凌海燕，湯 燕，朱 寧，楊 軍，文 筱，楊安東（四川省中醫(yī)藥科學院，成都 610041）

HPLC-Q-TOF-MS/MS法檢測降壓類中成藥中非法添加的24種化學物質(zhì)Δ

凌海燕＊，湯 燕，朱 寧，楊 軍，文 筱，楊安東#（四川省中醫(yī)藥科學院，成都 610041）

目的：建立檢測降壓類中成藥中非法添加的24種化學物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜條件：色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18，流動相為0.05%甲酸溶液-甲醇（梯度洗脫），流速為0.3 ml/min，柱溫為30℃，進樣量為5 μl。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源，毛細管電壓為4.0 kV，毛細管出口電壓為135 V，錐孔電壓為65 V，脫溶劑溫度為350℃，干燥氣流速為10 L/min，霧化器壓力為40 psi，碰撞能量為8～45 V，掃描范圍為m/z 100～1 700，檢測方式為正離子模式（ESI+）。結(jié)果：卡托普利、硝苯地平、氫氯噻嗪、鹽酸可樂定、利血平檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.0～32 μg/L，苯磺酸氨氯地平、非洛地平、纈沙坦、拉西地平、坎地沙坦酯檢測質(zhì)量濃度線性范圍為3.0～48 μg/L，其余14種化學物質(zhì)檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.5～40 μg/L（r≥0.995 9）；定量限≤2.944 1 ng，檢測限≤0.988 5 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD≤5.1%；回收率為81.5%～115.5%（RSD＝1.81%～4.86%，n＝9）。結(jié)論：該方法專屬性強、靈敏度高、簡便快捷，適用于降壓類中成藥中非法添加化學物質(zhì)的檢測。

高效液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法；降壓類中成藥；化學物質(zhì)；非法添加

由于我國高血壓患病率逐年攀升，使得治療高血壓的藥物幾乎成為每個家庭的必備藥。不少患者傾向于選擇毒副作用小的中藥復方制劑，不法分子利用這種心理，在降壓中成藥中非法摻入療效確切、價廉的降壓化學物質(zhì)，服用者雖可收到立竿見影的效果，但會造成化學藥品用法用量的無法控制、重復用藥，對患者身體帶來極大損害。由于中成藥成分和生產(chǎn)工藝的復雜性，不可能與化學物質(zhì)同時進行全程檢測，所以添加的化學物質(zhì)不易被識別，具有隱蔽性。目前，用于檢測中成藥中非法添加化學物質(zhì)的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1-3]等，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，高分辨質(zhì)譜越來越受到人們的關(guān)注，與串聯(lián)四級桿質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜具有掃描速度快、分辨率高等優(yōu)點[4-5]。

本試驗建立的HPLC-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（Q-TOF-MS/ MS）具有高靈敏度、高選擇性的特點，可以獲得高質(zhì)量質(zhì)譜圖和化學物質(zhì)精確分子質(zhì)量，操作簡便、快速、準確，結(jié)果可靠。

1 材料

1.1 儀器

LC-Q-TOF聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

試驗所用樣品均為市售降壓類丸劑、片劑、膠囊劑中成藥（編號：1～12）；卡托普利對照品（批號：100318-201103）、氯沙坦鉀對照品（批號：100597-201102）、纈沙坦對照品（批號：100651-201203）、替米沙坦對照品（批號：100629-201202）、坎地沙坦酯對照品（批號：100685-200401）、奧美沙坦酯對照品（批號：100864-201302）、酒石酸美托洛爾對照品（批號：100084-201102）、阿替洛爾對照品（批號：100117-201105）、富馬酸比索洛爾對照品（批號：100711-200401）、鹽酸普萘洛爾對照品（批號：100783-201202）、尼莫地平對照品（批號：100270-200002）、尼群地平對照品（批號：100585-201104）、苯磺酸氨氯地平對照品（批號：100374-201204）、硝苯地平對照品（批號：100338-201404）、拉西地平對照品（批號：100741-200802）、鹽 酸 尼 卡 地 平 對 照 品（批 號 ：100586-201102）、非洛地平對照品（批號：100717-201403）、甲磺酸多沙唑嗪對照品（批號：100566-200401）、鹽酸肼屈嗪對照品（批號：100263-200301）、氫氯噻嗪對照品（批號：100309-201404）、鹽酸可樂定對照品（批號：100071-201106）、利血平對照品（批號：100041-201213）、吲達帕胺對照品（批號：100257-201204）、鹽酸哌唑嗪（批號：100147-201206）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水（18.25 mΩ/cm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：0.05%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0 min，10%B；0～5 min，10%→60%B；5～15 min，60%→95%B；15～20 min，95%B；20～25 min，10%B）；流速：0.3 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：5 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離（ESI）源；毛細管電壓：4.0 kV；毛細管出口電壓：135 V；錐孔電壓：65 V；脫溶劑溫度：350℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化器壓力：40 psi；碰撞能量：8～45 V；掃描范圍：100～1 700 m/z；檢測方式：正離子模式（ESI+）。在ESI+模式下，各化學物質(zhì)有較好的分離度，并且24種化學物質(zhì)在20 min內(nèi)出峰，檢測時間較短，在進行非法添加篩查時可以大大提高效率?？傠x子流見圖1。

