馬 然，曹 煊，劉 巖，張述偉，王小紅，張?zhí)禊i

（1.山東省科學(xué)院海洋儀器儀表研究所，山東青島266100；2.山東省海洋環(huán)境監(jiān)測技術(shù)重點實驗室，山東青島，266100）

基于微流控技術(shù)的營養(yǎng)鹽原位分析方法的研究*

馬 然1，2*，曹 煊1，2，劉 巖1，2，張述偉1，2，王小紅1，2，張?zhí)禊i1，2

（1.山東省科學(xué)院海洋儀器儀表研究所，山東青島266100；2.山東省海洋環(huán)境監(jiān)測技術(shù)重點實驗室，山東青島，266100）

現(xiàn)有國內(nèi)的營養(yǎng)鹽監(jiān)測手段主要采用岸邊在線監(jiān)測或現(xiàn)場取樣+實驗室分析，不能實現(xiàn)原位長期監(jiān)測，因此無法反映較遠(yuǎn)海域的營養(yǎng)鹽參數(shù)變化趨勢。為此，提出一種可用于原位監(jiān)測營養(yǎng)鹽參數(shù)的微縮實驗室方法，采用微流控技術(shù)+光電檢測技術(shù)，依據(jù)信號鎖相放大原理，實時分析水樣的吸光度，最終實現(xiàn)營養(yǎng)鹽的原位監(jiān)測。長期的海試數(shù)據(jù)與實驗室數(shù)據(jù)的比對結(jié)果證明了該方法的可行性。本文提出的分析方法的實現(xiàn)對于海洋富養(yǎng)化生態(tài)災(zāi)害的監(jiān)測具有非常重要的意義，也對保護海洋生態(tài)環(huán)境的健康提供技術(shù)支撐。

海洋環(huán)境監(jiān)測；營養(yǎng)鹽原位分析；微流控技術(shù)；鎖相放大；吸光度

常規(guī)的營養(yǎng)鹽參數(shù)包括：硅酸鹽、磷酸鹽、氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽共五項，它們是海水中微生物所必須的營養(yǎng)元素，也是海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測的重要參數(shù)之一［1-2］。分析海水中營養(yǎng)鹽濃度的變化，對于監(jiān)測海洋環(huán)境、預(yù)警海洋生態(tài)災(zāi)害等具有重要的意義［3-4］。目前，海水營養(yǎng)鹽的監(jiān)測方法主要是根據(jù)海洋監(jiān)測規(guī)范（GB 17378—2007），規(guī)范中采用的是現(xiàn)場采樣-實驗室測定法［5］。該方法技術(shù)成熟、測定可靠，但存在實時性差、水樣易受污染、浪費人力物力等缺點。而海洋原位監(jiān)測一般采用浮標(biāo)定點長期監(jiān)測，浮標(biāo)監(jiān)測體系對功耗、體積和可維護性都有很高的要求，以目前國內(nèi)現(xiàn)有的監(jiān)測手段難以實現(xiàn)［6］。因此，針對原位營養(yǎng)鹽傳感器的研發(fā)成為海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的研究熱點之一。

基于此，本文提出一種針對海洋原位營養(yǎng)鹽監(jiān)測的方法，采用微流控技術(shù)，測定并依據(jù)海水試樣吸光度的變化確定其營養(yǎng)鹽的含量，具備功耗低、體積小、試劑量少、可靠性高、原位運行時間長等特點。

1 海水營養(yǎng)鹽原位分析方法的國內(nèi)外現(xiàn)狀介紹

在流路體系中通過設(shè)計合理的流體及顯色反應(yīng)控制裝置，精確地控制試劑與水樣的混合時間并實現(xiàn)顯色反應(yīng)的過程，是海水營養(yǎng)鹽原位監(jiān)測技術(shù)的核心所在。

國際上比較知名的海水營養(yǎng)鹽原位監(jiān)測儀器包括：意大利SYSTEA公司的WIZ系列營養(yǎng)鹽在線監(jiān)測儀，美國Envirotech公司的MicroLAB和EcoLAB系列營養(yǎng)鹽原位監(jiān)測系統(tǒng)，美國SubChem Systems，Inc.公司的 APNA（Autonomous Profiling Nutrient Analyser）營養(yǎng)鹽分析系統(tǒng)等。

