羅玉秀，張生萍，許唱唱，馬小崗，杜德志

(青海大學(xué) a 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，b 農(nóng)林科學(xué)院,青海 西寧 810016)

?

特早熟春性甘藍(lán)型油菜sBnFLD基因的克隆及表達(dá)

羅玉秀a，張生萍a，許唱唱a，馬小崗b，杜德志b

(青海大學(xué) a 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，b 農(nóng)林科學(xué)院,青海 西寧 810016)

【目的】 克隆特早熟春性甘藍(lán)型油菜A基因組上的sBnFLD基因，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)研究，為該基因的功能及其在成花轉(zhuǎn)變中的作用研究奠定基礎(chǔ)。【方法】 根據(jù)GenBank中已報(bào)道的擬南芥和白菜型油菜FLD同源基因的保守序列設(shè)計(jì)引物, 采用PCR和RT-PCR 擴(kuò)增特早熟春性甘藍(lán)型油菜86號(hào)品系(光周期不敏感)的FLD同源基因，用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)sBnFLD基因在86號(hào)品系不同發(fā)育時(shí)期莖、葉和莖尖中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】 克隆出了sBnFLD基因，命名為sBnFLD,在GenBank中的登錄號(hào)為KR003079.1。sBnFLD基因cDNA 全長(zhǎng)2 376 bp，有3個(gè)內(nèi)含子，4個(gè)外顯子，編碼791個(gè)氨基酸殘基，分子量86.5 ku，等電點(diǎn)8.5；sBnFLD為非分泌蛋白和非膜蛋白；sBnFLD蛋白N端有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域 α螺旋結(jié)構(gòu)域(SWIRM)和NAD(P)-binding-8結(jié)構(gòu)域，該蛋白有多個(gè)α螺旋和β折疊。生物信息學(xué)分析顯示,sBnFLD蛋白與已報(bào)道的甘藍(lán)型油菜未知蛋白(CDX73929.1)和電子克隆的白菜型油菜FLD(XP_009135110.1)氨基酸序列相似性達(dá)99%, 與擬南芥FLD氨基酸序列相似性達(dá)87%。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，sBnFLD基因在油菜苗期和現(xiàn)蕾初期莖、葉、莖尖中均有表達(dá)，但在蕾期莖尖中表達(dá)量最高?！窘Y(jié)論】 克隆出的sBnFLD基因?yàn)楦仕{(lán)型油菜的FLD同源基因，該基因在春性特早熟甘藍(lán)型油菜開花調(diào)控中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用。

春性甘藍(lán)型油菜；基因克?。籉LD同源基因；開花時(shí)間

開花是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的重要發(fā)育過程。模式植物擬南芥的研究表明，植物開花是在4種途徑(光周期途徑、自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑)內(nèi)源和外源信號(hào)同時(shí)誘導(dǎo)下，多個(gè)特異性基因在時(shí)間和空間上順序表達(dá)的結(jié)果[1]。擬南芥中開花相關(guān)的80多個(gè)基因已被克隆[2-3]。光周期途徑中，晝夜節(jié)律基因收到光受體傳來的信號(hào)后開始表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過激活或抑制光周期基因constans(CO)調(diào)控成花基因Flowering locus T (FT)和suppressor ofoverexpression of constans(SOCI)的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)花分生組織特異基因LFY和AP1的表達(dá),結(jié)果促使擬南芥開花[3]。春化途徑中，低溫誘導(dǎo)vernalizaion(VRN)基因表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物抑制FLC基因，從而上調(diào)SOCI和FT基因在葉片中的表達(dá), 結(jié)果促進(jìn)開花[4]。EMF是主要的開花抑制基因，EMF的抑制作用隨著植物發(fā)育進(jìn)程逐漸降低，當(dāng)降低到一定程度時(shí)莖端分生組織開始分化為花序分生組織，然后成花[5]。赤霉素在非誘導(dǎo)短日照下促進(jìn)開花。自主開花途徑能夠通過感受植物內(nèi)部的發(fā)育狀態(tài)，依靠體內(nèi)各基因間的相互拮抗和協(xié)同作用而使植物到達(dá)一定生長(zhǎng)階段后開花，是對(duì)光周期和春化都不敏感的開花途徑[6-7]。目前，自主途徑相關(guān)的6個(gè)基因FVE、FCA、FPA、FLD、LD和FY在擬南芥中都已被克隆，這些基因可能參與染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾，通過抑制FLC基因的表達(dá)促進(jìn)開花[8-10]。盡管自主途徑在擬南芥中研究很多，但在油料作物油菜中的研究還處于起步階段。

