劉 棟,胡亞民,劉洪吉,朱振軍,李全陽(yáng),*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004;2.山東省泰安市第一中學(xué),山東泰安 271000)

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羅伊氏乳桿菌LT018高密度培養(yǎng)生長(zhǎng)因素的研究

劉 棟1,胡亞民2,劉洪吉1,朱振軍1,李全陽(yáng)1,*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004;2.山東省泰安市第一中學(xué),山東泰安 271000)

羅伊氏乳桿菌LT018是經(jīng)過(guò)篩選的源自巴馬百歲老人糞便中的優(yōu)良益生菌株。為優(yōu)化出適合其高密度生長(zhǎng)的培養(yǎng)基,本研究以TPY為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,采用單因素方法確定增值培養(yǎng)基的成分為胰蛋白胨、酵母粉、麥芽糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、西紅柿汁和L-半胱氨酸。采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法得出胰蛋白胨、檸檬酸和L-半胱氨酸對(duì)菌株LT018的生長(zhǎng)影響顯著,繼而進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn),通過(guò)RSM 確定顯著因子的最優(yōu)組合為:胰蛋白胨含量12.13 g/L,檸檬酸0.4 g/L,L-半胱氨酸0.6 g/L。在上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,利用單因素方法確定培養(yǎng)最佳條件為:接種量為4%,溫度為37 ℃,初始pH為7.0,靜置培養(yǎng)。此時(shí)該菌株的活菌數(shù)可達(dá)到7.13×1010cfu/mL,是未優(yōu)化前的10.7倍。

羅伊氏乳桿菌,高密度培養(yǎng),優(yōu)化,培養(yǎng)基成分,響應(yīng)面法

近年來(lái),隨著人們健康意識(shí)的逐漸增強(qiáng),益生菌及其制品已成為人們爭(zhēng)相研究的熱點(diǎn),也是以后食品開發(fā)的重點(diǎn)[1],但益生菌自身特殊的生長(zhǎng)條件,對(duì)其進(jìn)入市場(chǎng)的益生菌的成活率有一定的影響[2]。我國(guó)許多大型乳品企業(yè)都采用國(guó)外進(jìn)口的先進(jìn)設(shè)備,其生產(chǎn)易行、質(zhì)量穩(wěn)定,但生產(chǎn)成本較高[3-5],為適應(yīng)市場(chǎng)需求,不僅要提高益生菌的活菌數(shù),還要降低成本,因此,高密度培養(yǎng)是益生菌制備的關(guān)鍵技術(shù)[6-8]。

羅伊氏乳桿菌作為一種常見(jiàn)的益生菌,是人體腸道中重要的微生物,與人的身體健康息息相關(guān)[9]。同時(shí)它也是我國(guó)允許應(yīng)用于保健食品的菌株。對(duì)人體消化道中有益、中性和有害微生物之間的平衡都有很好的益生功能[10-13]。本研究的羅伊氏乳桿菌LT018分離自巴馬128歲老人糞便樣品,是一株來(lái)源明晰、特性鮮明,且具有多種潛在益生功能的菌株,具有較強(qiáng)的耐受模擬胃腸液、粘附繁殖及抑菌能力[14],為了展現(xiàn)出其價(jià)值,需要將其大量生產(chǎn)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品。

將益生菌進(jìn)行高密度培養(yǎng),是其能應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)際的關(guān)鍵[15]。高密度培養(yǎng)可以縮小培養(yǎng)體積,簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝,減少設(shè)備投資,降低生產(chǎn)成本,縮短生長(zhǎng)周期,從而提高其在生產(chǎn)過(guò)程中的競(jìng)爭(zhēng)力[16]。國(guó)內(nèi)外對(duì)乳桿菌的高密度培養(yǎng)都十分重視,如對(duì)唾液乳桿菌[17]、德式乳桿菌[18]、植物乳桿菌[19]、干酪乳桿菌[20]、嗜酸乳桿菌[21]、枯草芽孢桿菌[22]等培養(yǎng)方面做了大量的研究,但對(duì)羅伊式乳桿菌的研究較少,王志林等[23]采用恒定pH分批培養(yǎng)方式高密度培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌,最終發(fā)酵液中細(xì)胞密度達(dá) 3.1×109CFU/mL,Krauter等[24]采用補(bǔ)料分批發(fā)酵方式培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌,生物量比分批培養(yǎng)增加1倍。本文擬對(duì)影響羅伊氏乳桿菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境條件進(jìn)行研究,以TPY為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過(guò)添加不同因素對(duì)比篩選出最適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件,盡可能提高菌體的活菌數(shù),為益生菌食品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:羅伊氏乳桿菌(LactobacillusreuteriLT018),由本實(shí)驗(yàn)室提供。

