文登臺，鄭　瀾，李秋芳，后文其，阮湘程，劉　羿

不同年齡段規(guī)律運動聯(lián)合NAD合成酶基因CG9940表達(dá)改變對果蠅生命周期和運動能力的影響

文登臺，鄭瀾，李秋芳，后文其，阮湘程，劉羿

目的：在NAD合成酶基因表達(dá)改變后的遺傳背景下，研究不同年齡段進(jìn)行規(guī)律運動干預(yù)對果蠅生命周期和快速攀爬能力的影響，為研究NAD合成酶基因的運動抗衰老效應(yīng)以及訓(xùn)練效應(yīng)提供更全面的理論依據(jù)。方法：利用UAS/GAL4系統(tǒng)使果蠅NAD合成酶基因表達(dá)正常、下調(diào)、上調(diào)和突變，不同遺傳背景果蠅分為對照組、運動6周組、7周后運動組和終身運動組，利用轉(zhuǎn)動平臺對不同時期果蠅進(jìn)行運動訓(xùn)練，qRT-PCR檢測NAD合成酶基因mRNA表達(dá)量，測量果蠅攀爬速度和統(tǒng)計生命周期。結(jié)果：表達(dá)下調(diào)組果蠅CG9940 mRNA表達(dá)量低于正常表達(dá)組（P＜0.01），下調(diào)率為56.98%；表達(dá)上調(diào)組高于正常表達(dá)組（P＜0.01），上調(diào)率為129.21%；突變組表達(dá)量低于正常表達(dá)組（P＜0.01）。CG9940表達(dá)下調(diào)組果蠅壽命低于正常表達(dá)組（P＜0.05），表達(dá)上調(diào)組和突變組壽命高于正常表達(dá)組（P＜0.05，P＜0.01）；正常表達(dá)組和表達(dá)上調(diào)組果蠅的運動6周、7周后運動、終身運動組壽命高于安靜組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05；P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）；表達(dá)下調(diào)的運動6周組壽命低于安靜組（P＜0.01）；突變的運動6周組、終身運動組壽命低于安靜組（P＜0.01，P＜0.01）。正常表達(dá)組和表達(dá)上調(diào)組3周齡果蠅的攀爬速度高于安靜組（P＜0.05，P＜0.05）。結(jié)論：果蠅NAD合成酶基因CG9940表達(dá)不同的群體中，生命晚期開始的適宜規(guī)律運動能對更廣泛群體的壽命產(chǎn)生效益；CG9940基因表達(dá)上調(diào)的攀爬效應(yīng)能與生命早期訓(xùn)練的攀爬效應(yīng)產(chǎn)生疊加，提高攀爬能力。果蠅CG9940功能與生命周期、攀爬能力密切相關(guān)，不同個體的運動抗衰老效應(yīng)、運動的攀爬效應(yīng)可能與NAD合成酶基因表達(dá)及突變有關(guān)。

CG9940；規(guī)律運動；生命周期；衰老

果蠅基因組簡單、轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟的特點[1]，使果蠅成為遺傳學(xué)，以及發(fā)育學(xué)研究的經(jīng)典模式生物。如沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silent information regulator，Sir2）從單細(xì)胞動物到人具有很好保守性，利用UAS/GAL4系統(tǒng)過表達(dá)果蠅Sir2，能促進(jìn)壽命延長[2]。此外，研究[3]還發(fā)現(xiàn)果蠅飲食限制（dietary restriction，DR）產(chǎn)生的延壽效應(yīng)與Sir2激活有關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，NAD+對Sir2的激活至關(guān)重要，過表達(dá)NAD補救合成途徑的關(guān)鍵酶基因Nmnat能提高果蠅NAD+水平，產(chǎn)生延壽效應(yīng)[4]。因此，Sir2和Nmnat是與衰老密切相關(guān)的基因，且大鼠及人類Sirtuin家族的許多類似功能已被越來越多的研究證實[5]。果蠅生命周期短，繁殖速度快，且對運動具有保守性[6-7]也是其優(yōu)勢。研究表明，規(guī)律運動能提高幼齡果蠅的攀爬能力和延緩老齡果蠅攀爬能力的增齡衰退[6]，改善老齡果蠅睡眠質(zhì)量[8]和增強生命活動節(jié)律性[9]，提高幼齡和老齡果蠅心臟功能[10-11]等。而果蠅規(guī)律運動對攀爬能力和心臟功能的增強與果蠅骨骼肌和心肌內(nèi)線粒體效率的提高有關(guān)[12]。正因為果蠅的許多運動效應(yīng)與人類及大鼠的運動效應(yīng)十分相似[13-14]，所以果蠅成為研究基因功能、運動功能、衰老等相互關(guān)系一種重要的模式生物[10，15]。