其中WIZ Pro目前在國內(nèi)的市場占有率較高，WIZ Pro是一款便攜式野外在線傳感器，可用于地表水及海洋水中最多達(dá)四個化學(xué)參數(shù)的自動化測量。WIZ主要采用業(yè)內(nèi)公認(rèn)的分光光度濕化學(xué)法進行測量，氨氮的檢測采用熒光法，該系統(tǒng)的亮點在于——微環(huán)流反應(yīng)體系使得試劑及校準(zhǔn)液的消耗量降到最低，采用與業(yè)內(nèi)常規(guī)水質(zhì)分析儀相同的單筒型設(shè)計使得投放和安裝簡便易行。不過該系統(tǒng)的缺點是采用單通道測量，反應(yīng)速度較慢，目前國內(nèi)的主要應(yīng)用在湖泊、河流等淡水區(qū)域監(jiān)測，國內(nèi)海洋環(huán)境的應(yīng)用相對較少。

EcoLAB多通道營養(yǎng)鹽分析儀能夠在整個水樣中進行單獨的化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)所使用的分析方法專門用于長期的現(xiàn)場監(jiān)測和不連續(xù)分析。該系統(tǒng)能夠分析1到4個營養(yǎng)鹽通道，包含硝酸鹽、磷酸鹽、氨氮、硅酸鹽。該分析儀對生物污損有非常強的抵抗力，在水下工作時中可進行常規(guī)的校準(zhǔn)和自我清潔，額定工作水深可達(dá)4 000 m，適合深遠(yuǎn)海的營養(yǎng)鹽測量。

APNA是一套快速響應(yīng)的自記式水下營養(yǎng)鹽分析系統(tǒng)，設(shè)計專門應(yīng)用于營養(yǎng)鹽及其它重要環(huán)境化學(xué)要素的高分辨率、自記式定點長期或現(xiàn)場剖面監(jiān)測。APNA系統(tǒng)主要由兩個模塊構(gòu)成：①采樣、試劑輸送和WET Labs的多通道吸收光/熒光檢測器“ChemStar”單元；②試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液存放單元。APNA采用連續(xù)流動分析方法，實現(xiàn)現(xiàn)場快速讀取硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、硅酸鹽和氨氮等幾項營養(yǎng)鹽的濃度。APNA反應(yīng)速度快，但試劑消耗量較大，更適合做深海剖面營養(yǎng)鹽的測量。

由于國內(nèi)營養(yǎng)鹽自動化分析技術(shù)起步較晚，現(xiàn)有產(chǎn)品化應(yīng)用的海水營養(yǎng)鹽分析儀器依然停留在現(xiàn)場分析階段，其中以國家海洋技術(shù)中心杜軍蘭老師團隊研發(fā)的營養(yǎng)鹽在線分析儀為代表。該分析儀采用單參數(shù)單通道分析，其流體及顯色反應(yīng)控制裝置多為單通道分散式結(jié)構(gòu)，每一個營養(yǎng)鹽參數(shù)對應(yīng)一個通道，每個通道均需流體控制裝置、混合反應(yīng)器、蠕動泵、自動進樣閥和光學(xué)流通池。這種方法的優(yōu)點是測量速度快（約20 min）、準(zhǔn)確度高、技術(shù)成熟可靠，缺點是集成度低、體積大、能耗高、試劑用量大等不足，不便于進行原位測量［9-11］。而且采用現(xiàn)場分析方法對于近海海域監(jiān)測只能采用走航式測量或岸站式測量，走航式測量的成本太高且無法進行長期連續(xù)監(jiān)測，岸站式測量對于稍遠(yuǎn)的海域無法監(jiān)測。

因此，如何實現(xiàn)長期穩(wěn)定、體積小、功耗低的海水營養(yǎng)鹽原位分析方法的國產(chǎn)化應(yīng)用，是目前亟待解決的問題。

微流控技術(shù)是一種新興的精確控制和操控微尺度流體的技術(shù)［12］。在20世紀(jì)80年代，微流控技術(shù)開始興起，并在DNA芯片，芯片實驗室，微進樣技術(shù)，微熱力學(xué)技術(shù)等方向得到了發(fā)展［13］。微流控技術(shù)有著體積輕巧、使用樣品及試劑量少等優(yōu)點。在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著的巨大潛力，近年來已經(jīng)發(fā)展成為一個生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料、機械等學(xué)科交叉的嶄新研究領(lǐng)域［14-16］。因此，采用微流控技術(shù)可以完美地解決現(xiàn)有技術(shù)手段無法解決的體積和功耗方面的問題。

基于此，本文提出基于微流控技術(shù)的海水營養(yǎng)鹽原位分析方法，核心元器件采用自主加工的200 μm通徑流路的微流控芯片與微型三通閥組形成閥島體系，若按照程序固定順序切換閥組通斷以及調(diào)整微型泵轉(zhuǎn)速，在一塊微流控芯片中就可實現(xiàn)5項營養(yǎng)鹽參數(shù)流路的依次切換，大大節(jié)省了流路空間，而且由于流路的長度固定，試劑量也可以實現(xiàn)μg級的精確控制［17］。

