唐靜靜　周巧麗　殷光文　江和基　黃志堅(jiān)（福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室福州350002）

禽核酸疫苗的研究進(jìn)展

唐靜靜周巧麗殷光文江和基黃志堅(jiān)*
（福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室福州350002）

本文對(duì)禽用（雞、鴨、火雞）核酸疫苗的研究進(jìn)行綜述。首先描述禽用核酸疫苗的進(jìn)展：病原，質(zhì)粒以及免疫途徑。其次，描述提高核酸疫苗免疫效果的方式：接種途徑，疫苗劑量以及首免時(shí)間，增加宿主細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒的攝入，添加免疫增強(qiáng)分子，優(yōu)化質(zhì)粒骨架和密碼子，疫苗抗原的選擇，異源性的首免-加強(qiáng)免疫策略。最后，描述禽用核酸疫苗的其他特點(diǎn)：接種后質(zhì)粒的去向，免疫反應(yīng)的特點(diǎn)以及核酸疫苗的其他用途。

核酸疫苗禽類傳染病佐劑免疫途徑

禽用核酸疫苗由載體和其表達(dá)的病原抗原組成，可以在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答；核酸疫苗適于大規(guī)模免疫，安全、便宜，可以區(qū)分野毒感染；核酸疫苗可以在常溫下保存較長(zhǎng)時(shí)間，儲(chǔ)存運(yùn)輸方便；此外，球蟲核酸疫苗可以減少抗球蟲藥物的使用，進(jìn)而減少肉類獸藥殘留。

1　禽類核酸疫苗免疫模式

1990年，Wolff發(fā)現(xiàn)在小鼠肌肉內(nèi)注射質(zhì)粒，可以引起目標(biāo)蛋白的顯著表達(dá)［1］。這是核酸免疫的最早研究，隨后，人、動(dòng)物包括禽類上面的核酸疫苗研究越來(lái)越多，目前已經(jīng)有四種動(dòng)物用核酸疫苗上市（馬西尼羅河病毒疫苗、犬黑色素瘤疫苗、魚傳染性造血組織壞死病疫苗以及豬生長(zhǎng)激素釋放激素疫苗）。但是目前還沒(méi)有禽用核酸疫苗上市。

文獻(xiàn)中有75%的禽用核酸疫苗研究針對(duì)雞，20%針對(duì)鴨，剩下的針對(duì)火雞。有75%的研究針對(duì)病毒病，20%的研究針對(duì)球蟲病，剩下的針對(duì)細(xì)菌病。