TPY培養(yǎng)基:酪蛋白10 g,大豆蛋白胨5 g,酵母粉2 g,葡萄糖5 g,L-半胱氨酸0.5 g,K2HPO42 g,MgCl20.5 g,ZnSO40.25 g,CaCl20.15 g,FeCl30.001 g,吐溫80 1 g,蒸餾水1 L,pH6.5,121 ℃滅菌20 min。

TPY固體培養(yǎng)基:在TPY液體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂,用于羅伊氏乳桿菌的活化和平板活菌計(jì)數(shù)。

增殖培養(yǎng)基:按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配方配制,121 ℃滅菌20 min。

葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白、酵母粉、檸檬酸銨、吐溫80、L-半胱氨酸 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;黃瓜、西紅柿和胡蘿卜 廣西大學(xué)西菜市場(chǎng)。

MQD-B3R三層疊加式組合搖床 上海旻泉儀器有限公司;HR2826榨汁機(jī) 飛利浦集團(tuán);ZHTY-50F型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;BL310電子天平 Sartorius公司;LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 羅伊氏乳桿菌LT018經(jīng)TPY固體培養(yǎng)基活化傳代兩次,挑取單菌落至TPY液態(tài)培養(yǎng)基中(50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶),根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以設(shè)定的接種量接種至所設(shè)置培養(yǎng)基中,在設(shè)定的條件下培養(yǎng)后,測(cè)定其活菌數(shù)。

1.2.2 活菌數(shù)測(cè)定 10倍梯度稀釋培養(yǎng)后的發(fā)酵液,取100 μL最高梯度稀釋液涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,計(jì)數(shù)。

1.2.3 培養(yǎng)基成分確定 以TPY培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,固定除碳源以外的因素,選擇葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油和可溶性淀粉6種碳源分別加入培養(yǎng)基中,培養(yǎng)后測(cè)定活菌數(shù),分析不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響,并確定最佳碳源。同理,確定氮源(酵母粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨和檸檬酸銨)、緩沖鹽(KH2PO4-NaOH、Na2HPO4-NaH2PO4、Na2HPO4-KH2PO4、Na2HPO4-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉、檸檬酸鈉-乙酸鈉-K2HPO4)及生長(zhǎng)因子(西紅柿汁、胡蘿卜汁、黃瓜汁、吐溫80和L-半胱氨酸)。其中,生長(zhǎng)因子中汁類制備如下:取新鮮蔬菜100 g,切碎加入適量蒸餾水煮沸10 min后,移入榨汁機(jī)中反復(fù)榨汁,紗布過(guò)濾,定容到200 mL。

1.2.4 培養(yǎng)基成分優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了獲得能夠顯著影響羅伊氏乳桿菌LT018生長(zhǎng)的因素。將確定的培養(yǎng)成分:胰蛋白胨(A)、酵母粉(B)、麥芽糖(C)、檸檬酸(D)、檸檬酸鈉(E)、西紅柿汁(F)和L-半胱氨酸(G)等7個(gè)因素作為考察對(duì)象。采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[25],以羅伊氏乳桿菌的活菌數(shù)為響應(yīng)值,篩選出影響因素。

1.2.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的回歸系數(shù),來(lái)決定顯著因素的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)[26]的方向和梯度,從而確定實(shí)驗(yàn)因素的中心點(diǎn)。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選各因素及水平Table 1 Screening Factors and levels of Plackett-Burman Design

注:a單位為mL/L。

1.2.4.3 Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)確定的實(shí)驗(yàn)因素和中心點(diǎn),采用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化[27],以獲得響應(yīng)變量與各因素變量關(guān)系的二次多項(xiàng)回歸擬合方程。根據(jù)方程計(jì)算得到羅伊氏乳桿菌LT018最佳增殖培養(yǎng)基配方。