2 海水營養(yǎng)鹽原位分析系統(tǒng)的設(shè)計

2.1 海水營養(yǎng)鹽原位分析方法的整體研究方案

有了先進的微流控技術(shù)支持，還需要合理的研究方案配合，才能實現(xiàn)穩(wěn)定可靠的營養(yǎng)鹽原位分析方法。本文提出的研究方案主要針對體系的可靠性、穩(wěn)定性、靈敏度問題，從硬件體系到軟件算法兩個大方向進行研究。具體的研究方案如圖1所示。

圖1 總體研究方案

2.2 硬件體系可靠性、穩(wěn)定性保障的相關(guān)研究

2.2.1 流程時序的精確控制與元器件選型

流路體系的可靠性關(guān)鍵在于對溶液流量的精確控制。本文提出的基于微流控芯片技術(shù)的閥島體系，采用微流控技術(shù)的微型三通電磁閥組和0.1 rad/min精度步長的微型蠕動泵，可以克服現(xiàn)有流體及顯色反應(yīng)控制裝置體積龐大、功耗大的問題，降低能耗、縮小體積、減小試劑用量、提高集成度。

微流控芯片由上下兩層板組成，材料為有機玻璃，可提高耐酸堿、高鹽等的腐蝕性，兩層有機玻璃板通過丙酮有機試劑黏結(jié)、熱壓等方式封裝，形成一塊完好的微流控芯片。芯片集成多個電磁閥、水樣、純水、多種顯色劑的流體入口及出口，對于蓋板和底板的流通槽的加工精度要達(dá)到10 μm，才能保證100 μm的尺寸精度。

同時，針對硅酸鹽、磷酸鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽4項參數(shù)本文采用環(huán)流分析-分光光度測定技術(shù)。環(huán)流分析的優(yōu)勢在于，可以針對溶液、試劑進行定量混合稀釋，提高測量的精度。通過泵閥切換將海水和指示劑分別抽取到定量環(huán)中，再將充滿海水樣品和指示劑的兩個定量環(huán)連接起來形成閉合環(huán)路實現(xiàn)樣品和試劑以指定的比例混合進行反應(yīng)；待反應(yīng)充分后，開啟對應(yīng)窄帶波長LED，光電二極管會檢測到在十字型流通池中混合指示劑的水樣吸光度；最后通過光纖耦合和濾光片濾光的方式實現(xiàn)多波長檢測，光路設(shè)計上采用三進二出的光纖耦合裝置，將每一路光路分為兩路，其中一路作為主信號，另一路作為參比信號以此消除入射光不穩(wěn)定的影響，其他2路利用測得的吸光度的數(shù)據(jù)計算得到每項營養(yǎng)鹽參數(shù)［18-19］。微流控體系流程控制的原理如圖2所示。

圖2 微流控芯片環(huán)流分析原理

2.2.2 光電檢測及控制體系的設(shè)計

電路系統(tǒng)采用模塊化設(shè)計，包括電源模塊，核心模塊，控制模塊，光源輸出模塊，微光信號采集模塊，數(shù)據(jù)存儲模塊，通信模塊。電路系統(tǒng)的設(shè)計框圖如圖3所示。

為保證最終傳感器可以長期在水下工作，體系采用12 V電池電源供電，經(jīng)電源管理模塊穩(wěn)壓處理及分壓后供給其他功能模塊。核心處理器選用32 bit ARM芯片作為MCU主控單元，控制泵、閥、光源按照固定的流程時序運行，同時負(fù)責(zé)信號的采處理。

控制模塊主要實現(xiàn)對微型蠕動泵及三通閥組的控制，根據(jù)設(shè)計原理依據(jù)設(shè)定的時序進程混合試劑與水樣，或切換流路。

光源輸出模塊主要實現(xiàn)對LED光源的控制，通過LED專用恒流基準(zhǔn)源提供恒定電流激勵LED光源發(fā)光，并采用光路耦合器將三路光耦合為二路光，通過粗細(xì)不同的兩根光纖將光信號傳導(dǎo)至光電二極管。

微光信號采集模塊通過對前置光電二極管采集到的微弱電壓信號進行前置濾波、可編程放大及16 bit AD轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，進而在MCU中進一步數(shù)據(jù)平滑濾波處理。處理后的數(shù)據(jù)按照固定加密格式存儲于片上Flash中，并可以通過RS232串口格式傳輸至上位機。

