水平的比較±s，陽(yáng)性細(xì)胞面積/總面積)

3 討 論

乳腺癌發(fā)病因素復(fù)雜，確切病因未知，但目前多認(rèn)為其是環(huán)境和遺傳因素等多種因素，如遺傳，絕經(jīng)年齡，內(nèi)分泌，月經(jīng)情況，生育情況，性生活，吸煙飲食等多種因素共同作用導(dǎo)致。在乳腺癌的治療中，手術(shù)治療仍是最主要的手段，臨床中多采用手術(shù)為主輔助放化療及其他內(nèi)分泌治療的模式。然后多種治療方法均存在弊端及多種并發(fā)癥及毒副作用，在這種情況下，中醫(yī)治療以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)得以體現(xiàn)。

從中醫(yī)學(xué)理論看，肝主疏泄、主藏血，可調(diào)暢氣機(jī)，促進(jìn)氣血運(yùn)行，脾主運(yùn)化水濕，水為生痰之源。乳腺癌的病機(jī)在于肝疏泄功能失調(diào)，氣機(jī)郁滯，影響氣血運(yùn)行，氣行則血行，氣滯則血瘀，形成瘀血證；肝木乘脾，水濕不運(yùn)，積而成痰；肝失疏泄，氣機(jī)阻滯，水濕氣化蒸騰障礙，津液輸布受阻成痰成飲，肝氣郁滯，痰瘀乃成。痰瘀既成又互相轉(zhuǎn)化，互為因果，痰積日久，阻遏氣機(jī)運(yùn)行，可加重瘀血，二者交錯(cuò)互阻致瘀滯，痰和瘀需聯(lián)合治之，治痰則瘀不去，逐瘀則痰不消。疏肝化痰祛瘀方中的青皮和香附具有疏肝行氣之效，當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花和穿山甲皆有活血化瘀功效，三棱、莪術(shù)、皂角刺與路路通行氣活血，備穿透之力，輔以半夏、浙貝母、白芥子和海藻輔助化痰軟堅(jiān)散結(jié)，諸藥合用，可達(dá)治痰去瘀和氣暢痰消之功〔4～6〕。本研究結(jié)果顯示，疏肝化痰祛瘀方可明顯改善乳腺癌大鼠的反應(yīng)，皮毛的光澤度和飲食飲水量，提示疏肝化痰祛瘀方可調(diào)節(jié)乳腺癌所致的肝血不暢，水濕停滯和痰瘀阻滯，在改善乳腺癌的臨床癥狀具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

