楊顯超，吳秀娟，李凱航，楊德全，鞠厚斌，葛菲菲，王　建（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上?！?01103）

液相芯片技術(shù)同時(shí)檢測(cè)六種豬繁殖障礙病毒的方法研究

楊顯超，吳秀娟，李凱航，楊德全，鞠厚斌，葛菲菲，王建
（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海201103）

在GenBank中收集豬細(xì)小病毒（PPV）結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的ORF2序列、豬偽狂犬病毒（PRV）的gB基因、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的NSP2基因、豬瘟病毒（CSFV）的E2基因和乙型腦炎病毒（JEV）的M基因，利用Primer 5.0等分子生物學(xué)軟件對(duì)收集的序列分析比較，篩選出上述基因的特異保守序列并設(shè)計(jì)引物和探針，將設(shè)計(jì)好的探針與相應(yīng)的微球偶聯(lián)，優(yōu)化條件，建立檢測(cè)方法。結(jié)果表明：建立的檢測(cè)PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV 6種病毒核酸的多重液相芯片技術(shù)具有較好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性，對(duì)PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV 6種病毒核酸的最低檢出量分別為8.50×102copies/μL、2.87×102copies /μL、2.07×102copies /μL、2.61×102copies/μL、2.34×102copies/μL、2.05×102copies /μL，與相應(yīng)病毒 PCR/RT-PCR 檢測(cè)方法相比，敏感性提高了 100～1 000倍；對(duì)臨床388份樣品同步進(jìn)行熒光PCR與液相芯片檢測(cè)，結(jié)果99.87%相符。本方法為液相芯片技術(shù)在動(dòng)物多病毒快速高通量檢測(cè)、鑒別診斷等應(yīng)用方面奠定了基礎(chǔ)。

液相芯片技術(shù)；豬繁殖障礙病毒；檢測(cè)方法

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化發(fā)展，豬繁殖障礙疫病已成為大中型豬場(chǎng)最重要的疫病之一。在引起豬繁殖障礙的諸多病原中，豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和日本腦炎病毒（JEV）是較為常見的RNA病毒，豬圓環(huán)病毒 2 型（PCV-2）、豬細(xì)小病毒（PPV）和豬偽狂犬病毒（PRV）被認(rèn)為是引起母豬繁殖障礙性疾病的重要DNA病毒。而且近年來豬繁殖障礙病呈現(xiàn)混合感染的特點(diǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前疾病病原檢測(cè)主要以 PCR 和免疫學(xué)方法為基礎(chǔ)，但往往其樣本檢測(cè)通量和并行處理能力有限，且在臨床鑒別中需要快速、高通量的檢測(cè)技術(shù)。液相芯片技術(shù)（xMAP）是一種被用于高通量臨床診斷的新型生物芯片技術(shù)。它是一項(xiàng)突破性的生物芯片分子檢測(cè)新技術(shù)，具有高通量、靈敏度高、重復(fù)性好、靈活性大的特點(diǎn)[1-2]。美國食品藥品管理局（FDA）已批準(zhǔn)其用于臨床的高通量檢測(cè)。它在各種應(yīng)用中的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的ELISA結(jié)果基本一致，但有著ELISA無法比擬的優(yōu)越性。

