李星賀,朱金艷,2,孟憲軍,*

(1.沈陽農業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110161;2.莊河市食品檢驗監(jiān)測中心,遼寧大連 116400)

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響應面法優(yōu)化超高壓鈍化藍莓汁中兩種酶活性工藝條件

李星賀1,朱金艷1,2,孟憲軍1,*

(1.沈陽農業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110161;2.莊河市食品檢驗監(jiān)測中心,遼寧大連 116400)

為了得到超高壓鈍化藍莓汁中酶活性的最優(yōu)工藝參數(shù),選取過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的酶殘留活性為響應值,根據Central-Composite實驗設計原理,建立了酶的殘留活性與超高壓處理壓力、時間和溫度之間的數(shù)學模型。并采用Design-Expert8.0.6進行響應面分析。實驗結果表明:鈍化過氧化物酶(POD)最佳處理條件為:處理壓力500 MPa、時間5 min和溫度40 ℃,處理后POD酶的殘留活性降至49.13%;鈍化多酚氧化酶(PPO)最佳處理條件為:處理壓力500 MPa、時間15 min和溫度10 ℃,處理后PPO酶的殘留活性降至4.776%。此外,在實驗條件為壓力500 MPa、處理時間15 min及溫度10 ℃時處理藍莓汁,POD和PPO的綜合鈍化效果最佳。

過氧化物酶,多酚氧化酶,超高壓,響應面法,藍莓汁

藍莓(Blueberry)屬杜鵑花科越桔屬植物,果實呈藍色,果肉細膩,果味酸甜,風味獨特。藍莓含有豐富的營養(yǎng)成分及多種酶類,如花色苷、維生素A、B、E、礦物質及過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)等[1-3]。藍莓果實由于存在收獲時間短、季節(jié)性強、不耐貯存運輸?shù)热秉c,所以給鮮銷帶來很大困難,目前主要采用榨汁并經殺菌的方式予以解決,但殺菌過程往往會造成產品的色澤、風味、營養(yǎng)等品質指標下降,嚴重影響產品的可接受程度[4]。因此以響應面法優(yōu)化超高壓鈍化藍莓汁中兩種酶活性工藝條件,達到兼顧殺菌與保留品質的雙重目標。

超高壓加工工藝是一種新興的冷加工技術,近些年來發(fā)展十分迅速[5-8]。在多種水果加工研究中發(fā)現(xiàn),超高壓處理不僅能殺滅水果果肉或果汁中的微生物,延長產品保藏期,并且可以抑制酶的活性[9-11]。POD、PPO均為降解花色苷的酶,能水解花色苷糖苷鍵產生花色素和糖,對藍莓汁中花色苷含量產生影響。并且會使藍莓汁褐變,影響產品的外觀,同時催化反應產物會影響果汁的口感和風味[12-15]。超高壓鈍化酶是通過改變酶蛋白的構象,即變性來抑制酶的活性[16-17]。酶的催化作用產生于其活性中心,活性中心與三維構象有關。高壓對酶的影響分為兩種情況:壓力較低時可能激活酶,壓力較高時使酶失去活性,加熱可以強化高壓抑制酶活性,超高壓處理中,酶的活性不僅取決于壓力的大小,同時與處理溫度、保壓時間和處理對象的化學組成都有關系[18]。目前國內外對藍莓汁超高壓滅菌效果研究較多,但對藍莓汁超高壓過程中POD、PPO的變化研究較少。

經研究發(fā)現(xiàn)加工工藝對藍莓汁中花色苷含量產生影響,而POD、PPO為降解花色苷的酶。因此,采用響應面法對超高壓鈍化藍莓汁中兩種酶活性的工藝條件進行優(yōu)化,得到兩種酶鈍化效果最佳的工藝條件,進而降低藍莓汁中花色苷的降解,減少加工工藝對花色苷含量造成的損失。使藍莓果汁在達到衛(wèi)生標準的前提下,保持產品原有風味口感和營養(yǎng)成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓 品種為 “藍豐”,采自遼寧省莊河藍莓基地,采摘后實驗室-18 ℃冷藏;乙酸、乙酸鈉、PEG、PVPP、TritonX-100、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫、鄰苯二酚均購于國藥試劑。

全自動超高壓殺菌機(HPP-600-L) 溫州濱一機械有限公司;循環(huán)水真空泵(SHZ-DIII) 鞏義市予華儀器有限責任公司;高速離心機(CR21G) 日本日立公司;恒溫水浴鍋(PK-S26) 上海精宏實驗設備有限公司;分光光度計(Varian Cary WinUV) 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試樣的準備 試樣制作工藝流程:藍莓→燙漂解凍→1∶5(質量比)加水榨汁→過濾去渣(兩層粗紗布)→4 ℃,12000 r/min下離心10 min→取上層液抽濾→定量、裝瓶(聚乙烯塑料瓶,不留頂隙)