乳腺組織微循環(huán)障礙是乳腺癌病變的集中體現(xiàn)，多種因素均可以導(dǎo)致乳腺組織微循環(huán)障礙，研究表明〔7〕與以下因素有關(guān)：①?gòu)难鲃?dòng)力學(xué)范疇看，血液黏稠度的增加可導(dǎo)致循環(huán)阻力的增高。本文結(jié)果證明乳腺癌大鼠乳腺的血液黏稠度均明顯增高，而給予干預(yù)后大鼠乳腺的血液黏稠度指標(biāo)均明顯降低。②從分子生物學(xué)角度看，乳腺組織VEGF和bFGF表達(dá)增加可加重乳腺組織微循環(huán)障礙。病理?xiàng)l件下，VEGF常呈現(xiàn)異常表達(dá)，腫瘤細(xì)胞可刺激 VEGF 表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的VEGF可與其受體作用使腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖、遷移，促進(jìn)新生血管形成，同時(shí)血管通透性的增加，為腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)提供營(yíng)養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生 bFGF 作為血管誘生劑，bFGF 在乳腺組織中陽(yáng)性表達(dá)率超過68%。VEGF 與bFGF兩者在血管生成中呈協(xié)同作用：VEGF及VEGF受體表達(dá)受到 bFGF 調(diào)控，bFGF可誘導(dǎo) VEGF 的合成，還可上調(diào)VEGF 受體 FLK-1表達(dá)。腫瘤必須構(gòu)建自己的血管系統(tǒng)，通過新生血管提供氧氣、養(yǎng)料并及時(shí)清除代謝產(chǎn)物才能夠持續(xù)性生長(zhǎng)和發(fā)展。如果沒有血管系統(tǒng)提供氧氣和養(yǎng)料，實(shí)體瘤的體積增長(zhǎng)難以超過1 mm3〔8〕。可見VEGF 與bFGF的表達(dá)水平與腫瘤惡性程度及預(yù)后緊密相關(guān)。本文結(jié)果顯示，給予乳腺癌大鼠以疏肝化痰祛瘀方可明顯改善乳腺組織的微循環(huán)，可能與降低血液高黏狀態(tài)和降低乳腺組織VEGF和bFGF表達(dá)相關(guān)，這兩種作用應(yīng)與疏肝化痰祛瘀方的組成密切相關(guān)：①疏肝化痰祛瘀方具有化痰祛瘀和通竅止痛的功效，可明顯改善偏頭痛患者的血液流變學(xué)指標(biāo)〔9〕；②祛瘀化痰法具有抗肺癌轉(zhuǎn)移的作用，其機(jī)制在于影響肺癌細(xì)胞的VEGF和CD44等蛋白合成和基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，影響腫瘤血管的生成，達(dá)到影響腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、遷移和侵襲的目的〔10〕。桃仁和紅花作為破血藥，體外試驗(yàn)顯示破血藥可降低VEGF和bFGF蛋白表達(dá)〔11〕，川芎中的川芎嗪可通過降低VEGF和bFGF表達(dá)抑制胃癌新生血管生成〔12〕。目前對(duì)桃仁調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)的趨向仍存在爭(zhēng)議，如以敏〔13〕研究認(rèn)為桃仁可以降低VEGF表達(dá)，但只能降低熱證的VEGF，不能降低寒證的VEGF，原因不明，而乳腺癌患者以寒證明顯〔14〕，如果該研究結(jié)果確鑿，那么桃仁升高乳腺癌組織VEGF作用可能被紅花和川芎的作用所掩蓋了。

本文的不足處：①疏肝化痰祛瘀方的有效成分比較復(fù)雜，包含了當(dāng)歸、川芎和青皮等12味藥，藥物來(lái)源不同，煎煮時(shí)間，煎煮溫度和器皿等不同均可不同程度影響療效，因此難以進(jìn)行質(zhì)量控制和商品化，一定程度地抑制了該方的標(biāo)準(zhǔn)化開發(fā)；②疏肝化痰祛瘀方中的當(dāng)歸和川芎不僅是活血的主要成分，而且具有補(bǔ)血的效果，疏肝化痰祛瘀方兩者比例為1∶1，有研究〔15〕認(rèn)為兩者比例1∶1.5在補(bǔ)血方面具有明顯的效果，疏肝化痰祛瘀方的活血藥物較多，因此活血功效明顯，補(bǔ)血相對(duì)不足，是否有必要調(diào)整當(dāng)歸和川芎比例，還有待于進(jìn)一步的考察；③疏肝化痰祛瘀方含有桃仁和紅花等破血藥，因?yàn)樘胰屎图t花的安全性不足，但乳腺癌是一種特殊的疾病，長(zhǎng)期服用利大于弊還是弊大于利，還需要再納入長(zhǎng)期毒性研究驗(yàn)證和觀察。

綜上所述，疏肝化痰祛瘀方聯(lián)用紫杉醇對(duì)大鼠乳腺癌具有一定的治療效果，可顯著改善乳腺癌的乳腺組織微循環(huán)，與降低血流黏稠度和降低乳腺組織的VEGF和bFGF表達(dá)有關(guān)。

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〔2015-06-17修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢(mèng)園)

楊 潔(1982-)，女，在讀博士，副主任醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤的放射治療研究。

王玉祥(1969-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤的放射治療研究。

R737.9

A

1005-9202(2016)22-5539-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.020

1 河北省隆堯縣醫(yī)院