CG9940基因在果蠅體內(nèi)編碼合成NAD合成酶基因，NAD合成酶是NAD從頭合成的關(guān)鍵酶。早期研究結(jié)果表明，果蠅NAD合成酶基因CG9940過表達(dá)有延壽作用[16]，且該遺傳背景的果蠅運動敏感性強于野生型果蠅[11]。進(jìn)一步證實果蠅CG9940基因在延緩衰老和運動敏感性方面的功能，我們構(gòu)建CG9940基因表達(dá)下調(diào)（loss-of-function）、上調(diào)（gain-of-function）、突變（mutation）型和正常表達(dá)4種不同遺傳背景的果蠅。同時，為研究不同年齡段開始的規(guī)律對果蠅壽命的影響，對1周齡（幼齡）果蠅實施持續(xù)6周運動干預(yù)第7周末（老齡）結(jié)束（生命晚期無運動干預(yù)）、8周齡（老齡）開始運動干預(yù)（生命早期無運動干預(yù)）、終身運動干預(yù)的運動模型，研究不同年齡階段運動干預(yù)聯(lián)合CG9940不同遺傳背景對壽命的影響，以及CG9940不同遺傳背景果蠅快速攀爬能力的運動敏感性，為研究NAD合成酶基因的運動抗衰老效應(yīng)以及訓(xùn)練效應(yīng)提供更全面的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1果蠅品系來源及處女蠅收集CG9940轉(zhuǎn)基因品系果蠅購于美國Bloomington Drosophila Stock Center，野生型W1118和arm-Gal4品系由湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育中心饋贈（見表1）。所有品系果蠅放置于相同環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，果蠅從產(chǎn)卵到成蟲周期約為12天，在果蠅成蟲的6~8 h內(nèi)，收集未雜交的處女果蠅。雌雄分離：二氧化碳對果蠅麻醉，在體式顯微鏡下，根據(jù)雄性果蠅足上有性梳特征區(qū)分雌性。取野生型、CG9940轉(zhuǎn)基因的3個品系處女蠅，每組收集500只左右，arm-Gal4調(diào)控系雄性果蠅收集大約2 000只，每管20只，均放置于新培養(yǎng)基中飼養(yǎng)3~4天，檢驗是否含有異性果蠅而導(dǎo)致產(chǎn)卵，如果培養(yǎng)基有卵，則該管不用于實驗雜交。

表1　果蠅品系及來源Table1　Strains and sources of Drosophila

1.1.2雜交及分組CG9940基因位于X染色體上，是被調(diào)控目標(biāo)基因，14158品系的插入元素在CG9940啟動子區(qū)域且方向與CG9940正常轉(zhuǎn)錄方向相同，那么在arm-Gal4誘導(dǎo)下使EP插入?yún)^(qū)域的全身CG9940基因過表達(dá)；18730品系的插入元素在CG9940啟動子區(qū)域且方向而與CG9940正常轉(zhuǎn)錄方向相反，在arm-Gal4誘導(dǎo)下使EP插入?yún)^(qū)域的全身CG9940基因表達(dá)被干擾[17]。

雌 性 W1118、PBac{WH}CG9940f04110、P{Mae-UAS.6.11} CG9940[GG01267]和Mi{MIC}CG9940MI07227均與雄性調(diào)控系arm-Gal4雜交，雜交后F1代處女蠅有4種不同基因，分別為野生對照組W1118>arm-Gal4，CG9940基 因 表 達(dá)下調(diào)組 PBac{WH} CG9940f04110>arm-gal4，表達(dá)上調(diào)組P{Mae-UAS.6.11}CG9940GG01267>arm-gal4，突變組Mi{MIC}CG9940MI07227>arm-gal4（見表2）。不同基因表達(dá)系又分為4組，分別為安靜組、持續(xù)運動6周組、7周后運動組和終身運動組。總共16組，每組300只，均放入HWS智能型恒溫恒濕（寧波江南儀器廠制造）果蠅培養(yǎng)箱中，保持溫度25攝氏度、濕度50%、12小時晝∕夜循環(huán)飼養(yǎng)。

表2　果蠅雜交后F1代基因型Table2　Genotype of Drosophila in F1 generation

1.1.3運動方案及分組利用果蠅逆重力攀爬特性，采用第3代果蠅運動裝置進(jìn)行耐力運動訓(xùn)練，運動6周組從第2周（8天幼齡）開始運動第7周末停止運動，7周后運動組從第8周（49天老齡）開始運動第9周末停止運動，終身運動組從第2周（8天幼齡）開始運動第9周末停止運動。運動負(fù)荷根據(jù)果蠅年齡以及訓(xùn)練情況進(jìn)行梯度增減，如通過觀察果蠅運動過程中是否能跟上轉(zhuǎn)動速度，是否保持逆重力攀爬和趨光性等判斷果蠅是否運動疲勞[6，8]，電機(jī)轉(zhuǎn)動速度從2周至7周分別控制為0.18 r/s、0.20 r/s、0.18 r/s、0.16 r/s、0.14 r/s、0.12 r/s，8周至9周的速度均為0.10 r/s，每天下午14時開始訓(xùn)練，每次訓(xùn)練1.5 h，訓(xùn)練用試管直徑約為2.80 cm，連續(xù)訓(xùn)練5天，每周休息2天，運動方案結(jié)束24 h后測量攀爬速度（見圖1）。

圖1　第三代果蠅運動裝置和運動分組Figure1　The third generation training device of Drosophila and grouping

