楊立峰 顏林 柯軍 曹穗蘭 田勝慧 國家食品藥品監(jiān)督管理局廣州醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗中心 （廣州 510080）

納米銀材料溶血試驗研究

楊立峰 顏林 柯軍 曹穗蘭 田勝慧 國家食品藥品監(jiān)督管理局廣州醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗中心 （廣州 510080）

目的：檢測并比較不同濃度納米銀的溶血率，得出納米銀濃度與溶血率的關系。方法：依次制備20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL五個不同梯度濃度的納米銀顆粒溶液，參照GB/T14233.2的方法進行溶血試驗，同時選擇兩種市面上的納米銀抗菌敷料進行溶血試驗。結論：納米銀濃度越高其溶血率越大，濃度為2.5μg/mL以上的納米銀溶液溶血率均大于5%，兩種納米銀抗菌敷料的溶血率也均大于5%。

納米銀 溶血試驗 溶血率

0.引言

納米銀因其具有光譜的抗菌作用，被廣泛的應用于醫(yī)療領域。但最近研究者發(fā)現(xiàn)納米材料因其特有的尺寸小、比表面積大及活性強的特點對人體具有一定的細胞毒性、遺傳毒性和生殖毒性[1]，并且在體內可以蓄積到重要的臟器器官并引起毒性反應[2～3]。關于納米銀材料的溶血性能目前還沒有相關文獻報道，因此，本文采用不同濃度的納米銀顆粒和已在市面上銷售的納米銀抗菌敷料分別進行了溶血試驗。

1.材料

1.1 試驗樣品：納米銀顆粒溶液（2000μg/mL）、

納米銀抗菌敷料A、納米銀抗菌敷料B。

1.2 試劑耗材：草酸鉀溶液（2%），離心管（15mL），移液槍（eppendorf）。

1.3 設備：可見紫外分光光度計、離心機、恒溫水浴箱。

1.4 實驗動物：新西蘭大白兔，2.5kg，來源：廣東省醫(yī)學實驗動物中心，合格證號：合格證書：SCXK(粵）2014-0035（44411600002078）。

2.方法

2.1 樣品和對照品制備

2.1.1 納米銀溶液制備

將2000μg/mL納米銀顆粒溶液依次稀釋為20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/ mL五個不同濃度的納米銀顆粒溶液，將上述溶液分別加入15mL離心管內，每管10mL，每個濃度各制備3管。

2.1.2 納米銀抗菌敷料制備

參照GB/T 16886.12-2005標準，將納米銀抗菌敷料按3cm2/mL比例進行浸提[4]，即取30cm2敷料（包括納米銀部分）加入到離心管內，再加入10mL生理鹽水，納米銀抗菌敷料A和敷料B各制備3管。

2.1.3 對照品制備

離心管內加入10mL生理鹽水作為陰性對照，離心管內加入10mL蒸餾水作為陽性對照，陰性對照和陽性對照各制備3管。

2.2 稀釋抗凝兔血制備

心臟采取家兔血液4mL（2%草酸鉀溶液1:9抗凝），與5mL生理鹽水稀釋混勻。

2.3 試驗步驟

將樣品管，陰性對照管和陽性對照管放入水浴箱內37°C水浴30min，向各管內分別加入0.2mL稀釋抗凝兔血，繼續(xù)在恒溫水浴箱內37°C水浴60min，水浴結束后取出試管，放入離心機內800g離心5min，觀察試管內上清液的顏色變化，吸取上清液，用紫外分光光度計在545nm處讀取吸光度值。試驗前先測量樣品本底的吸光度值。

3.結果

3.1 肉眼觀察

圖1為各濃度納米銀溶液的本地顏色，圖2為各濃度納米銀溶液的溶血情況，可見納米銀濃度越高其溶血越嚴重。

3.2 溶血率

溶血率計算公式如下：

圖1. 納米銀溶液本底顏色

圖2. 納米銀溶液的溶血情況

表1. 溶血率

圖3. 納米銀溶血率（%）

式中：A為樣品組平均吸光度值；A0為樣品吸光度本底值；B為陰性對照組平均吸光度值；C為陽性對照組平均吸光度值。

各組的溶血率見表1，納米銀濃度與溶血率關系見圖3，納米銀濃度越高其溶血率越大，2.5μg/ mL即以上濃度的納米銀溶液溶血率均大于5%，敷料A和敷料B的溶血率也遠大于5%，按照GB/T14233.2標準規(guī)定，溶血率大于5%則一般認為不合格[5]。