擬南芥FLD基因是自主開花途徑的重要基因之一，該基因在擬南芥中已經(jīng)被分離出來，F(xiàn)LD基因含有2個(gè)外顯子，編碼789個(gè)氨基酸的表觀遺傳因子，對(duì)FLC染色質(zhì)進(jìn)行后期修飾[10]。擬南芥FLD-5突變體具有蓮座葉，開花時(shí)間明顯延遲等表型，可能特異性地與細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[4]。白菜型油菜FLD同源基因僅見電子克隆序列,而甘藍(lán)型油菜FLD同源基因的克隆、生物信息學(xué)分析以及表達(dá)模式研究尚未見報(bào)道。為此，本研究以甘白雜交獲得的特早熟春性甘藍(lán)型油菜86號(hào)為材料，根據(jù)GenBank中已報(bào)道的擬南芥FLD基因和蕓薹屬植物FLD同源基因EST序列設(shè)計(jì)引物，采用同源克隆和RT-PCR相結(jié)合的方法，分離春性甘藍(lán)型油菜FLD同源基因(springB.napusFLD,sBnFLD)，探討其時(shí)空表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其在成花轉(zhuǎn)變中的作用奠定基礎(chǔ)，為篩選、培育早熟油菜新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

研究材料為春性甘藍(lán)型油菜與青藏高原白菜型油菜種間雜交獲得的86號(hào)品系，其表現(xiàn)特早熟，對(duì)光周期和春化不敏感[11]，由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院春油菜研究中心提供。大腸桿菌菌株DH5α、克隆載體pMD18-T、各種內(nèi)切酶、T4連接酶、各試劑盒，均購(gòu)自TaKaRa(大連)公司。所用引物自行設(shè)計(jì)并由上海生工合成。

選取籽粒飽滿的種子種植于人工氣候箱中，設(shè)置溫度為22 ℃/18 ℃(晝/夜)，16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度350 μmol/(m2·s)，相對(duì)濕度為60%。1周澆1次水。苗期(兩葉一心)和蕾期(現(xiàn)蕾初期)取莖、葉和莖尖組織液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1 總 RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 采用TaKaRa公司的RNAiso Reagent試劑盒說明提取油菜幼嫩葉片的總RNA，電泳檢測(cè)后按照First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明合成cDNA第一鏈，置-20 ℃冰箱備用。反轉(zhuǎn)錄條件：將1 μL總RNA，2 μL Oligo(dT)18和24 μL RNA free ddH2O混勻，65 ℃水浴5 min,冰浴30 s，瞬時(shí)離心，然后依次加入8 μL 5×Buffer,2 μL RNA inhibitor，4 μL dNTPs和2 μL M-MVLV，瞬時(shí)離心后在PCR儀上42 ℃孵育60 min,70 ℃滅火10 min。將合成的cDNA置-20 ℃冰箱備用。