表2 Box-Behnken Design因素水平及編碼Table 2 Factor levels and coding of Box-Behnken Design

圖1 不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)羅伊氏乳桿菌LT018活菌數(shù)的影響Fig.1 Effects of different nutrient substance on the viable cell counts of L.reuteri LT018注:*個(gè)數(shù)不同代表數(shù)據(jù)間有顯著差異(p<0.05)。

1.2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 采用1.2.4.3響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到的增值培養(yǎng)基配方,進(jìn)行羅伊氏乳桿菌LT018培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)果與模型的響應(yīng)預(yù)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比。

1.2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在1.2.4優(yōu)化出的最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,設(shè)定羅伊氏乳桿菌LT018的接種量為1%、2%、3%、4%、5%、6%,培養(yǎng)溫度為23、28、33、37、42 ℃,初始pH為5.6、6.0、6.4、6.7、7.0、7.4,搖床轉(zhuǎn)數(shù)為0、50、100、150、200 r·min-1,通過(guò)對(duì)比培養(yǎng)后羅伊氏乳桿菌LT018的活菌數(shù)大小,確定LT018的最佳培養(yǎng)條件。

1.2.6 對(duì)比實(shí)驗(yàn) 將活化好的菌種液分別接種至初始條件下(接種量:2%,溫度:37 ℃,初始pH:6.5,轉(zhuǎn)速:0 r/min)TPY培養(yǎng)基、初始條件下增殖培養(yǎng)基和1.2.5培養(yǎng)條件下增殖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)后對(duì)比活菌數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用Design Expert8.0.6設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行Plackett-Burman和響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析;采用SPSS v.19.0數(shù)據(jù)軟件和Origin8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分確定

乳酸菌的種類差異,甚至株水平的差異,都會(huì)存在其所需的營(yíng)養(yǎng)成分不同的現(xiàn)象,因此需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。本研究通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的碳源、氮源、緩沖鹽和生長(zhǎng)因子對(duì)活菌數(shù)的影響作用進(jìn)行比較,篩選顯著影響菌株LT018的營(yíng)養(yǎng)成分,結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知,對(duì)羅伊氏乳桿菌LT018生長(zhǎng)有顯著(p<0.05)促進(jìn)作用的碳源是麥芽糖,氮源是胰蛋白胨,緩沖體系是檸檬酸-檸檬酸鈉,生長(zhǎng)因子是西紅柿汁和L-半胱氨酸。菌株的生長(zhǎng)對(duì)氮源的需求比較高,大豆蛋白胨和胰蛋白胨為同一類型氮源,所以綜合考慮選擇胰蛋白胨和酵母粉作為其生長(zhǎng)的復(fù)合氮源。因此,本實(shí)驗(yàn)將羅伊氏乳桿菌LT018的培養(yǎng)基成分選定為:麥芽糖、胰蛋白胨、酵母粉、檸檬酸、檸檬酸鈉、西紅柿汁和L-半胱氨酸。

2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定的培養(yǎng)基成分為因素進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素 對(duì)LT018活菌數(shù)的影響Table 3 Effects of various factors of PB Design on the viable cell counts of LT018

由表3可知,不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平下羅伊氏乳桿菌LT018的活菌數(shù)有一定差異。利用Design Expert軟件對(duì)表3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表3所示。

表4 Pclakett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表Table 4 ANOVA for Plackett-Burman Design

注:*表示在p<0.05水平上,結(jié)果顯著。 由表4可知,胰蛋白胨、淀粉、西紅柿汁和L-半胱氨酸對(duì)活菌數(shù)的影響為正效應(yīng)(回歸系數(shù)皆為正)。即隨著基礎(chǔ)培養(yǎng)基中這四種成分含量的增加,活菌數(shù)呈上升趨勢(shì);其余系數(shù)為負(fù),均為負(fù)效應(yīng)。其中胰蛋白胨、檸檬酸和L-半胱氨酸的p均小于0.05,表明這三種成分顯著影響羅伊氏乳桿菌LT018在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的增殖。則選擇以胰蛋白胨、檸檬酸和L-半胱氨酸這三種成分為主要研究對(duì)象做后續(xù)研究,采用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定三種成分的最佳濃度范圍。