1993年最早的禽用核酸疫苗是針對(duì)禽流感病毒［2］。之后，在雞上，流感病毒的核酸疫苗研究越來(lái)越多，鴨上也有部分研究。流感病毒的核酸疫苗已經(jīng)取得比較好的效果，基于HA蛋白的核酸疫苗一次免疫可以對(duì)致死攻毒產(chǎn)生90%以上的保護(hù)。另外一項(xiàng)研究用沙門氏菌活載體攜帶核酸疫苗口服免疫雞，也可以提供很好的保護(hù)，免疫后2周和4周，雞體內(nèi)的CD4+和CD8+均有顯著增加，雞血清的血抑效價(jià)和機(jī)體內(nèi)Th1類的細(xì)胞因子也比對(duì)照組高。傳染性法氏囊病毒核酸疫苗的研究也取得不錯(cuò)的進(jìn)展，一項(xiàng)研究首免用核酸疫苗，加強(qiáng)免疫用蛋白疫苗（所選抗原為VP2），用強(qiáng)毒攻毒，產(chǎn)生完全的保護(hù)［3］；另一項(xiàng)研究，首免用核酸疫苗進(jìn)行蛋內(nèi)免疫（所選抗原為VP243），加強(qiáng)免疫用滅活的病毒疫苗免疫，同樣對(duì)試驗(yàn)攻毒可以產(chǎn)生完全的保護(hù)。雞傳染性支氣管炎病毒的核酸疫苗研究也比較多，質(zhì)粒表達(dá)S1、N或者M(jìn)蛋白免疫后可以對(duì)攻毒產(chǎn)生60%～90%的保護(hù)。在鴨上面，研究最多的核酸疫苗是針對(duì)鴨肝炎病毒，核酸疫苗免疫可以對(duì)該病毒的感染產(chǎn)生一定的抗病毒效應(yīng)［4］。針對(duì)雞其他病毒的核酸疫苗研究較少?；诤裟c孤病毒σ蛋白的核酸疫苗可以產(chǎn)生66.7%～75%的保護(hù)。滴鼻免疫基于新城疫F蛋白的核酸疫苗可以對(duì)新城疫病毒的攻毒產(chǎn)生完全的保護(hù)。核酸疫苗在馬立克氏病病毒上可產(chǎn)生55%的保護(hù)。傳染性喉氣管炎病毒的核酸疫苗（基于gpB蛋白）免疫后可以減少65%～75%的死亡率?；诰W(wǎng)狀內(nèi)皮增生性病毒gp90的核酸疫苗免疫后可以引起中和抗體反應(yīng)以及淋巴細(xì)胞增生，可以對(duì)攻毒后雞的貧血產(chǎn)生保護(hù)［5］。雞貧血病毒的核酸疫苗也可以引起雞的血液中和抗體，IL-2和IFN-γ，以及脾細(xì)胞增生，可以對(duì)攻毒后雞的貧血產(chǎn)生部分保護(hù)［6］。基于火雞鼻氣管炎病毒F蛋白的核酸疫苗免疫后，攻毒7 d后出現(xiàn)臨床癥狀的火雞從50%～60%降低到20%～30%［7］。鴨腸炎病毒核酸疫苗免疫后可以在鴨體內(nèi)產(chǎn)生IgG、IgA以及中和抗體，攻毒后，80%的鴨可以存活［8］?；邙單敛《緂pC抗原的核酸疫苗免疫后可以誘導(dǎo)鴨產(chǎn)生IgG，中和抗體，還可以產(chǎn)生淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［9］。

球蟲核酸疫苗研究也比較多，這些核酸疫苗免疫后大部分均可以產(chǎn)生較好的免疫反應(yīng)，對(duì)球蟲的攻毒可以產(chǎn)生部分保護(hù)，臨床指標(biāo)如體重?fù)p失、腸道病變計(jì)分以及卵囊排出量均有明顯改善［10］。

禽用細(xì)菌核酸疫苗研究較少。基于火雞鸚鵡熱衣原體MOMP抗原的核酸疫苗免疫后在火雞體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平較低，對(duì)試驗(yàn)感染產(chǎn)生的保護(hù)水平也不高［11］?？漳c彎曲弧菌的核酸疫苗免疫雞后可以顯著減少雞腸道細(xì)菌載量。基于多殺巴氏桿菌Omp H和Omp A的核酸疫苗免疫后可對(duì)細(xì)菌感染產(chǎn)生75%的保護(hù)［12］。

2　禽類核酸疫苗質(zhì)粒選擇

核酸疫苗基本上包括載體質(zhì)粒及其表達(dá)的蛋白。禽用核酸疫苗的載體和哺乳動(dòng)物所用的載體類似，主要有pcDNA、pVAX和pCI等。這些質(zhì)粒都包括一個(gè)來(lái)源于病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子和終止序列。有部分研究人員選用pCAGGS質(zhì)粒，其啟動(dòng)子是雞的β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，可以增強(qiáng)疫苗的效力。在某些情況下，人們選用pIRES質(zhì)粒，該質(zhì)?？梢酝瑫r(shí)表達(dá)兩種抗原，或者表達(dá)一種抗原和一種佐劑分子［13］。

