周 勇，范玉頂，黃莉莉，曾憲輝，張雪萍，張琳琳，曾令兵

(1 中國水產(chǎn)科學研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢430223；2 湖州師范學院 浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室，浙江 湖州 313000；3 華中農(nóng)業(yè)大學 水產(chǎn)學院，湖北 武漢4300701；4 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

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青魚γ-干擾素基因的克隆與表達分析

周 勇1,2,3，范玉頂1，黃莉莉4，曾憲輝4，張雪萍3，張琳琳3，曾令兵1

(1 中國水產(chǎn)科學研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢430223；2 湖州師范學院 浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室，浙江 湖州 313000；3 華中農(nóng)業(yè)大學 水產(chǎn)學院，湖北 武漢4300701；4 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

【目的】 開展青魚γ-干擾素(IFN-γ)基因的克隆、結(jié)構(gòu)特征與表達譜分析研究。【方法】 采用cDNA末端快速擴增技術(shù)獲得了青魚(Mylopharyngodonpiceus)IFN-γ基因cDNA的5′和3′末端序列，然后根據(jù)其末端序列設(shè)計特異性引物，擴增得到青魚IFN-γ基因cDNA全長序列，對其序列和編碼氨基酸序列進行生物信息學、同源性比較及系統(tǒng)進化樹分析，同時對其在青魚各組織中的表達進行分析。通過構(gòu)建真核表達載體，將其轉(zhuǎn)染青魚鰭條組織細胞進行表達分析?！窘Y(jié)果】 青魚IFN-γcDNA全長為895 bp，其開放閱讀框大小為549 bp，編碼182個氨基酸。氨基酸序列比對分析結(jié)果顯示，青魚IFN-γ與人、雞、鼠IFN-γ的序列相似性僅為1.5%～7.7%，與其他魚類IFN-γ序列相似性較高，為16.3%～92.9%。青魚IFN-γ分子N末端包含1個信號肽序列、C末端有IFN-γ特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)。青魚IFN-γ蛋白二級結(jié)構(gòu)與高等脊椎動物IFN-γ類似，包含7個α螺旋結(jié)構(gòu)。經(jīng)Poly I:C誘導后發(fā)現(xiàn)，IFN-γ在青魚頭腎、腎、脾、皮膚和鰓組織中表達顯著上調(diào)，最高的為頭腎，其次為脾、皮膚、鰓和腎，而在心臟和腦組織中無顯著變化。青魚γ-干擾素真核表達質(zhì)粒在青魚鰭條組織細胞中成功表達IFN-γ。【結(jié)論】 成功克隆了青魚IFN-γ基因cDNA，經(jīng)Poly I:C誘導后，該基因在頭腎中上調(diào)倍數(shù)最為顯著，青魚γ-干擾素在體外獲得表達。

青魚；IFN-γ基因；結(jié)構(gòu)特征；表達分析

干擾素(IFN)是一類能夠誘導脊椎動物細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白的分泌型細胞因子，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種[1]。其中，Ⅱ型干擾素即γ-干擾素(INF-γ)，主要由NK細胞產(chǎn)生，也可由單核吞噬細胞及抗原提呈細胞分泌的IL-12和IL-18刺激T淋巴細胞產(chǎn)生[2-4]。IFN-γ能誘導巨噬細胞產(chǎn)生毒性物質(zhì)或促使宿主細胞合成大量抗病毒蛋白，還可介導白細胞聚集、調(diào)節(jié)T細胞增殖和分化、增強抗原提呈，從而使機體呈現(xiàn)抗病毒狀態(tài)[4]。

