衣偉萌　殷光文　黃駒輝　江和基　黃志堅(jiān)（福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室福州350002）

禽用DNA疫苗免疫效果增強(qiáng)的策略

衣偉萌殷光文黃駒輝江和基黃志堅(jiān)*
（福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室福州350002）

對(duì)于人和動(dòng)物的傳染病來(lái)說(shuō)，DNA疫苗免疫是一種很有希望的免疫方式。經(jīng)過(guò)25年的發(fā)展，已經(jīng)上市的核酸疫苗仍屈指可數(shù)。禽用核酸疫苗一直是禽類(lèi)疫苗的研究熱點(diǎn)，文中描述提高核酸疫苗免疫效果的方式：接種途徑，疫苗劑量及首免時(shí)間，增加宿主細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒的攝入，添加免疫增強(qiáng)分子，優(yōu)化質(zhì)粒骨架和密碼子，疫苗抗原的選擇，異源性的首免-加強(qiáng)免疫策略。

核酸疫苗禽類(lèi)免疫途徑

傳統(tǒng)的禽用滅活疫苗或弱毒疫苗在抵抗禽類(lèi)疫病方面發(fā)揮了重要作用，然而這些疫苗也存在著各種缺點(diǎn)。如制備儲(chǔ)存運(yùn)輸困難，價(jià)格貴，在母源抗體或多種血清型病原共存的情況下不能產(chǎn)生很好的保護(hù)；一些活疫苗存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)；很多疫苗不能區(qū)分自然感染和疫苗免疫［1-2］。核酸疫苗可以克服上述傳統(tǒng)疫苗的不足，是一類(lèi)很有希望的疫苗。核酸疫苗有載體和其表達(dá)的病原抗原組成，可以在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答；適于大規(guī)模免疫，安全、便宜，可以區(qū)分野毒感染；可以在常溫下保存較長(zhǎng)時(shí)間，儲(chǔ)存運(yùn)輸方便；球蟲(chóng)核酸疫苗可以減少抗球蟲(chóng)藥物的使用，進(jìn)而減少肉類(lèi)獸藥殘留［3-4］。

通常核酸疫苗免疫激發(fā)的保護(hù)性免疫應(yīng)答效果有限，需要采取一些方法進(jìn)行改善。需要考慮的方面如下：接種途徑，疫苗劑量以及首免時(shí)間，增加宿主細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒的攝入，添加免疫增強(qiáng)分子，優(yōu)化質(zhì)粒骨架和密碼子，疫苗抗原的選擇，異源性的首免-加強(qiáng)免疫策略。

1　優(yōu)化接種途徑

大多數(shù)情況下，核酸疫苗通過(guò)肌肉注射的途徑，盡管沒(méi)有人對(duì)這種途徑的免疫機(jī)理進(jìn)行解釋?zhuān)且恍┭芯咳藛T進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)。對(duì)于裸露核酸，肌肉注射被認(rèn)為是最有效的方式。質(zhì)粒如果與微粒如聚乳酸-羥基乙酸共聚物或殼聚糖混合肌肉注射，通常比單獨(dú)裸質(zhì)粒注射效果要好。質(zhì)粒如果通過(guò)大腸桿菌攜帶口服免疫，效果也通常優(yōu)于單獨(dú)質(zhì)粒注射。當(dāng)質(zhì)粒被金顆粒包裹通過(guò)基因槍皮下注射時(shí)，效果要優(yōu)于肌肉注射［5］。

2　質(zhì)粒的劑量和加強(qiáng)免疫的影響

多數(shù)情況下，研究人員都會(huì)告訴免疫的劑量，但是通常都沒(méi)有告訴選擇這種劑量的依據(jù)。通常選擇的劑量為50～200 ug質(zhì)粒。有研究人員比較了不同劑量的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌注劑量通常為25～200 ug［6］。有趣的是，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于柔嫩艾美耳球蟲(chóng)，核酸疫苗肌注劑量25～50 ug的效果要好于100～200 ug；另一項(xiàng)針對(duì)禽流感病毒的研究發(fā)現(xiàn)，50～100 ug免疫劑量的效果要優(yōu)于250 ug免疫劑量。對(duì)于蛋內(nèi)免疫，40～60 ug通常是比較有效的劑量。口服免疫攜帶核酸疫苗的沙門(mén)氏菌，細(xì)菌的劑量也非常重要。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，1011CFU的攜帶鴨腸炎病毒核酸疫苗的沙門(mén)氏菌免疫，效果優(yōu)于低劑量的免疫。同樣，109CFU的攜帶傳染性法氏囊病病毒或柔嫩艾美耳球蟲(chóng)核酸疫苗的沙門(mén)氏菌免疫，效果優(yōu)于107或108CFU低劑量的免疫［7］。