鑒于 PPV、PCV-2、PRV、CSFV、PRRSV、JEV均可直接或間接引起豬群的繁殖障礙及呼吸系統(tǒng)疾病且具有較為相似的臨床癥狀，同時(shí)6種病毒中的2～3 種混合感染的病例較為常見。本研究以 PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、JEV 為研究對(duì)象，針對(duì)這6種病毒保守性基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過優(yōu)化條件，構(gòu)建同時(shí)檢測(cè)這6種病毒的兩組三重xMAP 檢測(cè)方法，并初步應(yīng)用于臨床實(shí)踐，為豬群病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷提供技術(shù)支持，為豬病的快速高通量鑒別診斷搭建新技術(shù)平臺(tái)，并為 xMAP技術(shù)在多種動(dòng)物病毒快速高通量檢測(cè)、鑒別診斷等應(yīng)用方面奠定基礎(chǔ)[3]。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株來源。本研究中所使用的豬瘟病毒HCV-2012-03、豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV-2010-04、豬細(xì)小病毒NADL-2、豬乙腦病毒SA14-14-2 、豬偽狂犬病毒PRV-2013-01和豬圓環(huán)病毒PCV-2013-03毒株均由本實(shí)驗(yàn)室保存，并通過純化、測(cè)序進(jìn)行鑒定和分型。試驗(yàn)中用來驗(yàn)證該方法的樣本均來自本實(shí)驗(yàn)室采集的實(shí)際樣本，并且經(jīng)過Real-Time PCR方法驗(yàn)證。

1.1.2儀器設(shè)備。Luminex?200TM液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)（Luminex公司，美國）；精密電子天平BP221S（梅特勒-托利多公司）；電熱培養(yǎng)箱MIR162型（三洋公司）；漩渦震蕩器IKA? MS 3 basic（購自IKA公司）；離心濃縮機(jī)GenespeedX1（Gene公司）；超聲波清洗機(jī)BRANSON（BRANSON公司）。

1.1.3 主 要 試 劑。Micro AMP? Fast Reaction Tubes、藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素（SAPE）購自美國Life公司；Magplex-TAG微球#19、#43、#53和#67（2.5×106beads/mL） 由Luminex公司 提供；MagPure Viral RNA Kit for MagMax ExPRVess核酸提取試劑盒由美吉公司提供；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit 由Takara公司提供；Premix Taq? Version 2.0、DL2000 DNA Maker、pMD-19-T Simple Vector 、一步法RT-PCR試劑盒、特異引物由寶生物（大連）工程公司合成。實(shí)驗(yàn)用去離子水和其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1引物與探針的設(shè)計(jì)與合成。在GenBank中收集PPV 結(jié)構(gòu)蛋白VP2 基因、PCV2的ORF2序列、PRV的gB基因、PRRSV 的 NSP2基因、CSFV 的E2基因序列和JEV的M基因，利用Primer 5.0等分子生物學(xué)軟件對(duì)收集的序列分析比較，篩選出上述基因的特異保守序列并設(shè)計(jì)引物和探針。由于這部分工作申請(qǐng)了專利，所以引物和探針序列暫不在本論文中公布，申請(qǐng)?zhí)柣驅(qū)＠?hào)為：201610578516.3。引物和探針?biāo)蚑akara公司合成，下游引物的 5′端標(biāo)記生物素，探針 5′C12 端用氨基標(biāo)記，探針的反向互補(bǔ)序列的 5′端標(biāo)記生物素，全部 HPLC 純化。寡核苷酸探針用超純水稀釋成工作濃度 20 pmol/L，引物用超純水稀釋成 20 pmol/L貯存液，均-20 ℃保存。

1.2.2核酸 DNA/RNA 制備。對(duì)單一的 PPV、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV和JEV細(xì)胞培養(yǎng)物，PPV、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV和JEV混合物（等體積的 PPV、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV和JEV細(xì)胞培養(yǎng)物的混合），以及處理的臨床樣品上清液中未知病毒的核酸，采用 MagPure Viral RNA Kit for MagMax ExPRVess核酸提取試劑盒（美吉公司）提取核酸，然后用Nano-drop 微量分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行濃度測(cè)定。樣本在96孔板A孔中加入5 μL蛋白酶K溶液、5 μL磁珠、90 μL裂解液和50 μL待檢樣品或?qū)φ?；在孔B中加入150 μL洗液，在孔C和D中各加入150 μL去鹽液，孔H中加入50 μL滅菌去離子水；把裝好樣品和試劑的96孔板和洗脫條放到儀器中，啟動(dòng)程序；程序結(jié)束后，取出洗脫條，貼上封口膜，直接用于檢測(cè)，或置-70 ℃保存。