3　禽類核酸疫苗免疫途徑和劑量

免疫途徑主要包括四種：肌肉注射、皮內(nèi)或皮下注射、黏膜免疫（經(jīng)口或滴鼻免疫）以及蛋內(nèi)注射。雞首免的日齡從1日齡到5～6周齡。大部分情況下，核酸疫苗溶在水溶液中被直接注射到胸肌或腿肌，一般多點(diǎn)注射，如首免注射左腿肌肉，二免注射右腿肌肉［14］。有的研究人員將肌肉注射與其他免疫方式（滴鼻、腹腔注射、皮內(nèi)或靜脈注射）混用?？诜庖呤堑诙N較普遍的免疫方式，通常是用致弱的細(xì)菌如沙門氏菌或大腸桿菌攜帶質(zhì)粒，用細(xì)菌口服免疫雞。比較少的情況下，質(zhì)粒與微球如聚乳酸-羥基乙酸共聚物或殼聚糖混合滴鼻免疫雞。黏膜免疫更適合大規(guī)模免疫，細(xì)菌和微?？梢造F化到空氣中，或添加到水和食物中。在雞胚18日齡時(shí)進(jìn)行蛋內(nèi)免疫對(duì)雞來(lái)說(shuō)是一種最有效的大規(guī)模免疫方式，蛋內(nèi)免疫可以用儀器自動(dòng)進(jìn)行，一次蛋內(nèi)免疫通常不能激發(fā)很好的保護(hù)性免疫應(yīng)答，在7 d或14 d用致弱的活疫苗或重組的痘病毒疫苗加強(qiáng)免疫可以比傳統(tǒng)免疫方式激發(fā)更好的免疫反應(yīng)［15］。加強(qiáng)免疫用核酸疫苗也可以激發(fā)一定的保護(hù)性免疫應(yīng)答。

70%的研究選用的免疫劑量為50～200 ug質(zhì)粒，10%的研究如果注射點(diǎn)用電擊或其他方式加強(qiáng)吸收，可以選用較少的質(zhì)粒劑量。還有研究人員選用的質(zhì)粒劑量比較大，多達(dá)500 ug或10 mg，這種情況下，疫苗的花費(fèi)將比較大，將影響其工業(yè)化應(yīng)用。

研究人員通常用核酸疫苗以同樣的方式進(jìn)行兩次或多次注射誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。還有一些加強(qiáng)免疫通常是為了提高后代母源抗體的水平，或者制備診斷血清，或者治療慢性傳染病。免疫間隔時(shí)間沒(méi)有固定的標(biāo)準(zhǔn)，通常為1周～4周，比較普遍的間隔時(shí)間是1周或2周，這種間隔時(shí)間通常可以有效激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。

4　提高核酸疫苗效果的方式

通常核酸疫苗免疫激發(fā)的保護(hù)性免疫應(yīng)答效果有限，需要采取一些方法進(jìn)行改善。需要考慮的方面如下：接種途徑，疫苗劑量以及首免時(shí)間，增加宿主細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒的攝入，添加免疫增強(qiáng)分子，優(yōu)化質(zhì)粒骨架和密碼子，疫苗抗原的選擇，異源性的首免-加強(qiáng)免疫策略。

5　禽用核酸疫苗的其他特點(diǎn)

很少有人研究核酸疫苗是怎樣在禽上激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的。不過(guò)，有一些研究描述了接種后質(zhì)粒的命運(yùn)。還有一些研究核酸疫苗免疫后，對(duì)特定免疫細(xì)胞的刺激作用，以及母源抗體對(duì)免疫的影響。有人研究核酸疫苗免疫后的其他作用。

5.1核酸疫苗免疫后質(zhì)粒的去向核酸疫苗免疫后質(zhì)粒在雞體內(nèi)的去向研究得比較少。免疫后第5d和第15 d，在雞的血液、肝臟、脾臟、肺部、腎臟、肌肉以及心臟均可以發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒。但在哺乳動(dòng)物上，肌肉注射的部位多達(dá)3周均可以檢測(cè)到質(zhì)粒，但是其他肌肉部位，僅僅在免疫后1～7 d可以檢測(cè)到。免疫后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA可以整合到宿主DNA中，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA進(jìn)入到雞腸道細(xì)菌中。用沙門氏菌載體攜帶核酸質(zhì)粒經(jīng)口免疫，免疫后多達(dá)6周都可以在雞的脾臟、肝臟、盲腸檢測(cè)到質(zhì)粒。蛋內(nèi)免疫2 h，在雞的尿囊液中已檢測(cè)不到質(zhì)粒。質(zhì)粒已經(jīng)到達(dá)雞胚并分布到雞的全身［16］。