1.2.2 實驗方案 以前期實驗為基礎得到結論,隨著超高壓壓力的升高、保壓時間的延長及介質溫度的升高,POD和PPO的殘留活性降低。采用Design-Expert8.0.6進行響應面設計,以壓力、時間和溫度作為自變量,以POD和PPO的殘留活性為響應值,局限于實驗室現(xiàn)有實驗條件,實驗因素水平及編碼見表1?？瞻讓φ諡槌?0.1 MPa)下未經處理的樣品[19-21]。

表1 實驗因素水平編碼表Table 1 Experimental values and coded level of factors

1.3 酶的活性檢測

1.3.1 過氧化物酶(POD)酶活性的測定 反應混合液為0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.5)50 mL、50 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液19 μL及30% H2O2溶液228 μL,取光徑為1 cm比色皿兩個,一個加入1 mL酶液和3 mL反應混合液,另一個加入3 mL 0.2 mL/L磷酸緩沖液(pH6.5)作為對照。用分光光度計在470 nm處測定反應3 min前后反應液吸光度變化[18]。

1.3.2 多酚氧化酶(PPO)酶活性的測定 取0.2%的鄰苯二酚溶液(用0.2 mol/L、pH7.4磷酸緩沖液配制)5 mL于試管中,25 ℃下水浴10 min,加入酶液0.5 mL,混勻后,放置1 min后在415 nm處測定吸光度,空白用5 mL磷酸緩沖液代替鄰苯二酚溶液[22-23]。

1.3.3 酶活性的定義 以每分鐘每毫升酶液吸光度變化0.01定義為1個酶活性單位。

1.3.4 酶的殘留活性的定義 酶的殘留活性(%)=處理后酶活性/對照樣品酶的活性×100

2 結果與討論

2.1 響應面法優(yōu)化超高壓鈍化酶結果

實驗實施方案及結果如表2所示。

2.2 POD回歸方程模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert8.0.6軟件對實驗結果進行分析,得到POD殘留活性(Y1)與超高壓處理壓力(X1)、超高壓處理時間(X2)、傳熱介質溫度(X3)因素在編碼空間的二次多元回歸方程為:Y1(%)=-74.7229+1.145672X1-0.92984X2-0.27557X3+0.0128X1X2+0.004569X1X3+0.069787X2X3-0.00184X12-0.2913X22-0.0651X32

表3 POD回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)of regression model of POD

注:“**”表示極顯著(p<0.0001),“*”表示顯著(0.0001

表2 實驗設計與結果Table 2 Experimental results for response surface analysis

由F值可見,F3>F1>F2,3個因素對酶的殘留活性影響主次順序為溫度>壓力>時間。F13>F12>F23,壓力和溫度的交互作用最大,對酶的活性影響最明顯。

圖1 各因素交互作用對POD酶活性 殘留率影響的響應面圖Fig.1 Response surface graphs showing the interactive effect of POD activation

從圖1a～圖1c可以看出各參數(shù)之間的相互作用及對POD殘留活性的影響。如圖所示,若曲線越陡峭,則表明該因素對POD殘留活性的影響越大,相應表現(xiàn)為響應值變化的大小。從圖可以看出超高壓溫度對POD殘留活性的影響最大,壓力次之,時間的影響最小。表3回歸分析結果也與此相吻合。當溫度和壓力一定時,隨著時間的增加,POD殘留活性呈現(xiàn)下降的趨勢;當超高壓處理時間和壓力一定時,在溫度為大于22 ℃時,POD的酶殘留活性呈大幅度下降趨勢。在溫度與時間不變時,在壓力為300～400 MPa范圍內,POD酶出現(xiàn)被激活現(xiàn)象。低壓下酶的構象沒有太大變化或失去活力;壓力促進酶從附著狀態(tài)中解離出來,提高了酶的活性;此外藍莓汁中尚存勻漿機未破碎細胞,在壓力作用下細胞膜被損壞或改變了膜的通透性,使細胞內部的過氧化物酶泄露出來,也會導致酶活性升高[23-24]。

表4 PPO回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of regression model of PPO

注:“**”表示極顯著(p<0.0001),“*”表示顯著(0.0001

2.3 PPO回歸方程模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert8.0.6軟件對實驗結果進行分析,得到PPO殘留活性(Y1)與超高壓處理壓力(X1)、超高壓處理時間(X2)、傳熱介質溫度(X3)因素在編碼空間的二次多元回歸方程為:Y2(%)=19.3957+0.31162X1-6.01009X2+1.112519X3-0.00531X1X2-0.00075X1X3+0.211097X2X3-0.00031X12+0.012546X22-0.05449X32