1.2.2sBnFLD基因的克隆 (1)sBnFLD基因DNA序列克隆。根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的擬南芥FLD基因(GenBank 登錄號(hào)為AY849996.1和AY849997.1)的核苷酸序列和白菜型油菜FLD同源基因電子克隆序列的保守序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以基因組DNA為模板擴(kuò)增sBnFLD基因的DNA序列。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，10×Buffer 1.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 pmol/L的上下游引物各0.3 μL，rTaq0.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與載體 pMD18-T連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α并過夜培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選后挑取白斑進(jìn)行菌液培養(yǎng)，將鑒定正確的陽性克隆菌液送上海生工測(cè)序。

表 1 本研究所用引物序列

(2)sBnFLD基因cDNA序列克隆。根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的擬南芥FLD基因(AY849996.1 )的編碼區(qū)、分離出的sBnFLD基因組DNA序列以及蕓薹屬植物FLD基因的EST序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以86號(hào)品系蕾期葉片RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得的片段測(cè)序后與GenBank中已公布蕓薹屬植物FLD同源基因的EST進(jìn)行拼接。用TaKaRa公司的RACE試劑盒進(jìn)行3′和5′RACE擴(kuò)增，獲得cDNA全長(zhǎng)序列。反應(yīng)體系為10 μL：包括cDNA模板2 μL，10×Buffer 1.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 pmol/L的上下游引物各0.3 μL，rTaq0.2 μL，ddH2O 4.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物的回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定、測(cè)序等步驟同(1)。

1.2.3sBnFLD基因及編碼蛋白特征分析 將獲得的sBnFLD基因在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行 Blast比對(duì)，用ORF Finder 尋找開放閱讀框；利用 DNAStar 軟件進(jìn)行多重序列比較和氨基酸同源性分析, 產(chǎn)生的多重比對(duì)結(jié)果通過 MEGA4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用在線工具 TMHMM 和 SignalP 分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和預(yù)測(cè)信號(hào)肽; 利用 ExPASy 工具中的 SOPMA 軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在線對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4sBnFLD基因的表達(dá) 分別提取苗期(兩葉一心)和蕾期(現(xiàn)蕾初期)莖、葉和莖尖組織的總RNA，并用RNase-free DNaseⅠ(Promega，USA) 消化處理。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 完整性。用分光光度計(jì)檢測(cè) RNA 純度。按First-Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒說明合成cDNA第一鏈，以反轉(zhuǎn)錄的雙鏈cDNA為模板，根據(jù)分離出的sBnFLD基因cDNA保守序列設(shè)計(jì)特異引物(表1)，以β-actin基因(GenBank登錄號(hào)AF11812)為內(nèi)參，用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)sBnFLD在花芽分化過程中不同組織(莖、葉和莖尖)的表達(dá)水平。具體步驟按TaKaRa一步法熒光定量試劑盒說明進(jìn)行。β-actin引物見表1。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括cDNA模板2 μL，10×Buffer 1.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 pmol/L的上下游引物各0.3 μL，rTaq0.2 μL，ddH2O 4.8 μL。PCR反應(yīng)條件為,94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1sBnFLD基因分離及序列分析

以油菜基因組DNA為模板，用設(shè)計(jì)的基因組DNA擴(kuò)增引物分離出FLD同源基因的DNA片段(圖1)，經(jīng)拼接后獲得2 876 bp的片段，命名為sBnFLD，在GenBank登錄號(hào)為KR003079.1。以cDNA為模板，用擴(kuò)增sBnFLD基因cDNA的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(圖1)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序后與FLD同源基因的EST序列拼接， 獲得了2 376 bp的cDNA全長(zhǎng)序列。sBnFLD基因組DNA序列與cDNA序列比對(duì)結(jié)果表明，該基因有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子。第1個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)83 bp,第2和第3個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)80 bp。第1個(gè)外顯子最長(zhǎng)(1 543 bp)，最后一個(gè)外顯子最短(28 bp)。擴(kuò)增出的sBnFLD基因與GenBank中公布的擬南芥FLD基因(AY849996.1和AY849997.1)相似性達(dá)83%。擬南芥FLD基因只有1個(gè)內(nèi)含子，其內(nèi)含子兩側(cè)的編碼序列與sBnFLD基因的第一個(gè)內(nèi)含子兩側(cè)序列完全一致，但這2個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度不同，序列也沒有同源性。其他植物中未見FLD同源基因DNA序列及其內(nèi)含子的報(bào)道。sBnFLD基因與GenBank中已公布的鹽生植物山萮菜FLD同源基因(XM_006407512.1)、擬南芥賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1基因(NM_111874.4)、桃樹假蛋白基因(XM_007220197.1)、大豆FLD同源基因(EU857407.1)、豌豆FLD同源基因(AY830930.1)和玉米FLD同源基因(NM_001154598.1)相似性分別為87%,85%，75%，75%，77%和69%。說明分離出的sBnFLD是春性甘藍(lán)型油菜的FLD同源基因。

