諶苗苗　鐘　亮　趙春山　王鳳成　冀萬杰　張　博　李喜升

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所,遼寧鳳城 118100)

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RNAi技術(shù)研究現(xiàn)狀及其在柞蠶基礎(chǔ)應(yīng)用研究的前景

諶苗苗鐘亮趙春山王鳳成冀萬杰張博李喜升*

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所,遼寧鳳城 118100)

RNAi 技術(shù)目前已在昆蟲基因研究中得到廣泛應(yīng)用，它是由雙鏈 RNA誘發(fā)并最終導(dǎo)致同源 mRNA特異性沉默的過程。本文對國內(nèi)外dsRNA 的設(shè)計(jì)、導(dǎo)入方法及 RNAi 技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，對 RNAi技術(shù)在柞蠶基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用作一展望。

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RNAi (RNA interference) 主要指的是由dsRNA(或siRNA)誘導(dǎo)的對靶標(biāo)基因mRNA降解，從而導(dǎo)致相應(yīng)蛋白表達(dá)量減少甚至停止的基因沉默現(xiàn)象。它廣泛存在于真菌、植物和動物等真核生物中，即參與細(xì)胞防御與分化調(diào)控，還可以抵御病毒和其他外來核酸的入侵，使生物體自身處于遺傳穩(wěn)定的狀態(tài)。

RNAi除了具有高特異性及抑制基因表達(dá)的高效性，還具有操作簡便、實(shí)驗(yàn)成本相對較低的特點(diǎn)。此外，Bellés發(fā)現(xiàn)在昆蟲中，特別是遺傳操作較難的非模式昆蟲的功能基因研究中可以采用這一技術(shù)輔助研究[1]。 近年來諸多科學(xué)研究人員采用 RNAi 技術(shù)在昆蟲的基因功能研究、RNAi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物以及益蟲疾病控制等方面取得了較顯著的成果[2-5]。

2001年《Science》雜志將RNAi技術(shù)列為年度科學(xué)十大突破之一?？梢娮鳛榛虮磉_(dá)調(diào)控的重要機(jī)制，RNAi已得到科學(xué)界的認(rèn)同和高度重視。最近科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)了許多參與RNAi的基因和蛋白質(zhì)，這表明RNAi 與細(xì)胞分化及生物發(fā)育密切相關(guān)，并且在基因表達(dá)調(diào)控和基因功能研究中發(fā)揮重要的作用[6]。

1　RNA干擾可能的分子機(jī)制

目前已知RNAi的作用機(jī)制由siRNA、miRNA、piRNA等small RNA引發(fā)，其作用機(jī)制也有所不同[7]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對RNAi作用機(jī)理的研究也取得了一定的進(jìn)展。研究人員發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象在基因轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平等多個不同的水平都存在。RNAi可以用兩種分子機(jī)制進(jìn)行解釋，一種機(jī)制是抑制靶mRNA的翻譯，使靶蛋白表達(dá)受阻；另一種機(jī)制是通過誘導(dǎo)靶基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，使靶基因的轉(zhuǎn)錄受阻[6]。RNAi作用過程大致可以分為起始、效應(yīng)、擴(kuò)增三個階段，這三個階段都需要一系列中間物質(zhì)的參與[8]。

1.1起始階段

起始階段主要包括dsRNA 的形成和siRNA的產(chǎn)生關(guān)鍵步驟。

1.1.1dsRNA 的形成

在RNAi研究中誘導(dǎo)靶標(biāo)基因mRNA沉默的關(guān)鍵分子是相對于小片段siRNA的長dsRNA[9]，外源DNA、RNA序列均可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的dsRNA，但產(chǎn)生的方式有所不同[6]。細(xì)胞可以通過特定轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列產(chǎn)生dsRNA，細(xì)胞中正義和反義RNA的同時轉(zhuǎn)錄也可產(chǎn)生dsRNA。而RNA病毒需要在RNA聚合酶(RNAdependent RNApolymerases，RdRP)的幫助下，與合成的病毒RNA序列互補(bǔ)鏈結(jié)合形成dsRNA[10]。線蟲可以通過直接注射或浸泡溶液中等方式引入外源dsRNA[6]。對某一基因進(jìn)行研究前提是獲得相應(yīng)的mRNA序列信息，因?yàn)楫?dāng)dsRNA進(jìn)入昆蟲細(xì)胞內(nèi)會被 Dicer 酶切割成siRNA，而作用靶標(biāo)分子必須為mRNA的形式[9]。