5.2核酸疫苗的免疫學(xué)核酸疫苗可以激發(fā)宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，免疫后雞和鴨的CD4+和CD8+T細(xì)胞均可以增值［17］。雞的先天性免疫系統(tǒng)到4周的時(shí)候才會(huì)完全發(fā)育成熟，因此，幼齡雞在出生后2周到3周需要母源抗體的保護(hù)。但是，很少有研究報(bào)道母源抗體對(duì)禽用核酸疫苗免疫效果的影響。大多數(shù)情況下，研究人員用SPF雞或者沒(méi)有母源抗體的雞做試驗(yàn)。少數(shù)的幾項(xiàng)研究表明，在有母源抗體的情況下，需要加大質(zhì)粒的劑量、增加免疫次數(shù)才可以對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒的感染激發(fā)較好的免疫保護(hù)。對(duì)于新城疫病毒，母源抗體則阻礙了核酸疫苗的效果。在火雞上，母源抗體影響了核酸疫苗對(duì)鸚鵡熱衣原體的體液免疫應(yīng)答，但對(duì)細(xì)胞免疫和保護(hù)性免疫應(yīng)答沒(méi)有影響［18］。

5.3禽用核酸疫苗的其他應(yīng)用大多數(shù)情況下，DNA免疫是要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生預(yù)防性的保護(hù)性免疫應(yīng)答。但是，DNA免疫也有其他一些應(yīng)用。有研究人員將DNA疫苗與藥物聯(lián)合應(yīng)用治療鴨乙型肝炎病毒感染；DNA免疫被用來(lái)生產(chǎn)用于診斷的參考血清；DNA免疫被用來(lái)產(chǎn)生針對(duì)蝦白斑綜合征病毒的抗體［19］。DNA免疫還被用來(lái)延緩雞腫瘤的發(fā)生［20］。

6　結(jié)論

DNA免疫對(duì)于禽類（雞、鴨、火雞）來(lái)說(shuō)是一種簡(jiǎn)單合適的免疫方式。該種免疫方式在對(duì)抗禽類病毒、細(xì)菌以及球蟲方面都取得了成功。一些方法可以被用來(lái)增強(qiáng)疫苗的免疫效果；一些免疫方法適合大規(guī)模免疫。盡管自1993年以來(lái)有大量的禽用核酸疫苗研究，但是目前還沒(méi)有一種進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)?？赡苁且?yàn)榇蟛糠盅芯坎捎玫氖羌∽⒎绞?，而且免疫了至少兩次，這些在實(shí)際應(yīng)用中并不方便。還有大量的研究采用SPF動(dòng)物，而實(shí)際中大部分幼齡雞可能存在母源抗體，在某種程度上會(huì)影響DNA疫苗的效果。盡管這樣，還是有一些研究在母源抗體存在的情況下取得了免疫保護(hù)，表明至少針對(duì)某些病原，母源抗體并不影響核酸疫苗的效果。因此，我們需要采取更多的方法開(kāi)發(fā)適合大規(guī)模應(yīng)用、可以克服母源抗體干擾的禽用核酸疫苗。

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DNA vaccination of poultry

Tang Jingjing Zhou Qiaoli Yin Guangwen Jiang heji Huang Zhijian*
（College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，Engineering Laboratory of Animal Pharmaceuticals，F(xiàn)uzhou 350002）

This review describes studies in this field performed exclusively on birds（chickens，ducks and turkeys）.No evaluations of avian DNA vaccine efficacy performed on mice as preliminary tests have been taken into consideration.The review first describes the state of the art for DNA vaccination in poultry∶pathogens targeted，plasmids used and different routes of vaccine administration.Second，it presents strategies designed to improve DNA vaccine efficacy∶influence of the route of administration，plasmid dose and age of birds on their first inoculation；increasing plasmid uptake by host cells；addition of immunomodulators；optimization of plasmid backbones and codon usage；association of vaccine antigens and finally，heterologous prime-boost regimens.The final part will indicate additional properties of DNA vaccines in poultry∶fate of the plasmids upon inoculation，immunological considerations and the use of DNA vaccines for purposes other than preventing infectious diseases.

DNA vaccine Avian Infectious diseases Adjuvants Routes

A

1003-4331（2016）05-0050-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31502058）、福建省教育廳科研項(xiàng)目（JA15159）、大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201610389148）資助。

唐靜靜（1993-），女，河南商丘人，本科生，主要從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究。Email：970339298@qq.com。

黃志堅(jiān)（1963-），男，福建惠安人，教授，從事動(dòng)物疾病防治與保健。E-mail：huangzj1999@sina. com。