1.2.3兩組三重PCR擴(kuò)增

1.2.3.1PPV、PCV2、PRV三重PCR檢測(cè)方法的建立。按照PRVemix Taq? Version2.0試劑盒推薦的反應(yīng)體系和程序，建立PPV、PCV2、PRV三重PCR檢測(cè)方法。通過退火溫度及循環(huán)條件的優(yōu)化，使PPV、PCV2和PRV均得到最大量的擴(kuò)增，初步建立三重?cái)U(kuò)增體系。反應(yīng)結(jié)束后，留5 μL產(chǎn)物用于xMAP雜交。三重PCR按以下反應(yīng)程序進(jìn)行：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。用優(yōu)化了的三重 PCR 反應(yīng)體系和條件，對(duì)PPV、PCV2、PRV、AIV（禽流感病毒）、NDV（新城疫病毒）、TGEV（傳染性胃腸炎病毒）、SIV（豬流感病毒）、PEDV（豬流行性腹瀉病毒）核酸及 PPV、 PCV2、PRV混合核酸等模板進(jìn)行三重 PCR 特異性試驗(yàn)，同時(shí)用 PPV、PCV2、PRV不同濃度稀釋的核酸做三重 PCR 敏感性試驗(yàn)。

1.2.3.2PRRSV、CSFV、JEV三重RT-PCR 檢測(cè)方法的建立。按照 PRVimeScript?One Step RTPCR Kit Ver.2 試劑盒推薦的反應(yīng)體系和程序，參照1.2.3.1建立 PRRSV、CSFV和JEV三重RTPCR 檢測(cè)方法。三重PCR按以下反應(yīng)程序進(jìn)行：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃45 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。優(yōu)化三重 RTPCR 反應(yīng)體系和條件，并對(duì) PRRSV、CSFV（豬瘟病毒）、JEV、AIV、NDV、FMDV（口蹄疫病毒）、SIV、PEDV及PRRSV、CSFV、JEV 混合核酸等模板進(jìn)行三重 RT-PCR 特異性試驗(yàn)，同時(shí)用PRRSV、CSFV及JEV不同濃度稀釋的核酸做三重 RT-PCR 敏感性試驗(yàn)。

1.2.4液相芯片的雜交及Luminex檢測(cè)。選擇探針偶聯(lián)的微球組合（P1-PPV-#19、P2-PCV2-#43、P3-PRV-#53、P4-CSFV-#43、P5-PRRSV-#67、P6-JEV-#53），以漩渦振蕩器渦旋偶聯(lián)好的 beads 40 s。雜交操作步驟如下：在100 μL PCR反應(yīng)管中加23 μL 1×TMAC 雜交 buffer，加每種 beads mix 各1 μL，冰上保存?zhèn)溆茫ú豢衫鋬觯?。再? μL 的三重 PCR 產(chǎn)物，向孔中加入70 μL SAPE報(bào)告混合液（溶劑為 1×TMAC，濃度為 8 μg/mL），充分混勻后再用塑封膜蓋上反應(yīng)板，40 ℃雜交溫度孵育 40 min。孵育完后直接上Luminex 200 System（儀器 Heater 提前預(yù)熱至雜交溫度）檢測(cè)，讀取檢測(cè)結(jié)果并分析。液相芯片雜交結(jié)果定性判定標(biāo)準(zhǔn)：樣品檢測(cè)時(shí)，當(dāng)陽性與陰性的 MFI比值≥3 時(shí)，試驗(yàn)成立，QC等于MFI樣本與陰性對(duì)照（N-control）的比值，即QC=MFI樣本/ N-control。當(dāng) MFI 樣本≥300，且 QC≥3，判為陽性樣本；否則，皆為陰性樣本[4]。

1.2.5液相芯片體系的優(yōu)化

1.2.5.1雜交溫度的優(yōu)化。雜交反應(yīng)時(shí)間在40 min條件下，根據(jù)探針的Tm值，選定34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃等6個(gè)溫度梯度為研究對(duì)象，考察不同雜交溫度下液相芯片的檢測(cè)效果。

