林威敏　肖天放*　福建農(nóng)林大學動物科學學院　福州　350002

畜禽DNA甲基化研究進展

林威敏肖天放*福建農(nóng)林大學動物科學學院福州350002

基因組甲基化是通過甲基轉(zhuǎn)移酶催化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶，是表觀遺傳學的重要組成部分，對許多生理活動具有重要影響。文中主要從甲基化在畜禽上的研究進展，以及近幾年在長鏈非編碼RNA等研究進展，概述DNA甲基化研究的發(fā)展。

甲基化表觀遺傳學畜禽

表觀遺傳學是指DNA序列無變化的、可遺傳的基因表達改變。其中，DNA甲基化是表觀遺傳學中一個重要的修飾形式［1］?；蚪M水平的DNA甲基化是在 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 （DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，以硫腺苷甲硫氨酸（adenosine methionine sulfur，SAM）作為甲基供體，將一個甲基添加到胞嘧啶的5′-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）［2］。DNA甲基化對于許多生理過程包括遺傳、繁殖、發(fā)育以及疾病等方面具有重要的影響。文中主要從動物生產(chǎn)方面尤其是畜禽生產(chǎn)方面，對DNA甲基化研究進展進行整理概括。

1　畜禽DNA甲基化的研究概況

1.1DNA甲基化酶系統(tǒng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）是DNA甲基化的主要催化因子。目前在哺乳動物中，常見的DNMT有Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L［3］，其中對DNMT系統(tǒng)中Dnmt2的研究獲得了大量成果。其廣泛分布在各種生物中，包括哺乳動物、鳥類、魚類、昆蟲、植物、真菌等［4］。雖然Dnmt2對DNA甲基化作用的研究仍然沒有一個廣泛被認可的結(jié)論，但是現(xiàn)有的認識主要集中在以下幾點：（1）Dnmt2不是一種DNA甲基化酶，而是一種RNA甲基化酶；（2）Dnmt2具有廣泛的內(nèi)源RNA甲基化活性，并且在表觀遺傳中起重要作用［5］；（3）Dnmt2有可能是古老的病源防疫機制的因子之一［6］。此外，有研究表明，Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b在低氧環(huán)境下對于小鼠大腦皮質(zhì)具有重要的保護作用。其對DNA甲基化的催化作用，對機體的正常生理維護具有重要作用［7］。

1.2DNA甲基化生物學作用DNA甲基化參與多種生命調(diào)節(jié)形式，對正常生理調(diào)控起著重要作用。

1.2.1參與基因的表達調(diào)控大量研究表明，無論是在啟動子區(qū)域的CpG島中，亦或是基因內(nèi)部，DNA的甲基化水平越高，基因的表達越少，呈現(xiàn)一種明顯的負相關關系。較低的甲基化水平，卻與轉(zhuǎn)錄活性呈正相關關系，對基因的轉(zhuǎn)錄、染色體構(gòu)型等方面產(chǎn)生影響，進而影響基因的表達［8］。有觀點認為，甲基化有利于異常染色質(zhì)的生成，對機體的遺傳發(fā)育產(chǎn)生影響。

1.2.2對發(fā)育分化產(chǎn)生影響生物發(fā)育過程中，基因的序列是不變的。但是在個體發(fā)育的不同時期，基因的表達卻是有相對規(guī)律性的；相關的基因與DNA甲基化關系密切。胚胎階段，通過DNA的甲基化與去甲基化，形成新的甲基化模式，并且能夠產(chǎn)生具有發(fā)育潛質(zhì)的細胞［9］。甲基化對機體正常發(fā)育起到重要作用。

1.2.3DNA甲基化與基因組印記哺乳動物性細胞形成或產(chǎn)生合子時，親本基因產(chǎn)生專一性修飾，使后代體細胞源于親本的基因表達活性差別不同，這就是基因組印記。研究表明，產(chǎn)生這種情況的主要原因是因為親本等位基因被甲基化造成的［10］。