M.DNA分子量標(biāo)記DL2000；1～4.用引物FLD-3F/FLD-3R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；5～8.用cFLD-2F/cFLD-2R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；9～15.用cFLD-1F/cFLD-1R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物

2.2sBnFLD基因氨基酸序列分析

經(jīng)ORF Finder 及GENSCAN 預(yù)測(cè)，sBnFLD基因的CDS區(qū)長(zhǎng)2 376 bp，編碼791個(gè)氨基酸，分子量為86.5 ku，等電點(diǎn)為8.5，命名為sBnFLD。通過SignalP4.0預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)表明，sBnFLD為非分泌蛋白。TMHMM跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果表明，sBnFLD為非膜蛋白。sBnFLD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白N端有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)是由85個(gè)氨基酸殘基組成的α螺旋結(jié)構(gòu)域(SWIRM)，位于第60-146個(gè)氨基酸，參與蛋白質(zhì)互作，很多與染色體相互作用的蛋白都含有SWIRM結(jié)構(gòu)域；另一個(gè)是NAD(P)-binding-8結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域?yàn)榘被崦摎涿傅妮o酶結(jié)合域，位于第170-233個(gè)氨基酸。用SWISS-MODEL網(wǎng)上在線預(yù)測(cè)了sBnFLD的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白有多個(gè)α螺旋和β折疊(圖2)。

圖 2 sBnFLD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

氨基酸相似性比較發(fā)現(xiàn)，sBnFLD蛋白的氨基酸序列與NCBI中已公布的甘藍(lán)型油菜A03染色體上的未知基因(CDX73929.1)和白菜型油菜電子克隆的FLD基因編碼的蛋白(XP_009135110.1)序列相似性很高，與甘藍(lán)型油菜另一個(gè)未知功能蛋白(CDY00667.1)的相似性達(dá)98%，與擬南芥FLD蛋白(AAX51267.1)相似性達(dá)87%，與芝麻、番茄、野草莓、巨桉和煙草的FLD同源蛋白的相似性為75%～86%。證明克隆的sBnFLD基因編碼的蛋白是FLD同源蛋白。說明克隆的sBnFLD基因來源于白菜型油菜A03。進(jìn)一步分析特早熟春性甘藍(lán)型油菜與其他植物預(yù)測(cè)的FLD蛋白的親緣關(guān)系，將不同植物的FLD蛋白氨基酸預(yù)測(cè)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，特早熟春性甘藍(lán)型油菜的 sBnFLD蛋白與蕓薹屬屬于同一亞族，比十字花科其他植物親緣關(guān)系更近，與芝麻親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖 3 sBnFLD氨基酸序列聚類分析

2.3sBnFLD基因在油菜不同組織中的表達(dá)

qRT-PCR分析結(jié)果(圖4)表明，sBnFLD基因在苗期及現(xiàn)蕾初期莖、葉和莖尖中均有表達(dá)。苗期莖尖中表達(dá)量最低，莖中表達(dá)量最高；現(xiàn)蕾初期葉片中表達(dá)量最低，莖尖中表達(dá)量最高。從苗期到現(xiàn)蕾初期的過渡中，莖和葉中的表達(dá)量降低，而莖尖中的表達(dá)量激增。說明sBnFLD基因在開花控制中起重要作用。