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

依照上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,保持除胰蛋白胨、檸檬酸和L-半胱氨酸以外的水平不變,對(duì)這三種成分進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn),其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Test design and results of the steepest ascent

由表5可知,采用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)可以快速逼近最佳區(qū)域[28],由回歸系數(shù)可知其中與檸檬酸呈負(fù)相關(guān),與胰蛋白胨和L-半胱氨酸呈正相關(guān),所以隨著檸檬酸的含量降低,胰蛋白胨和L-半胱氨酸的含量增高,菌株的活菌數(shù)呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。在3實(shí)驗(yàn)條件(胰蛋白胨:12 g/L;檸檬酸:0.39 g/L;L-半胱氨酸:0.6 g/L)下,活菌數(shù)達(dá)到最大,為6.33×1010cfu/mL,則以此種組合作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.4 Box-Behnken Design響應(yīng)面設(shè)計(jì)

依照2.2和2.3實(shí)驗(yàn)確定的顯著影響因素和實(shí)驗(yàn)因素中心點(diǎn),利用Design Expert軟件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。其各因素水平及編碼見(jiàn)表2,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6,方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Test design and rusults of Box-Behnken

表7 響應(yīng)面二次方模型方差分析Table 7 Analysis of variance table for response surface quadratic model

圖2 各因素交互作用響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plot of interactive effects of various factors

注:**表示在p<0.01水平上,結(jié)果顯著。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二項(xiàng)式回歸擬合,得到羅伊氏乳桿菌LT018活菌數(shù)對(duì)胰蛋白胨、檸檬酸和L-半胱氨酸的二次多項(xiàng)式方程為:

Y(×1010cfu/mL)=64.6+1.29X1+3.54X2-0.42X3-0.92X1X2-0.66X1X3+1.16X2X3-4.01X12-6.51X22-3.76X32

式中:Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值,X1為胰蛋白胨的編碼值,X2為檸檬酸的編碼值,X3為L(zhǎng)-半胱氨酸的編碼值。

由方程可知,二次項(xiàng)系數(shù)估計(jì)值均為負(fù)值,說(shuō)明該模型具有最大值。由方程計(jì)算可得Y的最大估計(jì)值為6.52×1010cfu/mL,此時(shí)胰蛋白胨含量為12.13 g/L,檸檬酸0.4 g/L,L-半胱氨酸0.6 g/L。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

羅伊氏乳桿菌LT018經(jīng)模型預(yù)測(cè)最優(yōu)培養(yǎng)基培養(yǎng)后,進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn),其條件為:胰蛋白胨含量為12.13 g/L,檸檬酸0.4 g/L,L-半胱氨酸0.6 g/L,酵母粉5 g/L,麥芽糖20 g/L,西紅柿汁100 g/L,檸檬酸鈉5.5 g/L。據(jù)此測(cè)得實(shí)際活菌數(shù)為6.43×1010cfu/mL,與響應(yīng)預(yù)測(cè)值擬合率為98.74%,說(shuō)明由回歸方程得到的優(yōu)化培養(yǎng)基各因素參數(shù)準(zhǔn)確可靠,有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化

在LT018優(yōu)化培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)上,對(duì)4種培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如表8所示。

由表8可知,不同接種量、溫度、初始pH對(duì)羅伊氏乳桿菌LT018生長(zhǎng)影響均有差異,其中活菌數(shù)隨接種量、溫度、初始pH增大先升高后降低,隨轉(zhuǎn)速升高顯著降低。據(jù)此選擇培養(yǎng)條件:接種量為4%,溫度為37 ℃,初始pH為7.0,靜置培養(yǎng)。

2.7 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

羅伊氏乳桿菌LT018在初始條件下TPY培養(yǎng)基、初始條件下增殖培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)條件下增殖培養(yǎng)基的活菌數(shù)分別為6.67×109、6.43×1010和7.13×1010cfu/mL,通過(guò)培養(yǎng)基成分優(yōu)化,使活菌數(shù)與在TPY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)相比增大了9.6倍,通過(guò)培養(yǎng)條件的優(yōu)化,又使活菌數(shù)增大了1.1倍,最終與在TPY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)相比共增加10.7倍。目前研究報(bào)道的乳酸桿菌高密度培養(yǎng)結(jié)果普遍較低,如發(fā)酵乳桿菌和唾液桿菌在優(yōu)化碳源氮源生長(zhǎng)因子緩沖鹽等因素經(jīng)過(guò)高密度培養(yǎng)后活菌數(shù)分別達(dá)到8.23×109cfu/mL和5.94×109cfu/mL,較基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別提高了4.78倍和3倍[29-30],但均低于本研究結(jié)果,說(shuō)明本研究高密度培養(yǎng)策略得當(dāng),也凸顯出菌株LT018的快速繁殖潛力,為該菌株今后益生菌產(chǎn)品的開發(fā)提供了重要理論指導(dǎo)。