1.3DNA甲基化檢測方法DNA甲基化常用的檢測方法主要分為全基因組DNA甲基化水平檢測與DNA甲基化位點檢測。

1.3.1全基因組DNA甲基化檢測常用的全基因組DNA甲基化檢測方法往往有：（1）酶切法：常用的甲基化限制性內(nèi)切酶有HapⅡ、MspⅠ、NotⅠ、Bst UⅠ等。利用這些限制性內(nèi)切酶對5mC端的敏感性差異，可以把那些沒有甲基化的基因組DNA切成小片段，而甲基化的基因組DNA則不受影響。往往酶切法可以將甲基化片段切割為大小不一的片段，然后再進行檢測，這種方法操作簡便，成本低，效果顯著。但是會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，干擾結(jié)果［11］。（2）免疫共沉淀即亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換法：由于酸性亞硫酸鹽可以使未甲基化的胞嘧啶（C）脫氫基變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而甲基化的胞嘧啶（C）則不受影響。之后利用PCR對處理過后的DNA模板鏈進行擴增，胸腺嘧啶（T）與處理得到的尿嘧啶（U）互補。在測序中由于亞硫酸鹽處理過后的DNA鏈（克里克鏈 BSC）與互補鏈（沃森鏈BSW）無法互補，就出現(xiàn)四種不同的序列。經(jīng)過片段分離，檢查出甲基化的胞嘧啶（C），利用芯片或是大規(guī)模測序可以獲得所需要的結(jié)果。但是亞硫酸轉(zhuǎn)化法會出現(xiàn)C/T不匹配的問題，需保證完全配對，而且工作量較大。

目前新一代甲基化檢測方法有全基因組亞硫酸氫鈉測序法 （whole-genome shotgun bisulphate sequencing，WGBS），是可以完全實現(xiàn)全基因組單堿基分辨率的甲基化檢測方法。該方法多用于多組織、多樣本的DNA甲基化檢測。但是該方法也存在費用昂貴且經(jīng)亞硫酸鹽處理過的序列復雜度降低等問題［3］。

另外還有其他性價比較為可觀的方法，包括限制性內(nèi)切酶的測序方法 （MRE-Seq）［12］、5-甲基胞嘧啶單克隆抗體的測序方法（MeDIP-Seq）以及簡化過的亞硫酸氫鈉測序技術(shù)（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）等［13］。

1.3.2DNA甲基化位點檢測某個DNA甲基化位點的檢測方法一般采用以下方法：（1）亞硫酸氫鹽測序PCR（Bisulfite sequencing PCR，BSP）或是甲基化特異性PCR（Methylation-Specific PCR，MSP）等方法，均利用亞硫酸鹽對未發(fā)生甲基化的胞嘧啶（C）進行脫氫作用，再利用PCR對處理過的序列進行擴增，判斷是否發(fā)生甲基化。這兩種方法準確度高，但也存在費時費力的問題。（2）甲基化位點特異性結(jié)合的層析法，利用與甲基化特異性結(jié)合的蛋白，使之與甲基化位點特異性結(jié)合。一般是把特異結(jié)合蛋白的一端和凝膠結(jié)合，另一端則暴露出來，用于檢測DNA片段上的甲基化位點，甲基化的DNA就可以被特異性結(jié)合蛋白檢測出。（3）熒光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR）：利用經(jīng)過亞硫酸鹽處理過的甲基化片段可與設計的探針序列特異性結(jié)合的特點，在探針的5'末端連接一個報告熒光基團（比如FAM），在其3'末端連接一個淬滅熒光基團（比如TAMRA），之后進行PCR擴增。如果探針可與DNA片段雜交，由于Taq DNA聚合酶的作用，5'末端的熒光基團被切下，而失去了淬滅熒光基團的抑制，就會出現(xiàn)熒光現(xiàn)象。通過每次循環(huán)熒光的強度測定，就可以得到DNA甲基化的強度［14］。這種方法操作簡單，靈敏度較高，但是也存在易受環(huán)境影響，不能得到較完全的甲基化信息的不足。

1.4DNA甲基化在畜禽上的研究進展DNA甲基化在畜禽生產(chǎn)上的研究也已經(jīng)取得大量成果。

在乳牛上的DNA甲基化研究，主要集中在相關的乳牛生產(chǎn)及疾病預防中，有研究表明，乳牛金黃色葡萄球菌性乳房炎能夠促使乳腺組織DNA再甲基化，DNA再甲基化可能是乳牛乳房炎急性期的一種普遍調(diào)控［15］。另外，根據(jù)已有的研究可知，烯脂酰輔酶A水合酶短鏈1（enoyl-CoA hydratase short chain 1，ECHS1）的表達對機體的正常生長發(fā)育有著重要的維持作用。因此，王鳳武等利用BS-Seq方法檢測了ECHS1的甲基化模式圖，得到在荷斯坦乳牛459 bp的ECHS1片段中有28個CpG位點，其中多個位點對β-氧化有重要的調(diào)控作用［16］。