1.1.2siRNA的產(chǎn)生

siRNA(short interfering RNA, siRNA)也被稱為向?qū)NA(guide RNA)，RNAi反應(yīng)由siRNA啟動。當(dāng)dsRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時，長dsRNA會被核酸酶RNaseⅢ家族中的Dicer酶，逐步切割成約21-23 nt的由正、反義鏈組成的雙鏈小分子干擾RNA片斷[6]。使靶標(biāo)基因沉默的siRNA長度一般為19～25 nt，而在這個階段中RNaseⅢ起著核心作用[10]。作為切割工具的Dicer參與RNaseⅢ的作用必須要結(jié)合dsRNA 的末端才能發(fā)揮作用，一旦這種末端結(jié)合被阻斷，Dicer 的核酸內(nèi)切酶作用將大大削弱。

1.2效應(yīng)階段

效應(yīng)階段是指siRNA雙鏈解開變成單鏈，反義siRNA和相應(yīng)的蛋白結(jié)合形成具有活性的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex, RISC)。RISC能夠識別與siRNA具有完全互補(bǔ)序列的mRNA，特異地降解mRNA。因此RISC的形成與作用是這一階段的關(guān)鍵。

1.3擴(kuò)增階段

從線蟲和植物細(xì)胞RNAi研究得到的經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在 RNA聚合酶的參與下，以第1次dsRNA的降解得到的siRNA的反義鏈為引物，靶mRNA作模板，形成新的dsRNA，再次被內(nèi)切酶Dicer識別并切斷，形成新的siRNA再作用于另外的靶向mRNA。這樣依次循環(huán)進(jìn)行使RNAi作用信號在生物體中可以不斷放大。

2　昆蟲RNAi的導(dǎo)入方法

柞蠶基礎(chǔ)應(yīng)用研究起步相對滯后，各種基因功能研究工作開展難度較大，現(xiàn)階段RNAi技術(shù)在柞蠶上的應(yīng)用實(shí)例少之又少。但是放眼昆蟲綱，RNAi技術(shù)已經(jīng)取得了顯著的成績。尤其是對昆蟲RNAi的導(dǎo)入方法的探索已經(jīng)相對明朗。

要利用 RNAi技術(shù)對昆蟲靶標(biāo)基因進(jìn)行功能分析，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵技術(shù)就是將dsRNA或siRNA 導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)。目前可以通過傳統(tǒng)微注射磷酸鈣法、電穿孔轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等方法將獲得的dsRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，也可以通過顯微注射法、壓力滲透導(dǎo)入等方法對靶基因沉默[6]?，F(xiàn)在昆蟲RNAi導(dǎo)入的環(huán)節(jié)廣泛采用注射和飼喂兩種途徑。

2.1注射法

在大部分昆蟲 RNAi研究之中，利用注射法導(dǎo)入dsRNA是常用且有效的方法之一。大多數(shù)人認(rèn)為，只要將dsRNA或siRNA注入到靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)，干擾的效果就會發(fā)生。但事實(shí)上，干涉效率僅取決于可用性的核心干涉RNA[11-12]。

注射法屬于系統(tǒng)性RNA干擾。首先選取適當(dāng)發(fā)育時期的研究昆蟲，對于活動能力強(qiáng)的昆蟲進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖`。根據(jù)昆蟲血液循環(huán)規(guī)律選取合適注射部位。通過對一般昆蟲中進(jìn)行的RNAi試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，相同dsRNA濃度下齡期相對小的蟲子誘導(dǎo)RNAi效果更佳一些。但不是對所有昆蟲的所有基因都是這樣，必須要根據(jù)自己的研究進(jìn)行試驗(yàn)才能明確[9]。不同的昆蟲對于系統(tǒng)RNA的沉默所需dsRNA或siRNA的劑量存在很大的差異。在大多數(shù)的報道中，這個標(biāo)準(zhǔn)范圍一般都在1～100 μg之間[11]。但這種是多數(shù)情況，有些昆蟲對雙鏈 RNA有著很強(qiáng)的抵抗力，即使加大劑量，也起不到沉默效果。例如Tabunoki等[13]對家蠶腸道注射dsRNA發(fā)現(xiàn)，但標(biāo)靶蛻皮基因受體沒有任何的系統(tǒng)沉默效果。此外，注射壓力和注射造成的傷口不可避免的會激發(fā)昆蟲的免疫反應(yīng)，因此研究昆蟲免疫反應(yīng)不宜采取注射方式進(jìn)行RNAi[14]。