通常，一次劑量免疫往往不能激發(fā)較好的免疫應(yīng)答。因此，需要加強(qiáng)免疫。對(duì)于禽流感病毒來(lái)說(shuō)，加強(qiáng)免疫可以增加抗體的水平。對(duì)于禽巴氏桿菌和傳染性法氏囊病病毒，通常需要一到兩次加強(qiáng)免疫。當(dāng)然，如果電擊等方式被采用的話(huà)，免疫次數(shù)可以適當(dāng)降低［8］。

3　初免雞日齡的影響

因?yàn)槿怆u一般6周齡上市，所以肉雞最好能夠早點(diǎn)免疫，事實(shí)上肉雞什么時(shí)候進(jìn)行核酸免疫沒(méi)有固定的標(biāo)準(zhǔn)，免疫日齡從18日齡雞胚到孵化后5周～6周。初免日齡對(duì)于激發(fā)較好的免疫應(yīng)答非常重要，一項(xiàng)在禽流感病毒上的研究發(fā)現(xiàn)，14日齡首免比1日齡首免要產(chǎn)生更高的抗體反應(yīng)［9］。有研究人員指出，禽類(lèi)的先天性免疫在幼齡雞上發(fā)育不成熟。但是，7日齡的雞肌肉細(xì)胞比14日齡的雞更容易進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。

4　增加宿主細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒的攝取

在哺乳動(dòng)物上，注射的裸質(zhì)粒很快就會(huì)被降解，這將降低疫苗的效力。因此，要在核酸疫苗降解之前讓盡可能多的質(zhì)粒被細(xì)胞攝取。在一些研究中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑會(huì)和核酸疫苗一起免疫動(dòng)物，但是免疫效果增加多少并不清楚。

質(zhì)粒攝取可以被機(jī)械地增加，可采用電擊的方式增加質(zhì)粒進(jìn)入到細(xì)胞中。在禽上，電擊可引起局部炎癥反應(yīng)，招募CD3+T細(xì)胞，增加體液免疫和細(xì)胞免疫的強(qiáng)度，而且質(zhì)粒的濃度可以顯著降到10 ug［10］。

此外，使用基因槍將包裹在金顆粒上的DNA注射到雞的皮內(nèi)，可以增加保護(hù)性免疫應(yīng)答，質(zhì)粒的量可降至1～2 ug。目前已有兩種高壓力的液體注射系統(tǒng)AgrojetTM和MedijectorTM被開(kāi)發(fā)和使用［11］。

5　共注射免疫調(diào)節(jié)因子

免疫調(diào)節(jié)因子可以增加疫苗的效力。在禽上，共注射免疫調(diào)節(jié)因子是一種最經(jīng)常被采用的增強(qiáng)疫苗效力的方法。大部分研究聚焦于雞，少部分研究采用鴨做實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在雞上，IL2最常被用在核酸疫苗中。IL2可以增加抗體的產(chǎn)生，提高淋巴細(xì)胞的增值水平，提高CD4+T細(xì)胞的數(shù)量［12］。結(jié)合IL2的傳染性法氏囊病病毒核酸疫苗免疫后，可以對(duì)該病毒的攻毒產(chǎn)生保護(hù)。添加IL2的球蟲(chóng)核酸疫苗免疫后，可以增加抗體的產(chǎn)生，改善雞攻蟲(chóng)后的臨床癥狀。IFN-γ和IL-15同樣也被成功地運(yùn)用，IFN-γ可以提高對(duì)球蟲(chóng)和新城疫病毒的保護(hù)；IL-15可以增加CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞的水平，增加對(duì)禽流感病毒的體液免疫和細(xì)胞免疫水平以及對(duì)球蟲(chóng)感染的免疫保護(hù)［13］。CpG核酸序列可以被雞TLR21識(shí)別，可以有效增強(qiáng)對(duì)傳染性法氏囊病病毒和傳染性支氣管炎病毒的免疫保護(hù)作用。其他一些分子如IL-1、IL-4、IL-6、IL-17、IL-18、GM-CSF、IFN-α、CD145、TGF-β4、HMGB1、MDA5、LTB都有被用來(lái)增強(qiáng)禽用核酸疫苗的免疫效果。鴨上面的研究較少，IFN-γ、IL-2、CD154被用來(lái)增強(qiáng)對(duì)鴨乙型肝炎病毒的免疫保護(hù)效果［14］。