表8 不同培養(yǎng)條件對(duì)LT018活菌數(shù)的影響Table 8 Effects of different condition of cultivate on the viable cellcounts of LT018

3 結(jié)論

本研究對(duì)羅伊氏乳桿菌LT018進(jìn)行高密度培養(yǎng),通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和Box-Behnken Design響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定培養(yǎng)基為:胰蛋白胨含量為12.13 g/L,檸檬酸0.4 g/L,L-半胱氨酸0.6 g/L,酵母粉5 g/L,麥芽糖20 g/L,西紅柿汁100 mL/L,檸檬酸鈉5.5 g/L。在接種量為4%,溫度為37 ℃,初始pH為7.0的靜置條件下,培養(yǎng)24 h得到菌體濃度為7.13×1010cfu/mL,遠(yuǎn)高于普通培養(yǎng)。

[1]陳洪儀,楊楠. 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2009(06):656-660.

[2]呂兵,張國(guó)農(nóng),楊瑞歡. 嗜酸乳桿菌生物學(xué)特性及其發(fā)酵乳的研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè),2002,30(5):37-39.

[3]Vo T N,Kasper F K,Mikos A G. Strategies for controlled delivery of growth factors and cells for bone regeneration[J]. Advanced Drug Delivery Reviews,2012,64(12):1292-1309.

[4]Burgain J,Gaiani C,Linder M,et al. Encapsulation of probiotic living cells:From laboratory scale to industrial applications[M]. 2011.

[5]Nazzaro F,Orlando P,Fratianni F,et al. Microencapsulation in food science and biotechnology[J]. Current Opinion in Biotechnology,2011,23(2):182-186.

[6]Mohammadi R,Sohrabvandi S,Mortazavian A M. The starter culture characteristics of probiotic microorganisms in fermented milks[J]. Engineering in Life Sciences,2012,12(12):399-409.

[7]Koutinas A A,Papapostolou H,Dimitrellou D,et al. Whey valorisation:A complete and novel technology development for dairy industry starter culture production[J]. Bioresource Technology,2009,100(15):3734-3739.

[8]朱孔亮,吳丹,吳敬. 泡菜發(fā)酵專用短乳桿菌的高密度培養(yǎng)[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2015(08):828-834.

[9]李正華.羅伊氏乳桿菌生物學(xué)特性及功能性發(fā)酵乳的研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2008.

[10]Reid G.Invitrotesting of Lactobacillus acidophilus NCFM as a possible probiotic for the urogenital tract.[J]. International Dairy Journal,2000,10(5-6):415-419.

[11]郭霄,張勇,郭建林,等. II型糖尿病與腸道菌群及益生菌的相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 2013,41(8):48-51.

[12]Reid G. The Scientific Basis for Probiotic Strains of Lactobacillus[J]. Applied and Environmental Microbiology,1999,65(9):3763-3766.

[13]牛生洋,趙瑞香,孫俊良. 嗜酸乳桿菌在現(xiàn)代乳品中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)乳品工業(yè),2005(10):32-35.

[14]朱振軍,黃國(guó)宏,梁曉琳,等. 羅伊氏乳桿菌的益生特性及安全性分析[J]. 現(xiàn)代食品科技,2016(06):1-9.

[15]閆穎娟,盧儉,周劍忠,等. 基于響應(yīng)曲面法的微囊化保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué),2014,35(17):153-159.

[16]Riesenberg D,Guthke R. High-cell-density cultivation of microorganisms.[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,1999,51(4):422-430.

[17]杜新永.產(chǎn)α-半乳糖苷酶唾液乳桿菌XH4B篩選、性質(zhì)、應(yīng)用及高密度培養(yǎng)研究[D]. 杭州：浙江大學(xué),2014.