在試驗小鼠的研究過程中，Lee Y M等通過應用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶制劑5-aza-dC（5-aza-2'-deoxycytidine，10 μmol/L～5 μmol/L）對小鼠胚胎進行實時定量（Q-PCR）處理，得到5-aza-dC干預修飾微小RNA（microRNA）的概況，以及在小鼠桑椹胚至囊胚階段對象識別提供信息，用來探索生育以及microRNA的調(diào)控和表觀遺傳干預之間的關系［17］。

對于豬的DNA甲基化研究，李明洲等構(gòu)建了豬的脂肪和肌肉DNA甲基化圖譜，因為豬是一種和人類生理活動十分接近的模式動物，除了可以獲得不同部位的豬肉脂肪沉積的差異，還可以為人類破解肥胖問題提供相應的基礎型數(shù)據(jù)，具有重大的參考價值［18］。另外，白小青等人以榮昌豬為實驗動物，利用HPLC法檢測了不同體重，閹割后榮昌豬的心臟、肝臟、橫膈膜三種組織中的基因組DNA的甲基化水平，結(jié)果顯示不同體重對基因組DNA甲基化具有重要影響［19］。借鑒了小鼠成纖維細胞重編程為誘導多能干細胞（iPSCs）的研究，魏可等研究了35日齡豬胎兒的干細胞多能性相關基因啟動子區(qū)域甲基化情況，結(jié)果顯示體細胞重編程為iPSCs的過程伴隨著多能基因啟動子甲基化程度的降低，為理解iPS重編程中多能性相關基因的DNA去甲基化過程和了解控制多能性相關基因的表觀遺傳調(diào)節(jié)提供基礎［20］。

另外，根據(jù)研究得知，不同年齡的仔豬，其抗原處理相關轉(zhuǎn)運體1（Transported associated with antigen processing，TAP1）基因的啟動子區(qū)域，存在三個潛在的調(diào)控位點，分別是 CpG-4、CpG-13以及CpG-15，對TAP基因的甲基化具有一定的調(diào)控作用。另外，TAP1基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化對TAP1的表達具有負相關作用 （P＜0.05），其mRNA的表達隨著日齡的增加而增加。進而隨著日齡增加，影響TAP1蛋白，從而對仔豬的肺水腫與腹瀉產(chǎn)生影響［21］。

另外根據(jù)Dong W等人的研究，利用重亞硫酸鹽測序PCR（Bisulfite Sequencing PCR）和熒光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR）分別對CpG島中 TAP1（Transported associated with antigen processing，TAP）基因啟動子的甲基化狀態(tài)和從出生到斷奶年齡的蘇太仔豬空腸的TAP1基因的表達進行研究，方差分析顯示，不同年齡對于CpG島中的甲基化水平具有顯著性影響（P＜0.05）［21］。

最近的一些有關甲基化的研究已經(jīng)開始集中在對于一些不表達的但是有證據(jù)顯示對機體的正常生理活動具有重要意義的基因組，即非編碼基因。長鏈非編碼RNA（lncRNAs）是基因組中一個主要的未開發(fā)的基因組件，能夠?qū)染色體的沉默，染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄激活，轉(zhuǎn)錄干擾核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控產(chǎn)生影響。周等人通過已知的甲基化DNA免疫沉淀測序（MeDIP-seq），利用民豬和長白豬重新構(gòu)建豬脂肪和肌肉中的lncRNAs甲基化模式。表明，不同日齡間民豬與大白豬背標甲基化存在差異；民豬和大白豬在150和180日齡之間出現(xiàn)去甲基化現(xiàn)象，其次是在180和210日齡［22］。該結(jié)果有助于理解lncRNAs基因參與脂肪沉積與肌肉發(fā)育的作用。

另外還有新的研究指出，不同濃度的微量元素對于基因組中的甲基化具有一定的影響。根據(jù)Karweina D等以54頭仔豬為實驗對象，隨機分為三組，只對鋅濃度進行分梯次控制的研究。結(jié)果表明DNA甲基化作為一種ZIP4（ZRT，IRT-like protein，ZIP）基因維持鋅平衡的調(diào)控機制，ZIP4基因甲基化對高濃度的鋅（Zin）的調(diào)控效果很低，但可能影響替代鋅反應轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合［23］。