1.1.4果蠅培養(yǎng)基以配制1 L水的培養(yǎng)基為例（可按比例增減量），加入黃豆粉20.1 g、酵母粉24.8 g、玉米粉84 g攪勻，加熱過程中加入瓊脂8.57 g，加熱至沸騰（注意加熱過程中需不斷攪拌，防止燒糊）。沸騰后停止加熱，冷卻過程中加入蔗糖和麥芽糖各61.6 g（麥芽糖要慢慢加入，防止成團(tuán)）。待蔗糖和麥芽糖充分溶解后，加入防腐劑丙酸3.33 mL、對羥基苯（3.33 g溶于33.33 mL無水乙醇），充分?jǐn)嚢韬罅⒓捶盅b于潔凈的培養(yǎng)管中，培養(yǎng)基厚度為0.5~1.0 cm。

1.2指標(biāo)檢測

1.2.1實時熒光定量PCR檢測100 mg（10只果蠅）組織樣品勻漿，用Tripure試劑（Roche公司）提取RNA，用RNeasey mini spin cloumn試劑盒（Qiagen公司）對RNA進(jìn)行純化，然后用紫外分光光度計（美國Amersham Biosciences公司）定量，-70℃保存?zhèn)溆?。Premiers5.0軟件設(shè)計引物，經(jīng)NCBI-BLAST基因庫檢索驗證，與其他基因無高度同源性，內(nèi)參為rp49基因。CG9940基因引物序列F：5’-ATTTTTCCTGCCCCTAAGCG-3’；R：5’-GGACAGCCTGCACGATTTG-3’，取2 uLRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將PCR擴(kuò)增后，用2%的瓊脂糖電泳鑒定。內(nèi)參引物序列F：5’-CTAAGCTGTCGCACAAATGG-3’；R：5’-AACTTCTTGAATCCGGTGG G-3’。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，取稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 uL，加入SYBR?Premix Ex Taq（2×）15 uL（Takara）、PCR Forward Primer（10 μM）1 uL、PCR Reverse Primer（10 uM）1 uL、ROX 0.6 uL、ddH2O 7.4 uL，總體系30 uL，分3個重復(fù)孔，每孔10 uL。反應(yīng)條件：95℃變性30 s，95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，由熔點曲線判定PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)熒光曲線的Ct值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計算定量結(jié)果，檢測在ABI 7900HT（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）中進(jìn)行，計算基因相對表達(dá)值以及根據(jù)相對表達(dá)值計算平均過表達(dá)率。

1.2.2果蠅快速攀爬能力檢測分別在安靜組和終身運動組果蠅第1、3、5、7周齡末，將果蠅震落至培養(yǎng)瓶底部后，用NVGS400攝像機(jī)拍攝負(fù)其趨地性爬行的行為學(xué)特征。每組隨機(jī)取樣100只，分5管，每管20只。拍攝前，先震落5次進(jìn)行適應(yīng)。拍攝時，要求每次果蠅必須全部震落。檢測時間17︰00到18︰00。測量的試管底部至棉塞下端預(yù)留18 cm作為果蠅運動區(qū)域，記錄全部果蠅個體震落至試管底部后第5 s時果蠅的攀爬位置，測量每只果蠅的攀爬高度，平均攀爬速度（cm/s）=攀爬高度（cm）/5（s）。

1.2.3生命周期檢測每組取200只果蠅，從第42天齡開始，在18︰00至19︰00觀察和記錄果蠅死亡數(shù)，每隔一天換培養(yǎng)基并記錄死亡數(shù)量，直到各組果蠅全部死亡為止。制作果蠅存活曲線，統(tǒng)計每組果蠅的最高壽命，全部果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為果蠅的平均壽命，平均延壽命率（%）＝（運動組平均壽命－對照組平均壽）/對照組平均壽命×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)處理，相同周齡各安靜組果蠅攀爬速度比較、各安靜組生命周期比較和相同基因型安靜組與各運動組的生命周期比較用單因素方差分析的LSD分析，進(jìn)行多重比較；相同周齡相同基因型果蠅安靜組與運動組攀爬速度用獨立樣本T檢驗。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，顯著性水平取P=0.05。此外，“運動”“基因”2因素對壽命和攀爬速度的影響進(jìn)行雙因素方差中析因分析，分析其主效應(yīng)以及二者相互作用。

2　結(jié)　果

2.1CG9940基因mRNA表達(dá)量檢測結(jié)果

與野生型果蠅相對表達(dá)量相比，表達(dá)下調(diào)型果蠅CG9940基因mRNA表達(dá)量表達(dá)下降（P<0.01），下調(diào)率為56.98%；表達(dá)上調(diào)型果蠅相對表達(dá)量上升（P<0.01），上調(diào)率為129.21%；突變組表達(dá)量非常低，與正常表達(dá)組相差約8.70倍（見圖2）。

圖2　CG9940基因mRNA相對表達(dá)量Figure2　The relative expression of CG9940 gene mRNA

2.2CG9940基因表達(dá)改變、運動及二者聯(lián)合對果蠅生命周期的影響

2.2.1CG9940基因表達(dá)改變對果蠅生命周期影響CG9940基因表達(dá)下調(diào)組果蠅壽命低于正常表達(dá)組（P<0.05），表達(dá)上調(diào)組果蠅壽命和突變組果蠅生命周期高于正常表達(dá)組（P<0.05，P<0.01）；表達(dá)上調(diào)組和突變組果蠅生命周期均高于表達(dá)下調(diào)型果蠅（P<0.01，P<0.01）；突變型果蠅生命周期高于表達(dá)上調(diào)型果蠅（P<0.01）。野生型果蠅最高壽命為83天，表達(dá)下調(diào)、表達(dá)上調(diào)和突變型果蠅最高壽命和延壽率分別為81、83和88天，平均延壽率分別為-3.31%、2.59%和13.21%（見圖3）。