1.2.5.2液相芯片檢測(cè)體系靈敏度。將病毒質(zhì)粒核酸作梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為101、102、103、104、105、106、107和108。稀釋后作為PCR擴(kuò)增模板，用PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增后于建立的液相芯片檢測(cè)體系中進(jìn)行檢測(cè)，

1.2.5.3液相芯片檢測(cè)體系特異性。提取已知的AIV、NDV、TGEV、SIV、PEDV病毒核酸樣品（診斷中心保存），樣品的基因組DNA（提取RNA轉(zhuǎn)化為cDNA）作為PCR擴(kuò)增模板，用PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增后，于建立的液相芯片檢測(cè)體系中進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5.4液相芯片檢測(cè)體系重復(fù)性。將提取的臨床樣品核酸，作為PCR擴(kuò)增模板，用PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增后，于建立的液相芯片檢測(cè)體系中進(jìn)行檢測(cè)3次，觀察檢測(cè)體系的重復(fù)性。

1.2.5.5液相芯片檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)。臨床樣品來自上海市嘉定2個(gè)豬場(chǎng)、浦東6個(gè)豬場(chǎng)和上海光明某豬場(chǎng)共計(jì)9個(gè)豬場(chǎng)388份母豬臍帶血樣品，由本單位疫情測(cè)報(bào)科提供。用建立的兩組三重液相芯片體系對(duì)提取的388份臨床樣品核酸進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)用Real-time 熒光PCR方法和普通PCR進(jìn)行檢測(cè)，來對(duì)方法進(jìn)行比較評(píng)估。參照1.2.2的方法，對(duì) 388頭份臨床樣本在96孔板A孔中加入5 μL蛋白酶K溶液、5 μL磁珠、90 μL裂解液和50 μL待檢樣品或?qū)φ?；在孔B中加入150 μL洗液，在孔C和D中各加入150 μL去鹽液，孔H中加入50 μL滅菌去離子水；把裝好樣品和試劑的96孔板和洗脫條放到儀器中，啟動(dòng)程序；程序結(jié)束后，取出洗脫條，貼上封口膜，直接用于檢測(cè)，或置-70 ℃保存。

2　結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

6種病毒核酸均擴(kuò)增出預(yù)期大?。≒PV，254 bp；PCV2，506 bp；PRV，843 bp；CSFV，627 bp；PRRSV，404 bp；JEV，375 bp）的特異性條帶，引物與各模板之間不存在非特異性擴(kuò)增（圖1）。

25 μL 體系中采用不同的退火溫度（52～60 ℃）進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，多重PCR在不同的退火溫度下都可以有較好的擴(kuò)增效果（圖2～3），試驗(yàn)最終選擇DNA擴(kuò)增體系退火溫度56 ℃，RNA擴(kuò)增體系退火溫度52 ℃。

圖1　PCV、PPV、PRV電泳結(jié)果

圖2　PCV、PPV、PRV三重PCR退火溫度的確定

圖3　PRRSV、JEV、CSFV多重PCR退火溫度的確定

核酸初始濃度測(cè)定結(jié)果：PPV模板為7 ng/μL，PCV2模板為7.04 ng/μL，PRV模板為2.5 ng/μL，CSFV模板為6.02 ng/μL，PRRSV模板為5.04 ng/μL，JEV模板為1.5 ng/μL。將其進(jìn)行10-1～10-8稀釋后，在25 μL體系中進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，PCR電泳結(jié)果如圖4所示。