2.2飼喂法

飼喂法屬于非系統(tǒng)性 RNAi，對于一些難以采用注射導(dǎo)入dsRNA的昆蟲而言是一種有效的RNAi研究方法，通過喂食的途徑可以達(dá)到沉默的效果。與直接注射的方法相比，采用喂食的方法使機(jī)體不受損傷，在未來試驗(yàn)中將得到更好的利用，尤其在轉(zhuǎn)基因植物研究中能夠起到相當(dāng)大的幫助。同時飼喂法也是一種快速的篩選靶基因的途徑。飼喂法操作相對簡單，但是由于研究昆蟲的個體大小、個體習(xí)性，以及食下后作用部位、時間等原因?qū)ξ故车牧?、喂食時間、喂食次數(shù)的確定還是一個有待于亟需解決的難題。因此相對于注射法的直接作用，飼喂法在RNAi研究的的早期的相對成功率較低，但是現(xiàn)已在多個昆蟲上取得了明顯的成功。Tian等[15]采用飼喂法再甜菜夜蛾上獲得了很好的試驗(yàn)效果。同時也有試驗(yàn)證明，對昆蟲喂食dsRNA后24 h內(nèi)不再喂食，最后取得的干擾效果會大大加強(qiáng)，原因可能是昆蟲處于饑餓狀態(tài)時，吸收的效率會大大提高[11]。

3　昆蟲 RNAi的研究現(xiàn)狀

RNAi作為基因功能的一個研究手段從問世以來受到多方關(guān)注。隨著RNAi技術(shù)可行性的提高以及操作的簡單化，RNAi技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用。目前在昆蟲上的RNAi技術(shù)也相對成熟，但是在鱗翅目大蠶蛾科的柞蠶的基礎(chǔ)研究中該技術(shù)應(yīng)用相對較少，也正因?yàn)槿绱俗跣Q的功能基因的研究還處于起步階段，已知功能的基因數(shù)量較少。所以可以借鑒RNAi技術(shù)在其他昆蟲綱物種取得的經(jīng)驗(yàn)結(jié)合自身特點(diǎn)加以應(yīng)用。

3.1在基因功能研究上的應(yīng)用

之前研究人員采用RNAi技術(shù)通過注射法將類鈣粘蛋白基因?qū)?yīng)的dsRNA導(dǎo)入到小菜蛾幼蟲體內(nèi)，48 h后試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)量顯著下降，但到72 h后表達(dá)量逐漸恢復(fù)。 采用免疫印跡法進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，注射dsRNA 48 h后幼蟲刷狀緣膜囊泡中的類鈣粘蛋白含量明顯下降。此試驗(yàn)結(jié)果為RNAi分析技術(shù)在小菜蛾乃至其他鱗翅目昆蟲基因的功能的研究上提供了參考依據(jù)[14]。Benencourt等在對天蠶蛾和家蠶研究發(fā)現(xiàn)，將dsRNA注射蛹到中發(fā)現(xiàn)，RNAi即使可以使卵巢的卵母細(xì)胞呈現(xiàn)出很好的吸收效果，并且影響胚胎表型的生長[15]。

RNAi技術(shù)可以作為研究基因功能的一個手段，科研人員采用RNAi技術(shù)克隆了家蠶Caspase家族基因BmCaspase-X，并對該基因的功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)家蠶BmCaspase-X含有Caspase家族基因所特有的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，屬于家族中的一員。但對該基因的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[16]。

3.2生物防治方面應(yīng)用

現(xiàn)階段在對新型藥物和農(nóng)藥的研究上已經(jīng)采用了更為先進(jìn)的技術(shù)。這些技術(shù)中有通過利用昆蟲細(xì)胞、胚胎、幼蟲和成蟲借助RNAi技術(shù)在昆蟲細(xì)胞或個體模型中直接沉默目標(biāo)基因，從分子水平尋找藥物靶標(biāo)、開發(fā)新型農(nóng)藥[17]。Baum利用RNAi和轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功培育了能夠表達(dá)與美國西部玉米根蟲 (western corn rootworm，WCR) 液泡 ATPase編碼基因同源的dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米，增強(qiáng)了玉米對WCR的抗性，減輕了WCR對玉米的危害，進(jìn)一步提高玉米產(chǎn)量和質(zhì)量[18]。蜜蜂有在自然養(yǎng)殖條件下容易受 IAPV(Israeli acute paralysis virus以色列急性麻痹病毒)干擾而導(dǎo)致的死亡現(xiàn)象。Hunter等[4]通過對蜜蜂的野外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了與IAPV同源dsRNA，以此推斷通過RNAi技術(shù)可以幫助減少蜜蜂野外因IAPV的意外死亡，提高蜜蜂自然養(yǎng)殖的數(shù)量。