2　甲基化的發(fā)展趨勢

隨著表觀遺傳學的發(fā)展，人們探究甲基化的步伐將繼續(xù)深入。已知的研究中，對于甲基化的作用機理已經(jīng)有了一定的認識，但是這些認識還是十分淺顯的。今后的研究中，關于甲基化和人類疾病之間的相互關系，將仍然會是一個熱門的研究方向。甲基化的檢測將成為作為人類疾病的診斷的一種手段。尤其是在人類早期癌癥的診斷上，具有重要的作用。一般來說，人體的原癌基因因為各種作用被限制，其中就有甲基化作用，抑制了原癌基因的表達。同時，抑癌基因充分表達，提高機體自身的抑癌機制。但是，原癌基因會因為某些原因，包括環(huán)境與生理原因，出現(xiàn)去甲基化現(xiàn)象，導致原癌基因被激活。然而，抑癌基因卻出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，從而導致癌癥的發(fā)生。研究表明，當機體的總體甲基化水平下降，而個別位點的甲基化水平明顯上升時，往往是早期癌癥發(fā)生的信號。基于此，甲基化水平的檢測可以成為人類疾病的一種有效的診斷方式，提高人類的健康水平。

同時，長鏈非編碼RNA（lincRNAs）的甲基化與去甲基化對于相關疾病的影響，也是一個重要的研究熱點。已經(jīng)獲得的研究成果表明，一些lincRNAs的甲基化調(diào)控，可以作為某些癌癥輔助治療的潛在靶點，例如HOTAIR［Homeobox（HOX）transcript antisense RNA］，可以作為小細胞肺癌耐藥性的輔助靶點［24］。

此外，也有一些學者已經(jīng)開始著手于將全基因組關聯(lián)分析 （Genome-Wide Analysis Study，GWAS）技術(shù)應用于甲基化的研究，將整個個體的全基因組作為一個研究對象，不再著眼于某一個或是某幾個基因組的甲基化對于某種特定的生理狀況作用的研究。此外，根據(jù)已經(jīng)完成的某些物種的de novo測序結(jié)果，篩查出具有潛在甲基化的區(qū)域，進一步研究該區(qū)域?qū)τ趥€體具體的生物學作用。

3　問題與展望

基因組甲基化作為表觀遺傳學的重要組成部分，在近些年的發(fā)展中，已經(jīng)取得了較為豐富的成功。但是，關于甲基化對機體具體的生理功能的作用機制與產(chǎn)生原因仍然不是十分清楚，依舊不能提供較為深入的解釋。例如各種人類癌癥中，為什么原癌抑癌基因會出現(xiàn)甲基化與去甲基化？環(huán)境與生理原因的對甲基化與去甲基化的作用機理是什么？甲基化與去甲基化二者之間相互轉(zhuǎn)化的作用機制是什么？控制機體產(chǎn)生甲基化現(xiàn)象的基因又在哪里？它的作用機理又是什么？這些問題都還沒有具體的研究成果。因此，今后的甲基化研究將繼續(xù)深入探討相關生理活動包括疾病的發(fā)生與作用機制。同時，對于非編碼RNA對于DNA甲基化的作用，也將進一步深入。此外，在動物生產(chǎn)方面，也將為動物育種飼養(yǎng)等方面提供理論基礎，為人來帶來新的經(jīng)濟效益。

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Research progress on DNA methylation of livestock and poultry

LinWeimin XiaoTianfang*
（College of animal science，F(xiàn)ujian agriculture and forestry university，F(xiàn)uzhou 350002）

Genome methylation is an important parts of Epigenetics，through methyltransferase catalyzes the Cytosine to the 5-methylcytosine，and significantly effects on many bioactives.This paper summarizes the developments in study of DNA methylation，during the progress in the study of methylation in livestock，and long noncoding RNA in recently years.

Methylation Epigenetics Livestock and poultry

A

1003-4331（2016）04-0035-04

科技部科技基礎性工作專項（2014FY120800）資助。

林威敏（1992-），男，研究生。E-mail：
957760184@qq.com。
*

肖天放（1964-），男，教授。E-mail：tfxiao@163. com。