圖4　多重PCR靈敏度的確定

以上結(jié)果表明：在25 μL體系中，能同時(shí)檢測(cè)出PPV、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、JEV的濃度為10-5ng/μL，其最低檢測(cè)濃度分別為4.25×10-6ng/μL、4.5×10-6ng/μL、1.3×10-6ng/μL、3.5×10-6ng/ μL、3.1×10-6ng/μL和8.23×10-5ng/μL。據(jù)濃度基因拷貝數(shù)換算公式計(jì)算得最低檢測(cè)基因拷貝數(shù)分別為1.53×106copies/μL、1.58×106copies/μL、4×105copies/μL、1.73×106copies/μL、1.68×106copies/μL和6.4×105copies/μL。

2.2雜交溫度的優(yōu)化

雜交反應(yīng)時(shí)間在40 min條件下，選定6個(gè)溫度梯度為研究對(duì)象，考察不同雜交溫度下液相芯片的檢測(cè)效果（表1）。平均熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高平緩上升；當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，平均熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值；當(dāng)孵育溫度達(dá)到44 ℃時(shí)，平均熒光強(qiáng)度下降。參考相關(guān)文獻(xiàn)，將40 ℃作為最佳反應(yīng)溫度進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。

表1　液相芯片檢測(cè)體系的梯度雜交溫度優(yōu)化試驗(yàn)

2.3液相芯片檢測(cè)體系靈敏度

PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV和 JEV兩組三重 xMAP 敏感性檢測(cè)結(jié)果見表2。按照 MFI樣本≥300，QC≥3 的標(biāo)準(zhǔn)，在25 μL 體系中，PPV、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV和JEV檢測(cè)的敏感性分別到10-6，PN值均大于3。根據(jù)濃度基因拷貝數(shù)換算公式計(jì)算得PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV等6種病毒核酸的最低檢出量分別為8.50×102copies/μL、2.87×102copies/ μL、2.07×102copies/μL、2.61×102copies /μL、2.34×102copies /μL、2.05×102copies /μL。

表2　液相芯片體系的敏感性結(jié)果

2.4液相芯片檢測(cè)體系特異性

PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV和JEV兩組三重 xMAP 特異性檢測(cè)結(jié)果見表3。由PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV和JEV兩 組 三 重xMAP 特異性檢測(cè)結(jié)果可知：PN PPV=1 752/45≈39，PN PCV2=1 985/45≈44，PN PRV=2 263/35≈65，PN PRRSV=2 014/34≈59，PN CSFV=1 878/35≈54，PN JEV=1 765/44≈40，MFI N-control、AIV、NDV、TGEV和PEDV均小于 300，PN 值均大于 3，故該xMAP 檢測(cè)體系特異性良好。

表3　液相芯片的特異性結(jié)果

2.5液相芯片檢測(cè)體系重復(fù)性

對(duì) PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV等 兩組PCR 特異性產(chǎn)物進(jìn)行的 3 次重復(fù)試驗(yàn)表明，3次檢測(cè)報(bào)告判定的定性結(jié)果100%一致，說明該檢測(cè)方法的重復(fù)穩(wěn)定性良好。

2.6臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)用建立的液相芯片檢測(cè)體系檢測(cè)臨床樣品388份，共計(jì)2 328份次，檢測(cè)出陽性樣品10份，并同時(shí)用Real-time 熒光PCR方法和普通PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，陽性樣品7份，重復(fù)率為99.87%（2 325/2 328），詳細(xì)情況見表4。

表4　臨床樣品檢測(cè)詳細(xì)結(jié)果

3　討論

PCV2、PPV、PRV、CSFV、PRRSV 和 JEV是常見的引起豬呼吸與繁殖障礙的病毒，常呈混合感染。本研究針對(duì)6種病毒的保守基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了同時(shí)檢測(cè)這6種病毒的多重 PCR 方法。Ogawa等建立了檢測(cè) PCV2、PPV、PRV DNA病毒的多重 PCR 方法及 PRRSV、JEV、PEDV、PoRV-A、TGEV、GETV等6種 RNA 病毒的多重RT-PCR 方法，但用于臨床檢測(cè)時(shí)，需將待檢病料分為兩份提取 DNA 和 RNA。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法，可同時(shí)提取病毒DNA 和 RNA進(jìn)行快速檢測(cè)，彌補(bǔ)了前者的不足。