[18]李言郡,葛紅娟,范恩宇,等. 德氏乳桿菌WHH009高密度培養(yǎng)條件的研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè),2013(05):29-32.

[19]任香蕓,何志剛,林曉姿,等. 植物乳桿菌R23高效增殖條件優(yōu)化[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2015(08):94-100.

[20]胡榴榴.干酪乳桿菌高密度培養(yǎng)及干燥工藝的研究[D]. 揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2014.

[21]劉大為.嗜酸乳桿菌高密度培養(yǎng)及濃縮型發(fā)酵劑研究[D]. 天津:天津科技大學(xué),2010.

[22]羅娟,馬海樂(lè),劉雪姣. 枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵豆粕的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016(08):229-233.

[23]王志林,陳莊,廖玲,等. 豬源羅伊氏乳酸桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及其凍干保護(hù)劑篩選[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(19):151-153.

[24]Krauter H,Willke T,Vorlop K. Production of high amounts of 3-hydroxypropionaldehyde from glycerol by Lactobacillus reuteri with strongly increased biocatalyst lifetime and productivity[J]. New Biotechnology,2012,29(2):211-217.

[25]任亞妮,車振明,金建,等. PB短乳桿菌的培養(yǎng)條件及高密度培養(yǎng)研究[J]. 中國(guó)調(diào)味品,2011(06):48-53.

[26]韓俊華,陳大歡,黃繼翔. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化多粘類芽孢桿菌HT16產(chǎn)生抗菌蛋白的培養(yǎng)基[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(13):262-265,270.

[27]周金雨,龐雪輝,吳桐,等. 1響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌高密度發(fā)酵參數(shù)[J]. 食品工業(yè)科技,2016:1-7.

[28]Dong Z,Gu L,Zhang J,et al. Optimisation for high cell density cultivation of Lactobacillus salivarius BBE 09-18 with response surface methodology[J]. International Dairy Journal,2014,34(2):230-236.

[29]Yu Li W W M Y. Fed-batch process development for high cell density cultivation of Lactobacillus fermentum L1[J]. Journal of Food,Agriculture & Environment,2013,11(2):43-47.

[30]Dong Z,Gu L,Zhang J,et al. Optimisation for high cell density cultivation of Lactobacillus salivarius BBE 09-18 with response surface methodology[J]. International Dairy Journal,2014,34(2):230-236.

Research of growth factors in high cell-density culture ofLactobacillusreuteriLT018

LIU Dong1,HU Ya-min2,LIU Hong-ji1,ZHU Zhen-jun1,LI Quan-yang1，*

(1.College of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China;2.The first secondary school of Tai’an in Shandong Province,Tai’an 271000,China)

Lactobacillus reuteriLT018whichseparatedfromthefaecesofcentenarianslivinginBamaisanexcellentprobiotic.Inordertoachieveitshighcell-densitygrowth,inthisstudy,onthebasisofTPYfermentation,acertainfermentationcomponentsoftheLT018wasdevelopedthroughsinglefactor,whichcouldbeillustratedasfollows:tryptone,yeastpowder,maltsugar,citricacid,sodiumcitrate,tomatojuiceandL-cysteine.ThePlackett-Burmanexperimentwasusedtofindthattryptone,citricacidandL-cysteinehadsignificantimpactonprobiotic’sgrowth,thensteepestascentwasdesignedtoapproachoptimumareafast,andtheresponsesurfaceanalysiswasusedtooptimizethecombinationofsignificantfactor,andtheoptimumconditionsweretryptoneof12.13g/L,citricacidof0.4g/L,L-cysteineof0.6g/L.Underthiscondition,thecultureconditionswasdeterminedasfollows:4%ofinocula,37 ℃,initialpH6.7andstaticallycultured.TheresultshowedthattheviablecountofLT018was7.13×1010cfu/mL,whichwas10.7timesthatofthecountbeforeoptimization.

Lactobacillus reuteri;highcell-densityculture;optimization;mediumcomponents;responsesurfacemethod

2016-05-12

劉棟(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與健康長(zhǎng)壽，E-mail:15578951780@163.com。

*通訊作者:李全陽(yáng)(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與健康長(zhǎng)壽,E-mail:liquanyang@gxu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371762)；乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(SKLDB2013-07)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)21-0144-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.020