4　前景

柞蠶屬于鱗翅目大蠶蛾科柞蠶屬，其基礎(chǔ)研究相對于家蠶和果蠅等模式昆蟲較為落后。對于柞蠶的基因研究比較滯后，基因組還處于研究過程，各個基因的功能作用還不完全明確。

RNAi作為一種在動物植物界廣泛應(yīng)用的基因沉默的手段，已經(jīng)在昆蟲多個物種的基因功能，病蟲害防護(hù)等領(lǐng)域取得可喜的結(jié)果。而柞蠶采用這項(xiàng)技術(shù)研究的報道相對較少，因此應(yīng)該將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于柞蠶的研究中去。

昆蟲上應(yīng)用RNAi技術(shù)的示例相對較多，也取得了較好的結(jié)果。但是依然存在一些關(guān)鍵的問題需要解決，例如對于dsRNA的合成，這是RNAi技術(shù)應(yīng)用的前提，對于不同的基因結(jié)構(gòu)，并不是 dsRNA片段的長度越長或者越短沉默效果越好。有研究人員證實(shí)dsRNA長度在300～520bp之間沉默效果最佳[19]，這需要具體昆蟲具體分析參考，借鑒前人的研究結(jié)果設(shè)計(jì)柞蠶最適宜的dsRNA長度。而siRNA同樣也可以達(dá)到基因沉默的效果，但是合成費(fèi)用相對較高，因此一般都采用dsRNA進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。昆蟲介導(dǎo)方式的選擇，注射法認(rèn)為是效果較好的方法，dsRNA可以注射到昆蟲的任何部位，通常選擇在昆蟲的前胸和腹部，相對于不同的昆蟲注射的部位，注射的時期，注射的量會稍有不同。柞蠶四個不同時期通?？梢赃x擇老熟幼蟲和蛹期進(jìn)行注射。對于柞蠶的研究要進(jìn)行一系列嘗試性試驗(yàn)，弄清時間、部位、注射劑量的最佳范圍。注射法操作相對復(fù)雜，需要相關(guān)技術(shù)人員應(yīng)具有一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)，飼喂法相對操作簡單，一般飼喂法是將合成的dsRNA加入到飼料中，但效率不及注射法。因此需要以量取勝，對于試驗(yàn)的花費(fèi)相對會增加。如果選用飼喂法，對于飼喂的時間，飼喂的量，其作用時間等關(guān)鍵的問題的研究同樣需要潛心進(jìn)行嘗試。無論是注射法還是飼喂法在昆蟲上都有大量的成功案例，可以加以借鑒與引用。RNAi在基因功能，信號傳導(dǎo)通路，基因表達(dá)調(diào)控等多個領(lǐng)域都能起到一定的基礎(chǔ)的作用，通過將特定的基因沉默，結(jié)合基因結(jié)構(gòu)研究了解基因的功能，同時結(jié)合載體連接、精子介導(dǎo)等技術(shù)完成轉(zhuǎn)基因的一部分實(shí)驗(yàn)，因此RNAi技術(shù)只是一個基礎(chǔ)的工具，它可以為后續(xù)的試驗(yàn)以及結(jié)果夯實(shí)基礎(chǔ)。

柞蠶的基因研究領(lǐng)域必然要采用這一技術(shù)，且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)的操作會越來越成熟，需要的經(jīng)費(fèi)會逐漸減少，關(guān)鍵問題也會迎刃而解，今后在柞蠶基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究等多方面肯定會取得喜人的成績。

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Research Status of RNA Interference and its Prospect for Tussah Basic Application Research

CHEN Miaomiao,ZHONG Liang,ZHAO Chunshan,WANG Fengcheng，JI Wanjie，ZHANG Bo，LI Xisheng*

(Liaoning Provincial Sericultural Institute, 118100, Fengcheng, Liaoning ,China)

RNA interference has been widely used in the study of insect genes, which is induced by double-stranded RNA and eventually led to the silence of homogenous mRNA.This paper mainly summarized the design of dsRNA, import methods, applications of RNAi both in domestic and overseas, and prospected the application of RNAi in tussah basic research.

RNAi; dsRNA; Antheraea pernyi

諶苗苗(1988—)，女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，從事柞蠶品種資源保護(hù)。

李喜升(1970—)，男，博士，研究員。

* 資助項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-22);遼寧省科技攻關(guān)項(xiàng)目