IFN-γ基因已在斑馬魚[5]、鯉魚[6]、虹鱒[7]、斑點叉尾鮰[8]、大西洋鮭[9]、金魚[10]、斜帶石斑魚[11]、河豚魚[12]等多種魚類中克隆得到。魚類與哺乳動物的IFN-γ基因同源性較低，但其在調(diào)節(jié)免疫應答和抗病毒等方面的作用與哺乳動物一致[13]。作為一種高效的非特異性免疫因子，INF-γ在魚類的抗病毒感染免疫中發(fā)揮重要作用[6-12]。青魚(Mylopharyngodonpiceus)屬于鯉科魚類，主要分布于我國長江以南的平原地區(qū)，是我國淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”之一。但是，隨著養(yǎng)殖范圍、規(guī)模、密度的不斷擴大，青魚病害問題頻繁發(fā)生，制約了青魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。迄今為止，尚未見有關(guān)青魚IFN-γ編碼序列、結(jié)構(gòu)特征和表達譜分析等的研究報道。因此，開展青魚抗病相關(guān)基因及蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)特征與表達譜研究，對于青魚健康養(yǎng)殖具有重要的理論意義和應用價值。本研究進行了青魚IFN-γ基因的克隆、結(jié)構(gòu)特征與表達譜分析，旨在為進一步研究青魚IFN-γ在抗病毒感染防御中的功能與調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗魚與細胞系 青魚質(zhì)量約100克/尾，購自武漢某養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)在實驗室 100 cm×50 cm×60 cm水族箱中， 1 周后用于試驗。青魚鰭條組織細胞系(BC-Fin)置于含體積分數(shù)15%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液中，25 ℃下培養(yǎng)，由長江流域水生動物疫病重點實驗室建立并保存。

1.1.2 試 劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒SMART PCR cDNA Synthesis Kit和SMARTer RACE cDNA Amplification kit為Clontech公司產(chǎn)品；Dnase Ⅰ、測序載體pMD19-T、大腸桿菌菌株DH5α以及用于PCR擴增的TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs、DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)為 Life Technologies公司產(chǎn)品；各種限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒為OMEGA Bio-Tek公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 為Invitrogen公司產(chǎn)品；鼠抗His標簽抗體為Abcam公司產(chǎn)品；免疫熒光染色試劑盒(抗鼠Cy3)為碧云天公司產(chǎn)品。

1.2 總RNA提取及青魚IFN-γ基因cDNA的擴增

無菌條件下取青魚腎臟組織10 g，利用Trizol法提取總RNA。將提取的總RNA用Dnase Ⅰ于37 ℃下處理30 min后回收產(chǎn)物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒SMART PCR cDNA Synthesis Kit說明書，反轉(zhuǎn)錄擴增獲得青魚IFN-γ基因cDNA 第一鏈。

1.3 青魚IFN-γ基因的克隆

根據(jù)已知硬骨魚類IFN-γ序列設(shè)計簡并引物(表1)，擴增得到青魚IFN-γ基因部分片段，反應體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，cDNA 5 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，引物JB1-F和JB1-R(10 mmol/L)各1 μL，ddH2O 14.8 μL。再按SMARTer RACE cDNA Amplification kit要求，分別設(shè)計正、反向第一次擴增，反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，運行5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 45 s，運行5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，運行27個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將外引物(NUP,RACE1-3F/RACE1-5R)PCR產(chǎn)物用無菌水稀釋50倍后，取1 μL稀釋液作為內(nèi)引物(NUP,RACE2-3F/RACE2-5R)PCR反應的模板，進行第二次PCR擴增，反應體系為：10×Advantage 2 PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL， 50×二聚合酶混合物1 μL，NUP(10 mmol/L)1 μL，引物RACE2-3F和RACE2-5R(10 mmol/L)各1 μL，模板1 μL，ddH2O 40 μL。反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，運行35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。根據(jù)巢式PCR所得到的IFN-γ3′和5′端基因序列設(shè)計引物，擴增青魚IFN-γcDNA。反應結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測，回收產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

表 1 本試驗所用引物序列

1.4 青魚IFN-γ基因序列分析

利用NCBI的BLAST軟件對青魚IFN-γ基因及氨基酸序列進行同源性比較；用SignalP和PSIRED軟件對其編碼蛋白進行信號肽預測及二級結(jié)構(gòu)分析；用Clustal W和MEGA軟件對氨基酸序列進行多重比對及系統(tǒng)進化分析。