圖3　不同基因型果蠅生命周期情況Figure 3　The lifespan of Drosophila

2.2.2不同年齡段運動干預(yù)對CG9940表達(dá)正常果蠅生命周期的影響運動6周組、7周后運動組、終身運動組壽命均高于安靜組（P<0.05，P<0.01，P<0.05）；運動6周組壽命低于7周后運動組（P<0.01）；7周后運動組壽命高于終身運動組（P<0.01）。安靜組最高壽命為83天，運動6周、7周后運動和終身運動的最高壽命分別為83、86和83，平均延壽率分別為3.11%、7.35%和2.42%（見表3）。

2.2.3不同年齡階段運動干預(yù)聯(lián)合對CG9940表達(dá)下調(diào)果蠅生命周期的影響運動6周組壽命低于安靜組（P<0.05），7周后運動組壽命高于安靜組（P<0.01）；運動6周組壽命低于7周后運動組和終身運動組（P<0.01，P<0.01）；7周后運動組壽命高于終身運動（P<0.01）。安靜組最高壽命為81天，運動6周、7周后運動和終身運動的最高壽命分別為82、85和80，平均延壽率分別為-9.37%、7.21%和-0.39%（見表3）。

2.2.4不同年齡階段運動干預(yù)聯(lián)合對CG9940表達(dá)上調(diào)果蠅生命周期的影響運動6周組、7周后運動組、終身運動組壽命均高于安靜組（P<0.01，P<0.01，P<0.05）；運動6周的生命周期與7周后運動的、終身運動的生命周期相比無顯著差異；7周后運動的生命周期高于終身運動組（P<0.01）。安靜組最高壽命為83天，運動6周、7周后運動和終身運動的最高壽命分別為88、88和83，平均延壽率分別為3.53%、5.98%和2.39%（見表3）。

2.2.5不同年齡階段運動干預(yù)聯(lián)合對CG9940突變果蠅生命周期的影響運動6周組和終身運動組壽命低于安靜組（P<0.01，P<0.05）；運動6周組壽命低于7周后運動組和終身運動組（P< 0.01，P<0.01）；7周后運動的生命周期與終身運動的相比無顯著差異。安靜組最高壽命為88天，運動6周、7周后運動和終身運動的最高壽命分別為84、88和91，平均延壽率分別為-6.35%、-1.78%和-2.91%（見表3）。

2.3CG9940基因表達(dá)改變、運動及二者聯(lián)合對果蠅快速攀爬能力的影響

2.3.1CG9940基因表達(dá)改變對果蠅快速攀爬能力的影響1周齡攀爬速度比較，CG9940基因表達(dá)下調(diào)、上調(diào)和突變組果蠅攀爬速度均高于正常表達(dá)果蠅（P<0.01，P<0.01，P<0.01），其余各組比較無顯著差異（見圖4）。

表3　果蠅平均壽命（天）、最高壽命（天）、平均延壽率（n=200）Table 3　The mean lifesan of Drosophila（days），the highest lifespan（days），the average lifespan extension rate（n=200）

3周齡攀爬速度比較，CG9940基因表達(dá)上調(diào)組果蠅攀爬速度高于正常表達(dá)組果蠅（P<0.01），CG9940基因表達(dá)上調(diào)和突變組果蠅攀爬速度高于表達(dá)下調(diào)型果蠅（P<0.01），CG9940基因突變型果蠅低于上調(diào)型果蠅（P<0.05），其余各組比較無顯著差異。

5周齡攀爬速度比較，CG9940基因突變型果蠅攀爬速度高于野生組果蠅（P<0.01），表達(dá)下調(diào)組果蠅攀爬速度低于正常表達(dá)組果蠅（P<0.01），CG9940基因表達(dá)上調(diào)和突變組果蠅攀爬速度高于表達(dá)下調(diào)組果蠅（P<0.01，P<0.01），CG9940基因突變組攀爬速度果蠅高于上調(diào)組果蠅（P<0.05），其余各組比較無顯著差異。

圖4　不同年齡階段果蠅5 s內(nèi)攀爬速度比較。Figure4　Comparison of the rate of climbing speed of Drosophila 5s at different ages.

7周齡攀爬速度比較，表達(dá)下調(diào)組果蠅攀爬速度低于野生組果蠅（P<0.01），CG9940基因表達(dá)上調(diào)組果蠅攀爬速度高于野生組果蠅（P<0.05），CG9940基因突變組果蠅攀爬速度高于野生組果蠅（P<0.01），CG9940基因表達(dá)上調(diào)和突變組果蠅攀爬速度高于表達(dá)下調(diào)型果蠅（P<0.01，P<0.01），CG9940基因突變組果蠅高于上調(diào)組果蠅（P<0.01），其余各組比較無顯著差異。

2.3.2運動對野生型果蠅快速攀爬能力的影響3周齡野生型果蠅攀爬速度比較，運動組高于安靜組（P<0.05），5周和7周齡果蠅野生型果蠅攀爬速度比較，運動組與安靜組比較均無顯著差異（見表4）。