圖 4 sBnFLD基因在油菜不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

FLD基因是擬南芥中分離出的自主開花途徑的重要基因，其他植物中對(duì)FLD同源基因的克隆及表達(dá)方面的研究很少[12-14]。本研究采用同源克隆技術(shù)，以特早熟甘藍(lán)型油菜86號(hào)品系為研究材料，分離出了春性甘藍(lán)型油菜sBnFLD基因的基因組DNA和cDNA全長(zhǎng)序列，并且確定了其內(nèi)含子和外顯子序列。已公布的擬南芥FLD基因只有一個(gè)內(nèi)含子，該內(nèi)含子與克隆的sBnFLD基因的第一個(gè)內(nèi)含子序列沒有同源性，但他們的兩側(cè)編碼序列相同。

氨基酸序列分析結(jié)果表明，克隆的春性甘藍(lán)型油菜sBnFLD基因的cDNA具有完整的編碼框，所編碼的蛋白與GenBank中公布的擬南芥FLD、甘藍(lán)型油菜未知功能蛋白(CDX73929.1)以及電子克隆的白菜型油菜FLD同源蛋白(XP_009135110.1)具有極高的相似性，證明了所克隆基因的準(zhǔn)確性。GenBank中注冊(cè)的未知蛋白XP_009135110.1可能為甘藍(lán)型油菜FLD同源蛋白。

開花機(jī)理的研究結(jié)果表明，自主開花基因編碼調(diào)節(jié)蛋白[15-20]。擬南芥FLD基因編碼一個(gè)與人的組蛋白賴氨酸去甲基化酶1(LSD1)同源的蛋白，參與組蛋白的去甲基化和去乙?；ㄟ^抑制FLC基因促進(jìn)開花[21-22]。本研究克隆的sBnFLD蛋白含有一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域(SWIRM)，含有SWIRM結(jié)構(gòu)域的蛋白參加蛋白互作，很多與染色體相互作用的蛋白都含有SWIRM結(jié)構(gòu)域，是LSD1家族的成員[23]。然而，除了SWIRM結(jié)構(gòu)域外，sBnFLD蛋白還含有一個(gè)擬南芥FLD中所沒有的NAD(P)-binding-8結(jié)構(gòu)域。NAD(P)-binding Rossmann-like domain結(jié)構(gòu)域有一個(gè)α-β-α螺旋結(jié)構(gòu)，隸屬于Rossmann折疊大家族的成員，作用原理是以輔酶DND(P)作為輔助因子，催化氨基酸脫氫形成酮酸。

自主開花途徑基因(FVE、FCA、FPA、FLD、LD和FY)的表達(dá)不依賴環(huán)境條件，彼此之間互不調(diào)控基因mRNA水平的表達(dá)，在植物的各個(gè)器官中平行表達(dá)[17,19,24-25]。FLD基因在擬南芥幾乎所有組織中表達(dá)，但在莖尖中的表達(dá)水平最高[26]。大豆GmFLD基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在大豆所有組織中都能檢測(cè)到，但該基因在真葉和莖尖中的表達(dá)量非常低[12]。春性特早熟甘藍(lán)型油菜sBnFLD基因在油菜各器官中均有表達(dá)，但在蕾期莖尖中的表達(dá)量最高。這與擬南芥中的研究報(bào)道一致。說明sBnFLD基因在特早熟春性甘藍(lán)型油菜開花調(diào)控中起著十分重要的作用。通過對(duì)春性甘藍(lán)型油菜自主開花途徑重要基因sBnFLD的研究，有助于理解其在植物開花乃至其生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，為闡明植物開花分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

開花在高等植物中是一個(gè)重要的生理過程，從春性特早熟甘藍(lán)型油菜86號(hào)品系中分離出的sBnFLD基因是擬南芥FLD同源基因，sBnFLD基因cDNA全長(zhǎng)2 376 bp，編碼由791個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白。該基因可能通過染色質(zhì)修飾對(duì)油菜開花起著重要的調(diào)節(jié)作用。

[1] Xu L,Jia F F,Wang L L.Progresses on molecular mechanisms of flowering transition inArabidopsis[J].Acta Bot Boreal,2011,31(5):1057-1065.