6　質(zhì)粒骨架的優(yōu)化和密碼子優(yōu)化

多數(shù)情況下，禽用核酸疫苗的載體和哺乳動(dòng)物所用的載體類(lèi)似。有部分研究人員選用pCAGGS質(zhì)粒，其啟動(dòng)子是雞的β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，大多數(shù)情況下，這種質(zhì)粒的效果沒(méi)有與病毒CMV質(zhì)粒進(jìn)行比較。當(dāng)與經(jīng)典的質(zhì)粒進(jìn)行比較時(shí)，有兩個(gè)研究結(jié)果相互矛盾，一項(xiàng)研究表明pCAGGS質(zhì)粒針對(duì)流感病毒可以激發(fā)更高的抗體應(yīng)答，另一項(xiàng)研究則恰恰相反［15-16］。

當(dāng)把抗原的密碼子優(yōu)化成宿主偏好的密碼子時(shí)，疫苗的效力可以得到提高，這在鴨上的一項(xiàng)流感病毒的研究中得到證明。對(duì)雞的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒和傳染性法氏囊病病毒的研究表明，抗原密碼子優(yōu)化和mRNA合成增加可以提高這兩種病原核酸疫苗的免疫保護(hù)效果。

7　多種抗原共表達(dá)

多數(shù)情況下，研究人員用一種抗原進(jìn)行免疫，往往可以激發(fā)較好的免疫應(yīng)答。然而，鑒定具有很好免疫保護(hù)的抗原有時(shí)候并不容易。因此，也有采用兩種或多種抗原研究核酸疫苗。在雞上，合并雞傳染性法氏囊病病毒VP2、VP4和VP3可以激發(fā)比單抗原VP2更好的免疫反應(yīng)［17］。同樣，在雞傳染性支氣管炎病毒、呼腸孤病毒、禽多殺巴氏桿菌等核酸疫苗免疫過(guò)程中，多抗原比單抗原的效果要好。有時(shí)候，為了激發(fā)交叉保護(hù)，需要把不同型病毒或細(xì)菌的抗原合并在一起免疫雞，這在流感病毒和雞傳染性法氏囊病病毒中取得成功。

8　異源性的初免-加強(qiáng)免疫策略

單獨(dú)一次核酸免疫有時(shí)候不能激發(fā)較好的免疫保護(hù)，需要在加強(qiáng)免疫時(shí)采用該抗原的蛋白疫苗或活載體疫苗，這就是異源性的初免-加強(qiáng)免疫策略。與在哺乳動(dòng)物上的研究一樣，禽上的研究也證明了該種策略在提高疫苗效力方面效果顯著。在禽上，一般初免用DNA疫苗，加強(qiáng)免疫用蛋白疫苗或痘病毒活載體疫苗［18］。對(duì)于雞傳染性法氏囊病病毒，DNA初免-蛋白加強(qiáng)免疫可以對(duì)該病毒的攻毒感染產(chǎn)生100%的保護(hù)（用VP2抗原作為疫苗抗原）。對(duì)于球蟲(chóng)和流感病毒，該策略同樣有效。在火雞上，這種免疫策略對(duì)鸚鵡熱衣原體感染可以提供一些保護(hù)。加強(qiáng)免疫用滅活的疫苗對(duì)于禽流感病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性支氣管炎病毒的感染可以提供保護(hù)。對(duì)于雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、球蟲(chóng)病核酸疫苗，蛋內(nèi)初免DNA免疫，而后加強(qiáng)免疫，也可以提高疫苗的效力。對(duì)于鴨乙型肝炎病毒，初免用DNA疫苗，加強(qiáng)免疫用痘病毒疫苗，顯示對(duì)這種慢性病毒的感染有較好的治療作用。

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Strategies to improve DNA vaccine efficacy of poultry

Yi Weimeng Yin Guangwen Huang Juhui Jiang heji Huang Zhijian*
（College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，Engineering Laboratory of Animal Pharmaceuticals，F(xiàn)uzhou 350002）

DNA vaccination is a promising alternative strategy for developing new human and animal vaccines.The massive efforts made these past 25 years to increase the immunizing potential of this kind of vaccine are still ongoing.A relatively small number of studies concerning poultry have been published.In this review，strategies designed to improve DNA vaccine efficacy will be described∶influence of the route of administration，plasmid dose and age of birds on their first inoculation，increasing plasmid uptake by host cells，addition of immunomodulators；optimization of plasmid backbones and codon usage，association of vaccine antigens and finally，heterologous prime-boost regimens.

DNA vaccine Avian Routes

A

1003-4331（2016）05-0047-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（31502058）、福建省教育廳科研項(xiàng)目（JA15159）、大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201510389029）資助。

衣偉萌（1995-），女，山東棲霞人，本科生，主要從事動(dòng)物寄生蟲(chóng)病研究。Email：Yiweimeng11@163.com。

黃志堅(jiān)（1963-），男，福建惠安人，教授，從事動(dòng)物疾病防治與保健。E-mail：huangzj1999@sina. com。