表4　果蠅5 s內(nèi)平均攀爬速度/cm·s-1Table4　TheaverageclimbingspeedofDrosophila5S/cm·s-1（n＝100）

2.3.3運動對CG9940基因表達(dá)下調(diào)對果蠅快速攀爬能力的影響表達(dá)下調(diào)組中，3周齡、5周齡、7周齡果蠅運動組與安靜組攀爬速度比較無顯著差異。

2.3.4運動對CG9940基因表達(dá)上調(diào)對果蠅快速攀爬能力的影響表達(dá)上調(diào)組中，3周齡果蠅運動組攀爬速度高于安靜組（P<0.05），5周齡、7周齡果蠅運動組與安靜組攀爬速度比較無顯著差異。

2.3.5運動對CG9940基因突變對果蠅快速攀爬能力的影響突變組中，3周齡、5周齡、7周齡果蠅運動組與安靜組攀爬速度比較無顯著差異。

2.4基因、運動對壽命、攀爬影響的析因分析

析因分析表明基因是影響的壽命主要因素（P<0.01），基因和運動對壽命的影響有交互作用（P<0.01），簡單效應(yīng)綜合分析表明對于無運動干預(yù)果蠅，壽命有顯著差異（F（1，2190）=15.37，P< 0.01）；對于運動干預(yù)的果蠅，壽命無顯著差異（F（1，2190）=1.10，P> 0.05）?；蚴怯绊?周齡攀爬速度的主要因素（P<0.01），基因和運動對攀爬的影響無交互作用（P>0.05）（見表5）。

表5　基因、運動對壽命、攀爬影響的析因分析Table5　Analysis of Gene and training impact of lifespan and climbing

3　討　論

3.1NAD合成酶基因表達(dá)改變、不同年齡段開始的規(guī)律的運動對生命周期的影響

利用UAS/GAL4系統(tǒng)對靶基因調(diào)控，使基因過表達(dá)（gain-offunction）、或表達(dá)下調(diào)（loss-of-function）、或突變（mutation）是研究基因功能的常用方法，當(dāng)3種不同的突變體同時存在實驗中，對基因功能的證實更全面[17-18]。CG9940基因在果蠅體內(nèi)編碼合成NAD合成酶基因，NAD合成酶是NAD從頭合成的關(guān)鍵酶，而NAD+對衰老有著重要影響。我們的研究結(jié)果顯示，NAD合成酶基因表達(dá)上調(diào)能延緩衰老，延長生命周期；反之亦然。此外，NAD合成酶基因突變的延壽效果最佳，說明這種突變對延緩衰老是積極的。盡管對果蠅和人而言，大多數(shù)突變是有害的，但也存在有利突變，如果蠅的Lgl（Lethal 2 giant larvae）基因，與人類Hugl-1基因同源，具有腫瘤抑制作用，該基因完全突變可能誘發(fā)癌癥，最近研究表明Lgl不完全突變在一定程度上有利于果蠅存活[19]。本實驗果蠅NAD合成酶基因表達(dá)高低影響果蠅壽命長短的分子機(jī)制，可能與NAD合成酶活性對老齡果蠅NAD+水平的影響有關(guān)。研究表明酵母、果蠅以及大鼠的衰老能造成個體NAD+水平系統(tǒng)性下降[20-22]，這可能是衰老導(dǎo)致線粒體功能失常[23-24]、Sir2活性降低[2]，端粒調(diào)節(jié)失常[25]，氧化應(yīng)激增加[26]等的原因之一。反之，線粒體功能失常、Sir2活性降低，端粒調(diào)節(jié)失常，氧化應(yīng)激會加快衰老進(jìn)程。通過提高衰老個體的NAD+水平，如飲食限制[4]、過表達(dá)Nmnat基因[3]，均能延長壽命，其主要原因是NAD+水平的提高能保證線粒體正常能量代謝、促進(jìn)Sir2的活性和端粒的調(diào)節(jié)，CG9940過表達(dá)和突變果蠅可能產(chǎn)生類似效應(yīng)，均能促進(jìn)NAD+水平升高，以對抗衰老導(dǎo)致的NAD+水平降低。盡管我們實驗證實NAD合成酶基因CG9940與果蠅壽命密切相關(guān)，并推測其機(jī)制可能與NAD+水平有關(guān)，但并未檢測果蠅個體NAD+水平，Sir2活性，線粒體功能等，所以其機(jī)制需要更深的研究證實。