[2] Krizek B A,Fletcher J C.Molecular mechanisms of flower development:an armchair guide [J].Nat Rev Gene,2005,6(9):688-698.

[3] Jackson S D.Plant responses to photoperiod [J].New Phytol,2009,181(3):517-531.

[4] Reeves P H,Muetas G,Dash S.Early in short days 4,a mutation inArabidopsisthat causes early flowering and reduces the mRNA abundance of the floral repress orFLC[J].Development,2002,129(23):5349-5361.

[5] Sangmin L,Hyo J L,Jae H J,et al.TheArabidopsisthalianaRNA-binding protein FCA regulates thermotolerance by modulating the detoxification of reactive oxygen species [J].New Phytol,2015,205(2):555-569.

[6] Hayama R,Coupland G.Shedding light on the circadian clock and the photoperiodic control of flowering [J].Curr Opin Plant Biol,2003,6(1):13-19.

[7] Laurian S Robert,Frances Robson,Andrew Sharpe,et al.Conserved structure and function of theArabidopsisflowering time gene CONSTANS inBrassicanapus[J].Plant Molecular Biology,1998,37:763-772.

[8] Quesada V,Macknigh T R,Dean C.Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controlsArabidopsisflowering time [J].EMBO J,2003,22(12):3142-3152.

[9] Schomburg F M,Patton D A,Meinke D W.FPA,a gene involved in floral induction inArabidopsisencodes a protein containing RNA-Recognition motifs [J].Plant Cell,2001,13(6):1427-1436.

[10] Chen R Q,Zhang S Z,Sun S L,et al.Characterization of a new mutant allele of theArabidopsisFlowering Locus D (FLD) gene that controls the flowering time by repressing FLC [J].Chinese Science Bulletin,2005,50(23):2701-2706.

[11] Luo Y X,Luo C Y,Du D Z,et al.Quantitative trait analysis of flowering time in spring rapeseed (B.napusL.) [J].Euphytica,2014,200:321-335.

[12] Hu Q,Jin Y,Shi H Z，et al.GmFLD,a soybean homolog of the autonomous pathway geneFLOWERINGLOCUSD,promotes flowering inArabidopsisthaliana[J].BMC Plant Biology,2014,14:263-274.

[13] Chalhoub B,Denoeud F,Liu S Y，et al.Early allopolyploid evolution in the post-NeolithicBrassicanapusoilseed genome [J].Science,2014,345:950-953.

[14] Werner J D,Borevitz J O,Liu S Y,et al.FRIGIDA-Independent variation in flowering time of naturalArabidopsisthalianaaccessions [J].Genetics,2005,170:1197-1207.

[15] Aravind L,Iyer L M.The SWIRM domain:a conserved module found in chromosomal proteins points to novel chromatin-modifying activities [J].Genome Biol,2002,3(8):11-29.

[16] Fan C M,Hu R B,Zhang X M,et al.Conserved CO-FT regulons contribute to the photoperiod flowering control in soybean [J].BMC Plant Biology,2014,14(9):1-14.

[17] Macknight R,Duroux M,Laurie R,et al.Functional significance of the alternative transcript processing of theArabidopsisfloral promoter FCA [J].The Plant Cell,2002，14:877-888.

[18] He Y H,Michaels S D,Amasino R M.Regulation of flowering time by histone acetylation [J].Science,2003,302:1751-1754.