1.5 青魚IFN-γ基因的表達譜分析

取試驗魚20尾，平均分為試驗組和對照組，試驗組每尾魚腹腔注射500 μL(2.5 mg)Poly I:C，對照組每尾魚腹腔注射DPBS 500 μL。24 h后分別取試驗組和對照組青魚的腦、鰓、心、頭腎、腎、脾和皮膚組織，提取各組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄擴增為cDNA。根據(jù)青魚IFN-γ基因序列合成熒光定量PCR引物JC-F和JC-R(表1)，以β-actin作為內(nèi)參基因。將目的基因擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后于16 ℃與pMD19-T載體連接1 h，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞并擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用分光光度計測定質(zhì)粒濃度，計算重組質(zhì)粒的DNA拷貝數(shù)。質(zhì)粒經(jīng)10倍梯度稀釋后，作為標準模板進行熒光定量PCR擴增，制作標準曲線。在熒光定量PCR儀(Rotor-Gene 6000,Qiagen)上進行擴增，反應程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，63 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)，反應結(jié)束后繪制標準曲線。根據(jù)各組織樣品的Ct值計算IFN-γ和β-actin 基因的拷貝數(shù)，并以β-actin基因拷貝數(shù)為準對目的基因拷貝數(shù)進行歸一化處理。

1.6 青魚IFN-γ真核表達載體的構(gòu)建

利用引物M.IFNγ-F/M.IFNγ-R(表1)擴增帶有EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ 酶切位點的青魚IFN-γ開放閱讀框，設(shè)計引物時在IFN-γ上游ATG前加上kozak序列(GCCACC)，除去IFN-γ終止密碼，并在3′末端加上6×His標簽進行融合表達。雙酶切后將目的片段連接到真核表達載體pcDNA3.1(+)上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，PCR篩選陽性克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后，命名為pcDNA3.1(+)-IFN-γ，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.7 pcDNA3.1(+)-IFN-γ在青魚鰭條細胞中的表達分析

通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將真核表達載體pcDNA3.1(+)-IFN-γ轉(zhuǎn)染到青魚鰭條細胞(BC-Fin)中，同時設(shè)置空質(zhì)粒對照。將轉(zhuǎn)染后的細胞置于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)染后24，48，72，96和120 h分別取出一瓶細胞，用His抗體(Abcam)作為一抗，紅色熒光探針標記的羊抗鼠IgG(H+L)抗體為二抗，參照免疫熒光染色試劑盒說明對轉(zhuǎn)染后的細胞進行間接熒光免疫檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 青魚IFN-γ基因結(jié)構(gòu)特征

青魚IFN-γ基因cDNA(GenBank 登錄號：KP257568)全長為895 bp(圖 1)，其開放閱讀框大小為549 bp，編碼一個含有182個氨基酸的蛋白，其5′和3′端分別有138，208 bp的非編碼區(qū)。

2.2 青魚IFN-γ氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征及比對分析

將青魚IFN-γ與部分高等脊椎動物和魚類的IFN-γ氨基酸序列進行相似性比對，結(jié)果(表2)顯示，青魚IFN-γ與高等脊椎動物IFN-γ氨基酸序列相似性僅為1.5%～7.7%，而與魚類IFN-γ的相似性為16.3%～92.9%，其中與草魚(C.idella)IFN-γ的相似性最高，為92.9%。

下劃線標示起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)

表 2 青魚與12個其他物種IFN-γ氨基酸序列的同源性(右上角)和差異性(左下角)

注：1～13分別為青魚、金魚、鯉魚、草魚、斑馬魚、斑點叉尾鮰、雞、人、露斯塔野鯪、虹鱒、黑青斑河鲀、鼠、紅鰭東方鲀的IFN-γ氨基酸序列。

Note:1-13 are IFN-γ amino acid sequences ofMylopharyngodonpiceus(KP257568),Carassiusauratus(ACG68885.1),Cyprinuscarpio(1 CAJ51088.1),Ctenopharyngodonidella(2 JX196701.1),Daniorerio(NP_998029.1),Ictaluruspunctatus(1 NP_001187231.1),chicken (NP_990480.1),human (AAX42631.1),Labeorohita(HQ667144.1),Oncorhynchusmykiss(NP_001153975.1),Tetraodonnigroviridis(CAF95605.1),mouse (NP_03063.1),Takifugurubripes(CAE82301.2).