根據回歸方程繪圖(圖2a～圖2b),它們直觀描述了X1、X2、X3及三個因素之間交互作用對PPO殘留活性的影響。由圖:壓力對PPO殘留活性的影響不明顯,隨著溫度的增加,PPO殘留活性出現(xiàn)一定幅度地減少,升溫會弱化酶蛋白的一些氫鍵、疏水鍵、離子鍵和靜電相互作用高壓增強這種弱化作用的效果,使酶的三維構象受到破壞,加速多酚氧化酶的失活[15,22]。但相較溫度,時間對PPO殘留活性的影響較大。尤其是10～15 min范圍內,PPO殘留活性出現(xiàn)急劇下降。由表4中可見,X1X3的F=1.63,故不考慮壓力和時間的交互作用對PPO殘留活性的影響。

圖2 各因素交互作用對PPO酶活性殘留率影響的響應面圖Fig.2 Response surface graphs showing the interactive effect of PPO activation

2.4 超高壓鈍化POD和PPO的工藝優(yōu)化與驗證

采用Design-expert 8.0.6進行優(yōu)化設計,目標值為POD、PPO酶殘留活性及兩種酶殘留活性之和最低,結果如表5所示,每組設平行實驗三組。

表5 優(yōu)化實驗及結果Table 5 Optimization experiment and result

驗證實驗測得,考慮儀器設備及實際操作情況,在將最優(yōu)處理條件設置為壓力500 MPa、時間5 min和溫度40 ℃時,POD的酶殘留活性降至49.13%,與預測值相差0.2%;在處理條件為壓力500 MPa、時間15 min和溫度10 ℃時,PPO的酶殘留活性降至4.776%,與預測值相差0.08%;綜合考慮，在處理條件為壓力500 MPa、處理時間15 min及溫度10 ℃處理藍莓汁時,鈍化酶效果最佳，此時，POD殘留活性79.459%，PPO殘留活性7.239%。因此采用超高壓處理,優(yōu)化結果準確可靠,符合生產實踐實際。

3 結論

采用超高壓處理技術鈍化藍莓汁中過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO),以超高壓處理的壓力、時間和溫度為自變量,以兩種酶的殘留活性為響應值,通過回歸分析,建立的回歸方程模型極顯著,失擬性不顯著。R2分別為0.9957和0.9917皆小于1。說明回歸方程與實驗結果擬合性很好。

根據方差分析結果和響應面圖可知,在超高壓處理壓力為300～500 MPa、時間為5～15 min及溫度在10～40 ℃的條件下,對POD的酶殘留活性影響主次順序為溫度>壓力>時間。對PPO的酶殘留活性影響主次順序為時間>溫度>壓力。

利用Design-Expert8.0.6軟件優(yōu)化回歸方程確定鈍化過氧化物酶(POD)最佳處理條件為:處理壓力500 MPa、時間5 min和溫度40 ℃,處理后酶的殘留活性降至49.13%;鈍化多酚氧化酶(PPO)最佳處理條件為:處理壓力500 MPa、時間15 min和溫度10 ℃,處理后酶的殘留活性降至4.776%;鈍化兩種酶殘留活性的最佳處理條件為:處理壓力500 MPa、時間15 min和溫度10 ℃。

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Optimization of ultra-high pressure conditions for inactivation of two enzymes in blueberry juice by response surface methodology

LI Xing-he1,ZHU Jin-yan1,2,MENG Xian-jun1,*

(1.Food College of Shen Yang Agriculture University,Shenyang 110161,China;2.Food Inspection Monitoring Center of Zhuanghe,Dalian 116400,China)

Inordertogettheoptimumprocessparametersthatinactivatetheenzymesactivitiesinblueberryjuiceduringultra-highpressuretreatment,activitiesofperoxidase(POD)andpolyphenoloxidase(PPO)weretakenastheresponsevalues.AccordingtotheprincipleofCentral-Compositeexperimentdesign,themathematicalmodelofenzymeresidualactivitiesandpressure,timeandtemperaturewereestablished.Design-Expert8.0.6wasusedforresponsesurfaceanalysis.TheresultsshowedthattheoptimumconditionsforinactivatingPODwere:pressure500MPa,time5minandtemperature40 ℃,afterprocessingusingtheseconditions,theresidualactivitiesofPODwas49.13%,theoptimumconditionsforinactivatingPPOwere:pressure500MPa,time15minandtemperature10 ℃,undertheseconditions,theresidualactivitiesofPPOwas4.776%.Additionally,blueberryjuicewastreatedundertheconditionsofpressure500MPa,time15min,andtemperature10 ℃,thepassivationeffectofPODandPPOwasoptimum.

peroxidase;polyphenoloxidase;ultra-highpressure;responsesurfacemethod;blueberryjuice

2016-05-12

李星賀(1992-)，女，碩士，研究生，研究方向：小漿果深加工關鍵技術，E-mail：syaulxh@163.com。

*通訊作者:孟憲軍(1960-)，男，博士，教授，研究方向：小漿果深加工關鍵技術，E-mail：mengxjsy@126.com。

農業(yè)部公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303073)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)21-0269-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.043