此外，本實驗還證實NAD合成酶基因表達(dá)不同對運動的延壽效果產(chǎn)生影響。在衰老果蠅個體中，有沒有充足的NAD可能是適宜運動能否延長壽命因素之一[24]。NAD+產(chǎn)生運動適應(yīng)的前提可能與運動訓(xùn)練過程中是否有充足的NAD+維持其代謝平衡，來對抗運動產(chǎn)生破壞NAD+平衡的氧化應(yīng)激、ATP合成加快等因素有關(guān)[27]。如果NAD+本身不足，運動可能會使NAD+代謝更加紊亂，對延壽無益，甚至在某些方面造成消極效應(yīng)[28]。而NAD合成酶基因突變盡管安靜狀態(tài)下是一種有利突變，但該突變可能導(dǎo)致生成的NAD合成酶不利于運動應(yīng)激，運動干預(yù)可能會造成突變個體的NAD+水平下降或活性降低，導(dǎo)致衰老加快[21]。而關(guān)于不同年齡階段進(jìn)行開始運動干預(yù)對果蠅壽命產(chǎn)生不同影響，其內(nèi)在機(jī)制可能是：運動6周和終身運動組的前3周可能是大強度運動，這對NAD本身不足的CG9940基因表達(dá)下調(diào)型果蠅產(chǎn)生了很不利影響，對突變型果蠅的NAD合成酶產(chǎn)生不利效應(yīng)，所以兩個年齡段運動干預(yù)均能縮短壽命，但對野生型和表達(dá)上調(diào)型果蠅壽命有延長作用，因為體內(nèi)NAD+合成正常且充足；7周后運動組，由于運動強度適宜，加上是初始產(chǎn)生運動效應(yīng)，果蠅機(jī)體可能對這種新鮮適宜刺激產(chǎn)生有益效應(yīng)，使NAD+活性和含量產(chǎn)生有利變化[29]。因此對CG9940基因正常表達(dá)、表達(dá)下調(diào)和表達(dá)上調(diào)型果蠅均有延壽作用，而不會降低突變型果蠅壽命。提示生命晚期開始的規(guī)律運動能促進(jìn)更廣泛果蠅群體的壽命。

3.2運動訓(xùn)練聯(lián)合NAD合成酶基因表達(dá)改變對果蠅5 s內(nèi)快速攀爬能力的影響

NAD+是參與能量代謝的重要酶，在氧化磷酸化，三羧酸循環(huán)和呼吸鏈等生化過程中，NAD+接受脫下的H+成為NADH，NADH作為氫的載體，通過磷酸甘油穿梭從線粒體外進(jìn)入肌肉線粒體，在其內(nèi)膜上將電子傳遞給氧，氧化過程中釋放的能量合成ATP，ATP是能量的直接來源，與肌肉收縮密切相關(guān)，也直接影響運動能力[30]。通過改變果蠅CG9940基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CG9940表達(dá)下調(diào)雖然提高1周幼齡果蠅運攀爬速度，但對3周齡果蠅攀爬速度無明顯影響，甚至降低5周、7周齡果蠅攀爬速度；CG9940基因表達(dá)上調(diào)和突變果蠅在各個年齡階段的攀爬速度都強于野生型。提示CG9940基因作為NAD合成酶的關(guān)鍵基因，通過間接影響NAD合成影響果蠅的運動能力。此外，CG9940基因作為影響果蠅運動能力的基因之一，不同的表達(dá)對果蠅早期的運動訓(xùn)練敏感性不同，從1周齡開始運動干預(yù)，在第3周檢測，發(fā)現(xiàn)2周的訓(xùn)練能提高野生型和CG9940基因表達(dá)上調(diào)型果蠅的攀爬速度，同樣的運動訓(xùn)練對表達(dá)下調(diào)型和突變型果蠅攀爬速度無明顯影響，4周和6周運動訓(xùn)練對所有果蠅攀爬速度無明顯影響，這可能與后期運動強度降低、測量快速攀爬而不是時間稍長的耐力性攀爬有關(guān)[31]。CG9940基因表達(dá)差異導(dǎo)致運動訓(xùn)練效益不同，其內(nèi)在機(jī)制也可能與NAD+含量和活性有關(guān)[27]。研究表明大強度運動時體內(nèi)NAD+水平會暫時下降，主要與NADH不能及時傳遞H+而大量積累有關(guān)，長期訓(xùn)練使細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的NAD+水平和活性產(chǎn)生運動適應(yīng)，促進(jìn)能量代謝，從而提高運動能力[12，32]。盡管CG9940基因表達(dá)下調(diào)、上調(diào)和突變都有利于幼齡果蠅的快速攀爬，但只有CG9940基因表達(dá)上調(diào)能與運動訓(xùn)練產(chǎn)生疊加，進(jìn)一步提高攀爬速度，其機(jī)制之一可能與過表達(dá)增加果蠅體內(nèi)NAD+水平，運動適應(yīng)對NAD+影響產(chǎn)生聯(lián)合作用有關(guān)，能更利于能量代謝[33]。雖然突變導(dǎo)致果蠅個體運動能力增加，但運動能力對運動訓(xùn)練的敏感性不明顯，其機(jī)制可能是與突變后果蠅機(jī)體生成的NAD合成酶結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化有關(guān)[34]。

4　結(jié)　論

果蠅NAD合成酶基因CG9940表達(dá)不同的群體中，生命晚期開始的適宜規(guī)律運動能對更廣泛群體的壽命產(chǎn)生效益；CG9940表達(dá)上調(diào)的攀爬效應(yīng)能與生命早期訓(xùn)練的攀爬效應(yīng)產(chǎn)生疊加，提高攀爬能力。果蠅CG9940基因功能與生命周期、攀爬能力密切相關(guān)，不同個體的運動抗衰老效應(yīng)、運動的攀爬效應(yīng)可能與NAD合成酶基因表達(dá)及突變有關(guān)。

[1]BUSSON D，PRET AM.GAL4/UAS targeted gene expression for study in Drosophi-la Hedgehog signaling[J].Methods Mol Biol，2007，397：161-201.