[19] Nocker S V,Muszynski M,Briggs K，et al.Characterization of a gene fromZeamaysrelated to theArabidopsisflowering-time gene Luminidependens [J].Plant Molecular Biology，2000,44:107-122.

[20] Ji H T,Zhu Y Y,Tian S,et al.Down regulation of leaf flavin content induces early flowering and photoperiod gene expression inArabidopsis[J].BMC Plant Biology,2014,14:237-241.

[21] Mouhu K,Hyt?nen T,Folta K,et al.Identification of flowering genes in strawberry,a perennial SD plant [J].BMC Plant Biology,2009,9:122.

[22] Singh V,Roy S,Singh D,et al.Arabidopsisflowering locus D influences systemic-acquire dresistance-induced expression and histone modifications of WRKY genes [J].J Biosci,2014,39:119-126.

[23] Yang J,Yan R,Roy A,et al.The I-Tasser suite:protein structure and function prediction [J].Nature Methods,2015,12:7-8.

[24] Sun X M,Qin Q P,Zhang J,et al.Isolation and characterization of theFVEgene of a doritaenopsis hybrid involved in the regulation of flowering [J].Plant Growth Regulation，2012,68:77-86.

[25] Aubert D,Chen L J,Moon Y H,et al.EMF1,a novel protein involved in the control of the shoot architecture and flowering inArabidopsis[J].Plant Cell,2001,13:1865-1875.

[26] Kobayashi Y,Kaya H,Goto K,et al.A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals [J].Science，1999，286：1960-1962.

Cloning and expression ofsBnFLDgene from spring rapeseed (BrassicanapusL.)

LUO Yuxiua,ZHANG Shengpinga,XU Changchanga,MA Xiaogangb,DU Dezhib

(aCollegeofEco-EnvironmentalEngineering,bQinghaiAcademyofAgricultureandForestry,QinghaiUniversity,Qinghai,Xining810016,China)

【Objective】 The research clonedsBnFLDgene and analyzed its expression.【Method】 The primers were designed according to conversed sequence of publishedFLDinArabidopsisandB.rapa.Homologues cloning and reverse transcription PCR (RT-PCR) were applied to clone the gene and analyze its expression.【Result】 TheFLDhomologue gene was cloned inB.napusand namedsBnFLD(accession No.KR003079.1).The CDS sequence ofsBnFLDwas 2 376 bp,containing 3 introns and 4 exons,and encoding a protein of 791 amino acid residues with a predicted molecular weight of 86.5 ku and a theoretical pI of 8.5.sBnFLD was nerther secreted protein nor non-membrane protein.N-terminal of sBnFLD had two conserved domains,SWIRM and NAD(P)-binding-8.sBnFLD is a instability protein composed with alpha helix and beta folding.Bioinformatics analysis showed that the sBnFLD had 99% similarity with unknown protein CDX73929.1 inB.napusand prediction protein XP_009135110.1 inB.rapa,and had 87% similarity with FLD inA.thaliana.The expression analysis ofsBnFLDgene using qRT-PCR showed that thesBnFLDgene was expression in stem,seeding and shoot tips at seeding and bud stage.However,the relative expression level of the gene was the highest in shoot tips at bud stage.【Conclusion】 As homologous gene ofFLD,sBnFLDmight play a role in flowering regulation.

spring rape (BrassicanapusL.);gene cloning;FLDhomologue;flowering time

時(shí)間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.013

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.026.html

2015-05-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360345)；青海省科技廳項(xiàng)目(2016-ZJ-787)；國(guó)家“863計(jì)劃”項(xiàng)目(2011AA10A104)；科技部科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD01B05-3)

羅玉秀(1969-)，女，青海民和人，教授，博士，主要從事油菜遺傳育種研究。E-mail:lyxiu2@163.com

杜德志(1964-)，男，江西吉安人，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事油菜遺傳育種研究。

S565.4

A

1671-9387(2016)11-0090-07