設(shè)計(jì)出最優(yōu)的引物探針是xMAP技術(shù)成功的關(guān)鍵之一。引物設(shè)計(jì)時(shí)，首先應(yīng)該避免生物素化的特異性下游引物與特異性寡核苷酸探針之間二聚體的存在。因?yàn)樘结樑c目標(biāo)靶核酸雜交檢測(cè)過程中，該二聚體一定程度上相當(dāng)于雜交體，當(dāng)加入SAPE，也會(huì)激發(fā)熒光信號(hào)，產(chǎn)生很高的陰性背景熒光，直接影響雜交結(jié)果的判定，甚至致使雜交檢測(cè)失敗。

設(shè)計(jì)最佳的引物探針組合時(shí)，選擇合適的軟件很重要。Tim等[5]建議使用Beacon Designer軟件。該軟件傳統(tǒng)上被用來為實(shí)時(shí)熒光定量PCR設(shè)計(jì)引物和探針，使用該軟件設(shè)計(jì)出的多重引物探針組合，最大程度地減少特異性探針與非特異性引物（體系中的其他擴(kuò)增引物）之間的二聚體，提高多重PCR和多重xMAP的成功率。Tim還指出，篩選出的引物探針組合中，探針比引物的Tm最好高4～6 ℃。對(duì)設(shè)計(jì)出的引物探針，最后還需進(jìn)行PRVimer blast或nucleotide blast，在理論上保證PCR擴(kuò)增出來特異性的目標(biāo)雜交序列和探針靶向雜交序列的特異性。

目前對(duì) xMAP 結(jié)果的判定缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。不同研究者使用的檢測(cè)系統(tǒng)可能略有不同，但都是基于 Luminex xMAP 技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)。本研究參照以上研究者的研究經(jīng)驗(yàn)，約定本實(shí)驗(yàn)研究的可信標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)MFI樣本≥300，且QC≥（3QC=MFI樣本/N-control），同時(shí)滿足這兩個(gè)條件時(shí)，判為陽性樣本；否則，皆為陰性樣本。

與其他研究者的經(jīng)驗(yàn)探討。Seok等[6]在多基因分型試驗(yàn)中應(yīng)用的雜交緩沖液是1×Tm Hybridization Buffer [0.2 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris（pH8.0），0.08% Triton X-100]，而研究者Ashley等在xMAP核酸定量建模分析中指出，雜交緩沖液用TMAC最好。在探針靶核酸雜交后，TMAC可以使之持續(xù)產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)，并且一定程度上能降低雜交的背景熒光值。所以，本研究直接采用了TMAC作為雜交緩沖液。

Douglas等[7]在其細(xì)菌標(biāo)記溯源研究中，并沒有使用生物素標(biāo)記引物來使靶核酸生物素化，而是在PCR擴(kuò)增完后，通過乙醇沉淀DNA再進(jìn)行的靶核酸的生物素標(biāo)記。該法的優(yōu)點(diǎn)在于能降低試驗(yàn)花費(fèi)，還能去除掉可能對(duì)雜交信號(hào)有影響的引物序列。但是，通過沉淀DNA再進(jìn)行標(biāo)記PCR產(chǎn)物，存在DNA沉淀率低、沉淀不完全、靶核酸損失的問題，還在一定程度上影響了液相芯片檢測(cè)的敏感性，甚至造成假陰性的檢測(cè)結(jié)果。多數(shù)研究者采用引物標(biāo)記生物素法來標(biāo)記PCR產(chǎn)物。

Johanna[8]的研究暗示，隨著芯片檢測(cè)通量的提高，檢測(cè)敏感性會(huì)有不同程度的下降。液相蛋白芯片如此，液相核酸芯片也存在此類問題。為了提高敏感性，建議以后的研究者可以參考 Seok等對(duì) ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的 SNP 進(jìn)行分型研究，對(duì)多重 PCR進(jìn)行分組，最后在一起雜交（Seok對(duì)22 個(gè)突變點(diǎn)進(jìn)行了分析，一共使用 44 種編碼的微球，其多重 PCR 的解決采用分組進(jìn)行，分別做多重 PCR，然后混合，再用Bio-Plex液相芯片進(jìn)行檢測(cè)）。

[1] Lipatov A S，Govorkova E A，Webby R J，et al. Influenza：Emergence and Control[J]. J Virol， 2004，78（17）：8951-8959.