4.討論

溶血試驗主要是用于檢測材料所導致的紅細胞膜破壞，從而使細胞內的血紅蛋白釋放到血漿中。本研究表明納米銀對紅細胞具有很強的破壞作用，且溶血程度與納米銀的濃度呈正相關。對于與循環(huán)血液直接接觸的納米銀醫(yī)療器械需要進行溶血試驗，而對于非與循環(huán)血液接觸的納米銀醫(yī)療器械是否有必要進行溶血試驗呢，有研究表明納米銀與組織接觸后可以通過生物屏障進入血液循環(huán)系統(tǒng)[6]，從而被運輸?shù)饺砀鱾€臟器組織。如納米銀抗菌敷料，納米銀既可以通過傷口進入血液循環(huán)系統(tǒng)，也可以通過組織細胞的吞噬吸收進入到循環(huán)系統(tǒng)，因此有必要對這類產品進行溶血試驗。

有文獻報道當納米銀濃度達到25μg/mL及以上時具有明顯的體外細胞毒性[7]，本試驗結果顯示，納米銀濃度為2.5μg/mL時其溶血率已超過5%，GB/T14233.2標準規(guī)定溶血率的可接受范圍為＜5%，由此可見對于納米銀材料其溶血試驗較細胞毒性試驗更為靈敏。納米銀的毒性除與濃度相關外還與粒徑相關，粒徑越小其毒性越大。

本試驗選擇了已在臨床上使用的兩種納米銀抗菌敷料進行了溶血試驗，結果顯示溶血率均遠大于5%，不符合GB/T14233.2標準的規(guī)定，但在臨床上并未發(fā)生不良反應，有可能是因為應用部位納米銀濃度高但實際進入到循環(huán)血液中的納米銀濃度比較低。關于納米銀的局部使用濃度與進入到循環(huán)血液量的關系有待進一步研究。

近年來，學者們對納米材料的生物安全性做了大量研究，并且已深入到了基因和分子生物學水平，發(fā)現(xiàn)納米材料確實存在著一定的毒性，這也引起了政府監(jiān)管部門對納米材料的高度重視，并加強了對這類產品的監(jiān)管控制，但是這類產品在臨床上確實起到了很好的效果，是傳統(tǒng)醫(yī)療器械無法替代的。因此，我們對于納米醫(yī)療器械的監(jiān)管不應采取一刀切的模式，對于只應用于體表的納米醫(yī)療器械應放寬監(jiān)管，對于應用于體內組織及器官的納米醫(yī)療器械應加強監(jiān)管，并建立適合于納米材料的生物學評價和試驗方法。

[1] 于永生，施暢，徐麗明，等，納米銀對中國倉鼠肺成纖維細胞的細胞毒性和遺傳毒性[J]. 癌變·畸變·突變，2014，26（6）: 428-433.

[2] 陳丹丹，奚廷斐，白凈，等，納米銀和微米銀在大鼠組織器官中的分布[J]. 北京生物醫(yī)學工程，2007,26（6）：607-608,611.

[3] 姍姍，薛玉英，唐 萌，等，納米銀在小鼠體內的組織分布[J]. 東南大學學報(自然科學版), 2012,42(2):388-392.

[4] GB/T 16886.12-2005 醫(yī)療器械生物學評價第12部分：樣品制備與參照樣品[S].

[5] GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學試驗方法[S].

[6] Loeschner K，Hadrup N，Qvortrup K，et a1.Distribution of silver in rats following 28 days of repeated oral exposure to silver nanoparticles or silver acetate [J].Particle and Fibre Toxicology,2011,8(1):18—31.

[7] 熊 玲,蔣學華,陳 亮,等，不同粒徑銀粒子的體外細胞毒性比較[J],中國生物醫(yī)學工程學報，2007，26（4）：600-604.

Hemolysis Test of Nano Silver

YANG Li-feng YAN Lin KE Jun CAO Sui-lan TIAN Sheng-hui Guangzhou Medical Instruments Quality Surveillance and Inspection Center of State Food and Drug Administration (Guangzhou 510080)

Objective: To test and compare the different concentration of hemolysis rate of silver nanoparticles, Obtained the relationship between the concentration of nano silver and the hemolysis rate was. Methods: Prepared 20μg/mL, 10μg/mL, 5μg/mL, 2.5μg/mL, 1.25μg/mL five different concentration of silver nanoparticles solution, The method reference to GB/T14233.2. In addition, two kinds of nano silver antimicrobial dressing on the market were selected to carry out hemolysis test. Conclusion: The higher the concentration of nano silver, the greater the hemolysis rate. The nano silver solution was more than 2.5 g/mL, and the hemolysis rate was more than 5%. The hemolysis rate of two kinds of nano silver antimicrobial dressing was greater than 5%.

nano silver, Hemolysis test, hemolysis rate

1006-6586(2016)07-0050-03

R318.08

A

2016-03-18

楊立峰，工程師；顏林，高級工程師，副所長；柯軍，工程師，室主任；曹穗蘭，助理工程師；田勝慧，工程師。

廣東省科技廳資助項目，廣東省醫(yī)療產品生物安全評價科技服務平臺（2012B011000003）