青魚IFN-γ蛋白二級結(jié)構(gòu)包含7個α螺旋結(jié)構(gòu)，N端存在1個信號肽序列(MTAQHMMAIFWGVCLLILRRMTYA)，而C末端存在IFN-γ家族的特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)(圖2)。利用MEGA軟件構(gòu)建的硬骨魚類IFN-γ蛋白序列進化系統(tǒng)發(fā)育樹表明，青魚IFN-γ與草魚(C.idella)IFN-γ聚為一支(圖3)。

相似的氨基酸用“.”和“:”表示，信號肽序列用下劃線表示，保守的α-螺旋結(jié)構(gòu)以序列上方加黑線表示，IFN-γ特征序列以陰影表示，核定位序列用黑框表示

2.3 青魚IFN-γ基因的組織表達譜

青魚注射Poly I:C后，采用熒光定量PCR法檢測IFN-γ的表達譜，結(jié)果見圖4。如圖4所示，Poly I:C能誘導青魚頭腎、脾、皮膚、鰓和腎組織中的IFN-γ表達顯著上調(diào)，IFN-γ表達量分別為對照組的25，22，18，13和9倍，且以頭腎中的上調(diào)變化最為顯著，而心臟和腦組織中無顯著變化。

圖 3 硬骨魚類IFN-γ蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

*表示與對照組差異顯著(P<0.05)

2.4IFN-γ在青魚鰭條組織細胞中的表達

將真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ轉(zhuǎn)染青魚鰭條細胞，在24，48，72，96和120 h分別取出一瓶細胞，利用His抗體作為一抗，進行間接熒光免疫檢測。結(jié)果(圖5)表明，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的青魚鰭條細胞24 h后在綠光激發(fā)下有鮮艷的紅色出現(xiàn)，并且隨著細胞培養(yǎng)時間的延長，紅色熒光數(shù)量增多，72 h紅色熒光數(shù)量最多；而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的青魚鰭條細胞則沒有紅色熒光出現(xiàn)。

3 討 論

本研究從青魚腎臟組織中克隆得到了IFN-γ基因cDNA全長序列，該基因編碼的氨基酸序列與草魚、鯉魚和鯽魚的IFN-γ氨基酸序列有很高的相似性，這是由于它們均屬于鯉科魚類，有較近的親緣關(guān)系。青魚IFN-γ蛋白二級結(jié)構(gòu)包含7個α螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中全部肽鍵都可以形成氫鍵，故有助于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[14]。此外，青魚IFN-γ N端的信號肽可指導其跨膜轉(zhuǎn)移、C末端存在的核定位基序有助于IFN-γ進入細胞核，最終使得信號轉(zhuǎn)導過程順利完成[7,15]。青魚及其他硬骨魚類的IFN-γ中都包含這段基序，推測這段基序?qū)τ谟补囚~類IFN-γ的功能是至關(guān)重要的。

對哺乳動物的研究表明，經(jīng)抗原刺激后可致巨噬細胞、NK細胞、Th1細胞以及與抗原提呈相關(guān)的細胞產(chǎn)生IFN-γ[16-18]。硬骨魚類的巨噬細胞和淋巴細胞主要存在于頭腎和脾臟中。斑馬魚、虹鱒、大西洋鱈魚經(jīng)Poly I:C誘導后，其免疫器官中IFN-γ的表達水平都會顯著升高，尤其頭腎組織中IFN-γ的表達水平上調(diào)最明顯[7,12-13]。而斑點叉尾鮰在受到外來抗原物質(zhì)刺激后，其外周血淋巴細胞中的IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)[19]。本研究中青魚腹腔注射Poly I:C后，頭腎、脾臟等魚類主要免疫器官中IFN-γ的表達量顯著上調(diào)，表明脊椎動物IFN-γ的細胞來源及功能在進化歷程中有較高的保守性。