圖1 總離子流圖Fig 1 Total ion chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別取坎地沙坦酯、卡托普利、氯沙坦鉀、奧美沙坦酯、尼群地平、替米沙坦、纈沙坦、阿替洛爾、非洛地平、酒石酸美托洛爾、鹽酸普萘洛爾、硝苯地平、尼莫地平、鹽酸可樂定、苯磺酸氨氯地平、利血平、拉西地平、鹽酸哌唑嗪、鹽酸尼卡地平、吲達帕胺、甲磺酸多沙唑嗪、氫氯噻嗪、鹽酸肼屈嗪、富馬酸比索洛爾對照品10.05、9.97、9.52、10.23、10.12、10.54、10.09、9.14、9.69、10.48、9.89、10.20、10.27、9.60、10.17、10.15、9.62、9.24、9.77、9.62、9.19、10.23、10.32、10.16 mg，精密稱定，分別置于25 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為單一對照品貯備液。精密量取上述單一對照品貯備液1 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取片劑或丸劑樣品研細，混勻，或取膠囊劑，取出內(nèi)容物連同膠囊殼細致研磨粉碎，取一次口服劑量，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取濾液1.00 ml，置于10 ml量瓶中，加0.05%甲酸-甲醇（90∶10，V/V）定容，作為供試品溶液。

2.2.3 空白樣品溶液 缺樣品，按“2.2.2”項下方法制備空白樣品溶液。

2.3 24種化學物質(zhì)的標準譜庫信息

建立24種化學物質(zhì)的分子式、精確質(zhì)量數(shù)、二級特征碎片離子以及保留時間等信息數(shù)據(jù)庫（見表1），通過分析軟件分別對待測成分的一級和二級質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫中質(zhì)譜圖進行比對，同時結(jié)合保留時間進行進一步實證。

表1 標準譜庫信息Tab 1 Information of standard reference library

續(xù)表1Continued tab 1

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 ml，分別置于50 ml量瓶中，加0.05%甲酸-甲醇（90∶10，V/V）定容，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各5 μl，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，詳見表2。結(jié)果表明，卡托普利、硝苯地平、氫氯噻嗪、鹽酸可樂定、利血平檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.0～32 μg/L；苯磺酸氨氯地平、非洛地平、纈沙坦、拉西地平、坎地沙坦酯檢測質(zhì)量濃度線性范圍為3.0～48 μg/L；其余14種化學物質(zhì)檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.5～40 μg/L。

表2 回歸方程與定量限、檢測限Tab 2 Regression equations，limits of detection and limits of quantification

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得定量限；當信噪比為3∶1時，得檢測限，詳見表2。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，24種化學物質(zhì)峰面積的RSD＝2.6%～4.9%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：6）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、18、24 h時按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，24種化學物質(zhì)峰面積的RSD＝2.3%～5.1%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（編號：6）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄氫氯噻嗪峰面積。結(jié)果，氫氯噻嗪的添加量為3.50 g/kg，RSD＝4.0%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 回收率試驗

取空白樣品適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

續(xù)表3Continued tab 3

2.10 樣品中化學物質(zhì)的測定

取12種市售降壓中成藥各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣檢測，若檢出，則計算化學物質(zhì)含量，結(jié)果見表4。