圖3 電路設(shè)計原理

2.3 信號準(zhǔn)確度保障的相關(guān)研究

2.3.1 信號處理電路的設(shè)計

為了提高對檢測信號采集的準(zhǔn)確性，本文在微光信號采集模塊中優(yōu)選設(shè)計鎖相放大電路、可編程增益放大器和四階濾波電路A/D轉(zhuǎn)換器，原理如圖4所示。光電二極管檢測到通過諧振器提供的1 kHz固定頻率LED光信號，經(jīng)由同頻率的鎖相放大器進行信號識別和波形整形處理后，輸出至可編程增益放大器PGA進行二階信號放大處理［20］。

放大后的信號必然會混入一些白噪聲，因此需要增加四階帶通濾波器進行信號濾波［21］。傳輸至16 bit精度A/D轉(zhuǎn)換器將模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號后，發(fā)送至MCU。為了提高轉(zhuǎn)換精度，A/D轉(zhuǎn)換器優(yōu)選采用16 bit A/D轉(zhuǎn)換器，以轉(zhuǎn)換生成16 bit數(shù)字信號輸出至主處理器MCU作進一步數(shù)據(jù)平滑濾波處理。

圖4 電路設(shè)計原理

對于硬件信號處理后的數(shù)據(jù)，主處理器MCU按照固定的加密格式存儲于微光信號檢測裝置中的存儲模塊中，例如可以通過主處理器MCU的SPI接口經(jīng)由鎖存電路寫入FLASH存儲器中，以便于主處理器MCU后續(xù)濾波處理；同時MCU可以通過通信模塊上傳至上位機，進行長期數(shù)據(jù)監(jiān)控分析。

2.3.2 低通濾波算法的設(shè)計

眾所周知，所有的濾波算法無法完美地兼顧靈敏度和平穩(wěn)度，因此只能尋找一個平衡，在可接受的靈敏度范圍內(nèi)取得盡可能好的平穩(wěn)度［22］。當(dāng)數(shù)據(jù)快速變化時，濾波結(jié)果能及時跟進（靈敏度優(yōu)先）；而當(dāng)數(shù)據(jù)趨于穩(wěn)定，在一個固定的點上下振蕩時，濾波結(jié)果能趨于平穩(wěn)（平穩(wěn)度優(yōu)先）。

為減少MCU的運算量，本文采用一階低通濾波算法，算法公式為：

式中：A表示一階濾波系數(shù)（整型數(shù)據(jù)）；X(n)表示本次采樣值；Y(n-1)表示上次濾波輸出值；Y(n)表示本次濾波輸出值。一階低通濾波算法采用本次采樣值與上次濾波輸出值進行加權(quán)，得到有效濾波值，使得輸出對輸入有反饋作用。

公式對于沒有乘/除法指令的MCU來說，需要用循環(huán)加/減法來實現(xiàn)乘/除法運算。而過多次數(shù)乘/除法運算會增加系統(tǒng)的運算量，影響效率。為了提高MCU的運算速度，需將公式進行簡化?；诖?，提出一種可自動識別的算法，效率提高了一倍。算法如下：

①如果X（n）＜Y（n-1）：

②如果X（n）＜Y（n-1）：

說明：一階濾波系數(shù)A取值范圍0～255；該系數(shù)的大小決定X（n）在本次濾波結(jié)果中所占的權(quán)重，A值按以下動態(tài)調(diào)整算法在程序中可實現(xiàn)自動計算。

動態(tài)調(diào)整算法的流程如圖5所示，其原理如下：①當(dāng)兩次數(shù)據(jù)變化方向不一致時，說明有抖動，將濾波系數(shù)清零，忽略本次新采樣值；②當(dāng)數(shù)據(jù)持續(xù)向一個方向變化時，逐漸提高濾波系數(shù)，提過本次新采樣值的權(quán)；③當(dāng)數(shù)據(jù)變化較快時，要加速提高濾波系數(shù)。

圖5 一階濾波系數(shù)動態(tài)調(diào)整算法流程

3 海試試驗數(shù)據(jù)分析

將海水營養(yǎng)鹽原位分析系統(tǒng)放置于岸邊浮標(biāo)長期監(jiān)測營養(yǎng)鹽數(shù)據(jù)，并通過統(tǒng)計分析對海水營養(yǎng)鹽趨勢變化進行性能評價，實驗結(jié)果將與岸邊實驗室的比測數(shù)據(jù)進行對比，比對方法如下：在浮標(biāo)上對海水營養(yǎng)鹽原位傳感器的實時數(shù)據(jù)進行采集及記錄，并采集相對應(yīng)時間的水樣，在實驗室依據(jù)國標(biāo)GB 17378.42007規(guī)定的檢測方法，利用比測設(shè)備對水樣進行測試，將所得數(shù)據(jù)與海水營養(yǎng)鹽原位傳感器同一個時次的數(shù)據(jù)進行比對，計算其差值，考察數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，比測時長1個月，每日9：00比測一次，15：00比測一次，共計60次。比對分析方法如表1所示。