A.白光下的青魚鰭條細胞；B，C，D，F(xiàn)，G，H.熒光顯微鏡下pcDNA3.1(+)-IFN-γ轉(zhuǎn)染24，48，48，72，96和120 h后的細胞；E.熒光顯微鏡下空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細胞。標尺 100 μm

為方便體外開展青魚IFN-γ功能研究，本研究選擇使用真核表達系統(tǒng)在青魚鰭條細胞系中表達IFN-γ。設(shè)計引物時，在IFN-γ上游ATG前加上kozak序列(GCCACC)，同時在終止密碼子(TAG)前加上6×His基因(CATCATCATCATCATCAT)，以增強基因的融合表達，便于對蛋白表達情況進行檢測。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ轉(zhuǎn)染青魚鰭條細胞后，用表達的融合蛋白與鼠抗His標簽抗體雜交，再與帶有熒光Cy3標記的抗體雜交，在綠光激發(fā)下觀察細胞呈鮮紅色，說明IFN-γ在青魚鰭條細胞中被正確表達。本研究結(jié)果為進一步探討青魚IFN-γ的時序表達特征及其抗感染防御機制奠定了基礎(chǔ)。

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Clone and expression of interferon gamma (IFN-γ) in black carp,Mylopharyngodonpiceus

ZHOU Yong1,2,3,FAN Yuding1,HUANG Lili4,ZENG Xianhui4,ZHANG Xueping3,ZHANG Linlin3,ZENG Lingbing1

(1YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheryScience,Wuhan，Hubei430223,China; 2ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofAquaticDevelopment,HuzhouNormalUniversity,Huzhou,Zhejiang313000,China; 3CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei430070,China; 4CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

【Objective】 This study cloned black carp (Mylopharyngodonpiceus)IFN-γgene and analyzed its structural features and expression profiles.【Method】 Using cDNA RACE,the 5′ and 3′ terminal sequences ofIFN-γgene cDNA were obtained from black carp.Then,the specific primers were designed and the full length ofIFN-γcDNA of black carp was cloned.The nucleic acid sequence and its coded amino acid sequence were analyzed by bioinformatics,homology comparison,phylogenetic tree,and expression profiles.Finally,the eukaryotic expression vector of the IFN-γ gene was transfected into black carp fin cells for expressioninvitro.【Result】 TheIFN-γcDNA sequence consisted of 549 bp,encoding a putative protein of 182 amino acids. This IFN-γ was only 1.5%-7.7% similar to its counterparts in higher vertebrates and 16.3%-92.9% similar to those in other teleost fish. Sequence analysis revealed that the black carp IFN-γ contained the typical IFN-γ motif ([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V]) and a conserved nuclear localization site (RRRR) in the C-terminal end and displayed seven alpha-helix structures similar to mammalian IFN-γ.The expression ofIFN-γincreased in the kidney,spleen,gills,head kidney,and skin after the poly I:C stimulation.TheIFN-γgene was cloned into the pcDNA3.1 (+) eukaryotic expression vector and expressed in black carp fin cells.【Conclusion】 The black carpIFN-γcDNA was successfully cloned.The expression ofIFN-γwas significantly increased in kidney after poly I:C stimulation andIFN-γgene was expressedinvitro.

Mylopharyngodonpiceus;IFN-γgene;molecular characterization;expression profile

時間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.007

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.014.html

2015-05-19

國家“大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項”(CARS-46-11)；浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室開放基金項目(SS201403)

周 勇(1984-)，男，湖北荊州人，助理研究員，碩士，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究。E-mail:zhouy@yfi.ac.cn

曾令兵(1962-)，男，湖北仙桃人，研究員，博士，博士生導師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究。E-mail:zlb@yfi.ac.cn

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1671-9387(2016)11-0047-08