[2] Li K S，Guan Y，Wang J，et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia[J]. Nature，2004，430（6996）：209-213.

[3]陳光達(dá). 豬六種病毒多重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[D] . 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[4]朱向博. 四種豬病病原的液相芯片檢測(cè)方法的建立[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[5] Tim J D，John S，Vanessa G，et al. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotidecoupled fluorescent microspheres[J]. American Society for Microbiology，2009，47（12）：4067-4077.

[6]Seok H K，Tan C O，Kok T C. Multiplexed genotyping of ABC transporter polymorphisms with the Bioplex suspension array[J]. Biological Procedures Online，2006，9（1）：27-42.

[7]Douglas R C，Dennis M S，Marilyn S. Using DNA suspension arrays to identify library-independent markers for bacterial source tracking[J]. Water Research，2007，41：3740-3746.

[8]Johanna D，Karin P W，Anders J. The xMAP? technique can be used for detection of the inflammatory cytokines IL-1β，IL-6 and TNF-α in bovine samples[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，2007，118：40-49.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Establishment of a Multiplex Supension Array for Simultaneous Detection of Six Kinds of Porcine Reproductive Failure Virus

Yang Xianchao，Wu Xiujuan，Li Kaihang，Yang Dequan，Ju Houbin，Ge Feifei，Wang Jian
（Shanghai Center for Animal Disease Control and Prevention，Shanghai201103）

From more than 20 articles published in GenBank，structural protein VP2 gene sequence of porcine parvovirus（PPV），open reading frame 2 sequence of porcine circovirus 2（PCV2），gB genome sequence of pseudorabies virus（PRV），NSP2 genome sequence of swine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV），E2 genome sequence of classical swine fever virus（CSFV）and M genome sequence of Japanese encephalitis virus（JEV），were downloaded and multi-sequence analysis for filtering out the conserved region by DNAman V6 were done. Then the sequences were inputted into Primer 5.0 software to design out combinations of the specific probes and primers of PPV，PCV2，PRV，PRRSV，CSFV and JEV. Next，the probes and microspheres were coupled，reverse primers and probes’ reverse complementary sequence were tagged with biotin. Through the optimization of the annealing hybridization temperature and other reaction conditions，the xMAP instrument system was established for detection of PPV，PCV2，PRV，PRRSV，CSFV and JEV. The results showed that the specificity of combinations of each pair primers and probes was good，and there was no cross-reaction with each other. This method also could be sensitive to detect the six viruses，the limit of detection for each nucleic acid were 8.50×102copies/μL，2.87×102copies/μL，2.07×102copies/μL，2.61×102copies/μL，2.34×102copies/μL，2.05×102copies /μL，respectively，its sensitivityincreased 100～1 000 times compared with PCR/RT-PCR of each corresponding virus. 388 clinical samples were tested by the xMAP methods and ordinary PCR/RT-PCR methods respectively at same time，and the results showed that consistent test results were obtained by this two methods. The xMAP methods laid foundation for application of xMAP technology in fast，high-throughput detection of multi-virus of animals and differential diagnosis.

xMAP array；porcine reproductive failure virus；detection methods

S851.3

B

1005-944X（2016）12-0078-07

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.022

上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計(jì)劃（滬農(nóng)青字〔2014〕第2-11號(hào)）；上海市生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（滬農(nóng)科產(chǎn)字〔2016〕第6號(hào)）

王 建