表1 海水營養(yǎng)鹽原位比對分析方法

比測結(jié)束后，將浮標(biāo)在線監(jiān)測系統(tǒng)原始數(shù)據(jù)與實驗室檢測數(shù)據(jù)進行比較，繪制趨勢圖如圖6所示，圖6中縱坐標(biāo)單位為“μg/L”，橫坐標(biāo)單位為“次”，M線為原位監(jiān)測系統(tǒng)測得的實時數(shù)據(jù)，L線為實驗室檢測數(shù)據(jù)。通過觀察曲線圖譜，可得出如下結(jié)論：①硅酸鹽：兩者數(shù)據(jù)吻合度一般，兩者趨勢基本一致，數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定；②磷酸鹽：兩者數(shù)據(jù)趨勢基本吻合，但數(shù)據(jù)波動略大，兩者變化趨勢相對一致；③亞硝酸鹽：兩者數(shù)據(jù)較為吻合，變化趨勢相對一致；④硝酸鹽：兩者數(shù)據(jù)基本吻合，變化趨勢基本一致；⑤氨氮：兩者數(shù)據(jù)較為吻合，變化趨勢基本一致。

圖6 一個月周期比對數(shù)據(jù)圖

4 結(jié)語

本文對于海水營養(yǎng)鹽原位分析提出一種新的方法，能實時反映海洋環(huán)境的綜合影響，彌補了現(xiàn)有在線監(jiān)測方法的不足，符合中國海域環(huán)境監(jiān)測的實際需求，有助于更加全面、客觀、及時地掌握海洋環(huán)境的動態(tài)變化特征。通過比對實驗的數(shù)據(jù)證明，采用微流控技術(shù)的海水原位營養(yǎng)鹽分析方法是一種可靠、穩(wěn)定的方案，尤其適用于浮標(biāo)體系的長期監(jiān)測，可以實現(xiàn)對海洋環(huán)境進行連續(xù)監(jiān)測以及對近岸海洋環(huán)境污染的預(yù)警，為海洋環(huán)境的監(jiān)管以及污染防治提供全面可靠地依據(jù)。

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馬 然（1982-），男，山東省科學(xué)院海洋儀器儀表研究所，碩士學(xué)位，助理研究員，主要從事海洋環(huán)境監(jiān)測技術(shù)研究，mr47@sohu.com。

The Research of Nutrients in Situ Analysis Method Based on Microfluidic Technology*

MA Ran1，2，CAO Xuan1，2，LIU Yan1，2，ZHANG Shuwei1，2，WANG Xiaohong1，2，ZHANG Tianpeng1，2
（1.Institute of Oceanographic Instrument，Shandong Academy of Science，Qingdao Shandong 266001，China；2.Shandong Ocean Environment Monitoring Technology Key Laboratory，Qingdao Shandong 266001，China）

The existing domestic nutrient monitoring method mainly adopts the shore on-line monitoring or field sampling&laboratory analysis，it can't realize the in situ monitoring for a long time.Therefore the domestic equip?ment are failed to reflect the nutrient parameters trend of change of distant sea.To this end，this paper proposes a miniature laboratory methods can be used for nutrient parameters monitoring in situ.Using microfluidic technology &photoelectric detection technology，according to the signal phase lock amplifying principle，real-time analysing water absorbance，finally realized the in-situ monitoring of nutrient.The long-term comparing results of sea trial da?ta and laboratory data prove the feasibility of this method.The implementation of the monitoring method put forward by this paper has very important significance for eutrophic ecological disaster early warning about the ocean，which also provides technical support to protect the health of the marine ecological environment.

the marine environment monitoring；nutrients in-situ analysis；microfluidic technology；phase-locked amplifier；absorbance

TP391.8；X853

A

1004-1699（2016）11-1659-07

EEACC：7230 10.3969/j.issn.1004-1699.2016.11.006

項目來源：國家自然科學(xué)基金資質(zhì)項目（41206076）；山東省自然科學(xué)基金資質(zhì)項目（ZR2014YL006）；青島市戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)培育計劃項目（14-9-1-2-hy）

2016-05-25 修改日期：2016-07-06