[2]JULIA H，RENJA R，CHRISTINE F，et al.Overexpression of Sir2 in the adult fat body is sufficient to extend lifespan of male and female Dro?sophila[J].Aging（Albany NY），2013，5（4）：315-327.

[3]ROGINA B，HELFAND SL.Sir2 mediates longevity in the fly through a pathway related to calorie restriction[J].Proc Natl Acad Sci.2004，101：15998–16003.

[4]ALI YO，RUAN K，ZHAI RG.NMNAT suppresses tau-induced neurode?generation by promoting clearance of hyperphosphorylated tau oligomers in a Drosophila model of tauopathy[J].Hum Mol Genet，2012，21（2）：237-250.

[5]ANDREW M.DAVENPORT，F(xiàn)ERDINAND M，et al.Structural and Func?tional Analysis of Human SIRT1[J].J Mol Biol，2014，426（3）：526-541.

[6]MARTIN J，TINKERHESS，SARA G，et al.Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster[J]. Journal of Visualized Experiments，2012，（61）：1-5.

[7]鄭瀾，王小月，吳越，等.不同運動方案對果蠅運動能力、生命周期及心臟功能的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2013，31（7）：611-616．

[8]ZHENG L，F(xiàn)ENG Y，WEN DT，et al.Fatiguing exercise initiated later in life reduces incidence of fibrillation and improves sleep quality in Dro?sophila[J].AGE，2015，37（77）：1-12.

[9]KUNTOL R，REBECCA W，TOMASZ M，et al.Effects of exercise on cir?cadian rhythms and mobility in aging Drosophila melanogaster[J].Exp Gerontol，2013，48（11）：1260-1265.

[10]MAYUKO N，KAREN O，ROLF B，et al.Drosophila as a model to study cardiac aging[J].Exp Gerontol，2011，46（5）：326-330.

[11]文登臺，鄭瀾，田旭，等.耐力運動聯(lián)合NAD合成酶基因CG9940過表達(dá)對中老齡果蠅心臟功能、運動能力和壽命的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2015，34（10）：982-988．

[12]MARTIN J.TINKERHESS，LINDSEY H，et al.The Drosophila PGC-1a Homolog spargel Modulates the Physiological Effects of Endurance Ex?ercise[J].PLoS ONE，2012，7（2）：e31633.

[13]GRAEME CR，JEFFREY L.HASTINGS，PAUL S.B，et al.The effect of lifelong exercise dose on cardiovascular function during exercise[J].J Appl Physiol（1985），2014，116（7）：736-745.

[14]MASSIMO V，F(xiàn)EDERIO S，RUSSELL S.R.The role of exercise capaci?ty in the health and longevity of centenarians[J].Maturitas，2012，73（2）：115-120.

[15]SODA BD，ROLF B.Drosophila as a Model to Study the Genetic Mecha?nismsofObesity-AssociatedHeartDysfunction[J].JCellMol Med.2012，16（5）：966-971.

[16]文登臺，鄭瀾，林麗容，等.CG9940基因過表達(dá)對中老齡果蠅心臟功能運動能力及壽命的影響[J].北京體育大學(xué)學(xué)報，2014，37（7）：62-68．

[17]RORTH P，SZABO K，BAILEY A，et al.Systematic gain-of-function genetics in Drosophila[J].Development，1998，125：1049-1057.

[18]NAGARKAR J S.，Lee P T，CAMPBELL M E.A library of MiMICs al?lows tagging of genes and reversible，spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila[J].eLife，2015，4：e05338.

[19]YAMASHITA K，IDE M，F(xiàn)URUKAWA KT，et al.Tumor suppressor protein Lgl mediates G1 cell cycle arrest at high cell density by form?ing an Lgl-VprBP-DDB1 complex[J].Mol Biol Cell，2015，26（13）：2426-2438.

[20]WOJCIK M，SEIDLE H F，BIEGANOWSKI P，et al.Glutamine-depen?dent NAD（+）synthetase-How a two-domain，three-substrate en?zyme avoids waste[J].Journal of Biological Chemistry，2006，281：33395-33402.

[21]SOHAL RS，ARNOLD L，ORR WC.Effect of age on superoxide dis?mutase，catalase，glutathione reductase，inorganic peroxides，TBA-reac?tive material，GSH/GSSG，NADPH/NADP+and NADH/NAD+in Dro?sophila melanogaster[J].Mech Ageing Dev，1990，56（3）：223-235.

[22]RAMSEY K M，MILLS K F，SATOH A.，et al.Age-associated loss of Sirt1-mediated enhancement of glucose-stimulated insulin secretion in beta cell-specific Sirt1-overexpressing（BESTO）mice[J].Aging Cell，2008，7：78-88.

[23]MAMMUCARI C，RIZZUTO R.Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging[J].Mechanisms of Ageing and Developmen，2010，131：536-543.

[24]FERGUSON M，MOCKETT RJ，SHEN Y，et al.Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila mela?nogaster[J].Biochem J，2005，390（Pt 2）：501-511.

[25]WALTER MF1，BIESSMANN MR，BENITEZ C，et al.Effects of telo?mere length in Drosophila melanogaster on life span，fecundity，and fertility[J].Chromosoma，2007，116（1）：41-51.