3 討論

國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的補充批件（編號2009032）[6]僅對降壓中成藥中的7種降壓類化學物質(zhì)（阿替洛爾、鹽酸可樂定、氫氯噻嗪、卡托普利、哌唑嗪、利血平、硝苯地平）進行篩查和驗證，篩查的對象遠遠少于本研究所選擇的24種化學物質(zhì)，故本研究方法的適用范圍更廣。這24種化學物質(zhì)極性差別大，要在同一個色譜系統(tǒng)中實現(xiàn)色譜分離需要較長時間，且有部分成分的色譜保留行為相似，分離度較差，例如尼莫地平、尼群地平、硝苯地平、非洛地平、苯磺酸氨氯地平等。因此，采用EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）填料的色譜柱，建立的HPLC-Q-TOF-MS/MS法測定降壓中成藥中非法添加的化學物質(zhì)的定性定量檢驗方法，能夠在20 min內(nèi)完成24種降壓類化學物質(zhì)的有效分析，并排除了中成藥中復雜成分的干擾，且從保留時間、一級及二級質(zhì)譜的一致性等方面保證了定性定量的準確，簡便和高靈敏度。在缺乏對照品的情況下，可以將未知樣品的特征譜圖與譜庫信息進行匹配，以此實現(xiàn)短時間內(nèi)對未知成分進行初步篩查和確認的目的。這是一個開放的系統(tǒng)，可以隨時增加新的化學物質(zhì)，只要將相應的數(shù)據(jù)錄入質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，便可進行日常檢驗篩查，為用藥安全提供技術(shù)支持。

表4 樣品中非法添加化學物質(zhì)檢測結(jié)果（n＝3）Tab 4 Detection results of the chemical substances that illegally added in samples（n＝3）

[1] 陳惠玲，封令霞.HPLC檢測中藥中非法添加化學降壓藥物[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2011，28（13）：1 346.

[2] 陳海濱，吳春敏.降壓類中成藥非法添加化學藥物研究近況[J].海峽藥學，2010，22（10）：1.

[3]李濤，朱小紅，林芳.GC-MS聯(lián)用方法檢測降壓類中成藥及保健食品中非法添加的化學藥物[J].藥物分析雜志，2010，30（11）：2 212.

[4] 吳寧鵬，班付國，彭麗，等.超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜法篩查飼料中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物[J].質(zhì)譜學報，2012，33（2）：94.

[5] 謝寒冰，周明瑩，趙海峰，等.高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜法同時檢測豆芽中的3種外源植物激素殘留

[J].色譜，2014，32（5）：493.

[6] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件[S].2009.

Detecion of 24 Chemical Substances that Illegally Added into Antihypertensive Traditional Chinese Patent Medicines by HPLC-Q-TOF-MS/MS

LING Haiyan，TANG Yan，ZHU Ning，YANG Jun，WEN Xiao，YANG Andong（Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the detection of 24 chemical substances that illegally added into antihypertensive traditional Chinese medicines.METHODS：HPLC-Q-TOF-MS/MS was adopted.The chromatographic conditions were as follows，the column was Agilent Poroshell 120 EC-C18with mobile phase of 0.05%formic acid-methanol（gradient elution）at a flow rate of 0.3 ml/min，column temperature was 30℃，injection volume was 5 μl.MS conditions were as follows，ion sou-rce was an electrospray ionization source，capillary voltage was 4.0 kV，capillary exit voltage was 135 V，cone voltage was 65 V，desolvation temperature was 350℃，drying gas flow rate was 10 L/min，nebulizer pressure was 40 psi，collision energy was 8-45 V；scanning range was m/z 100-1 700；and detection method was positive ion mode（ESI+）.RESULTS：The linear range was 2.0-32 μg/L for captopril nifedipine，hydrochlorothiazide，clonidine hydrochloride，reserpine，3.0-48 μg/L for amlodipine besylate，felodipine，valsartan，lacidipine，candesartan cilexetil and 2.5-40 μg/L for the other 14 chemical substances（r≥0.995 9）；limit of quantification was not higher than 2.944 1 ng，the limit of detection was not higher than 0.988 5 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no higher than 5.1%；recoveries were 81.5%-115.5%（RSD were 1.81%-4.86%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is specific，sensitive，simple and rapid，and suitable for the detection of chemical substances that illegally added into antihypertensive traditional Chinese medicines.

HPLC-Q-TOF-MS/MS；Antihypertensive traditional Chinese patent medicine；Chemical substances；Illegal added

R917

A

1001-0408（2016）33-4712-04

2016-03-28

2016-07-14）

（編輯：張 靜）

四川省公益性科研院所基本科研項目（No.A-2015N-7）

＊助理研究員，碩士。研究方向：中藥及天然產(chǎn)物新產(chǎn)品開發(fā)。電話：028-85257327。E-mail：hyan1012@126.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：中藥及天然產(chǎn)物新產(chǎn)品開發(fā)、中藥質(zhì)量標準和中藥材綜合應用與成套技術(shù)開發(fā)。E-mail：ady-05@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.35