[26]JIA H，LI X，GAO H，et al.High doses of nicotinamide prevent oxida?tive mitochondrial dysfunction in a cellular model and improve motor deficit in a Drosophila model of Parkinson's disease[J].J Neurosci Res，2008，86（9）：2083-2890.

[27]MENDEL R，ZHIQIANG W，WENYONG C.Sirtuins in Hematological Aging and Malignancy[J].Crit Rev Oncog，2013，18（6）：531-547.

[28]ERIKA K，ZSOFIA S，MUSTAFA A，et al.Exercise alters SIRT1，SIRT6，NAD and NAMPT levels in skeletal muscle of aged rats[J]. Mech Ageing Dev，2010，131（1）：21-28.

[29]SUWA M，SAKUMA K.The potential role of sirtuins regarding the ef?fects of exercise on aging-related diseases[J].Curr Aging Sci，2013，6（2）：178-88.

[30]黃熙泰，于自然，李翠鳳.現(xiàn)代生物化學(xué)[M].2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012，357-358．

[31]RHODENIZER D，MARTIN I，BHANDARI P，et al.Genetic and envi?ronmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed[J].Exp Geron?tol，2008，43：739-748.

[32]CANTO C，JIANG LQ，DESHMAKH AS，et al.Interdependence of AMPK and SIRT1 for metabolic adaptation to fasting and exercise in skeletal muscle[J].Cell Metab，2010，11：213-219.

[33]KOLTAI E，SZABO Z，ATALAY M，et al.Exercise alters SIRT1，SIRT6，NAD and NAMPT levels inskeletal muscle of aged rats[J]. Mech Ageing，2010，131：21-28.

[34]BEWLEY GC，DEZURIK JM，PAGELSON G.Analysis of l-glycerol-3-phosphate dehydrogenase mutants in Drosophila melanogaster：comple?mentation for intracellular degradation of the mutant polypeptide[J]. Mol Gen Genet，1980，78（2）：301-308.

The Effects of Regular Exercise at Different Ages Combined the NAD Synthetase Gene CG9940 Expression ChangesonLifespanandExerciseCapacityinDrosophila

WEN Dengtai，ZHENG Lan，LI Qiufang，HOU Wenqi，RUAN Xiangcheng，LIU Yi
（School of PE，Hunan Normal University，Changsha 410001，China）

Objective：Constructed CG9940 expression decreasing，raising and mutation，to studies The effects of regular exercise begins at different ages combined CG9940 gene polymorphism on fast climbing ability and lifespan in drosophila.Methods：used the UAS/GAL4 system to make CG9940 gene expres?sion changes after flies crossing，rotating platform is used to training at different age stages of fruit flies，detected CG9940 gene mRNA expression by q-RTPCR，measured climbing speed and lifespan statistics of fly.Results：Compared with the relative expression of wild-type flies，NAD synthetase gene downregulation fruit flies mRNA expression expression decreased（P＜0.01），lower rate of 56.98%；over-xpression fruit flies relatively increased expression（P＜0.01），increase rate of 129.21%；mutation expression amount is very low，and the normal expression group differ about 8.70 times.compared with wild-type flies，climbing speed increased after raised CG9940 gene expression on young（P＜0.01）and elderly（P＜0.05）fruit flies，Mutant enhanced climbing speed on young（P＜0.01）and elderly（P＜0.01）drosophila，at 3rd week，control group climbing speed is lower than the exercise group in both in wild-type flies（P＜0.05）and CG9940 over-expression flies（P＜0.05）.Compared with heart fibrillation index in wild-type flies，decreased the CG9940 gene expression in?creased fibrillation index（P＜0.05），over-expression’s is lower（P＜0.05），mutant’s is lower（P＜0.01）；Compared with wild-type flies，CG9940 gene ex?pression reduced makes lifespan shorten（P＜0.05），over-expression and mutant extend the lifespan（P＜0.05，P＜0.01），exercising 6 weeks，trained after the 6th week，lifelong exercised prolong lifespan of the wild type（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）and over-expression CG9940 gene flies（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），exercising 6 weeks shorten lifespan in CG9940 gene expression decreased drosophila（P＜0.01），exercising 6 weeks and lifetime training shorten lifespan in mutant（P＜0.01，P＜0.01）.Conclusion：Under the different genetic background of CG9940 gene，exercise has different effects on fast climbing，only wild andover-expression flies’fast climbing benefit from early exercise；Training begins at different ages show the different influences on lifespan，but exercise after the 6th week prolong life widely.Suggesting NAD synthetase gene expression can be used as one of athlete gene selection index；Older individuals should par?ticipate in appropriate exercise.

CG9940；regular exercise；lifespan；aging

●研究報道Short Comunications

10.13297/j.cnki.issn1005-0000.2016.04.012

G 804.5

A

1005-0000（2016）04-340-06

2016-03-26；

2016-06-12；錄用日期：2016-06-13

教育部博士點基金資助項目（項目編號：20134306110009）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（項目編號：CX2016B174）

文登臺（1989-），男，湖南株洲人，在讀博士研究生，研究方向為運動抗衰老候選基因篩選；通信作者：鄭瀾（1967-），女，湖南長沙人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為運動抗衰老候選基因篩選。

湖南師范大學(xué)體適能與運動康復(fù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410001。